Yöntem makalesi

İnsan Primer Cilt Fibroblastlarına Dayalı Huntington Hastalık Modelinde Mikrotübül Artı-Uç Dinamikleri Görselleştirmesi

2.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62963

⸱

8 Ocak 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1A.N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 2Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 3Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency, 4Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, birincil hücre kültüründeki dinamik özelliklerini incelemek için EB3 protein transfeksiyonu ile mikrotübül artı-uç görselleştirmesine adanmıştır. Protokol, Huntington hastalığı hastalarından elde edilen insan primer deri fibroblastları üzerinde uygulandı.

Özet

Zaman atlamalı video mikroskopisi ile birlikte ilgi çekici floresan etiketli bir işaret proteini ile transfection, sitoskeletonun dinamik özelliklerini incelemek için klasik bir yöntemdir. Bu protokol, birincil hücre ekim koşullarının özellikleri nedeniyle zor olabilen insan primer fibroblast transfeksiyonu için bir teknik sunmaktadır. Ek olarak, sitoskeleton dinamik özellik bakımı, mikrotübül stabilizasyonuna neden olmadan iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için düşük düzeyde transfeksiyon gerektirir. Hücreleri ışık kaynaklı stresten ve floresan boya solmasından korumak için önlemler almak önemlidir. Çalışmalarımız boyunca, insan birincil fibroblast çalışmalarına uygun koşulların en iyi kombinasyonunu seçmek için farklı transfeksiyon yöntemlerini ve protokollerini ve farklı vektörleri test ettik. Ortaya çıkan hızlandırılmış videoları analiz ettik ve ImageJ kullanarak mikrotübül dinamiklerini hesapladık. Mikrotübüllerin farklı hücre parçalarındaki artı uçlarının dinamikleri benzer değildir, bu nedenle analizi alt gruplara ayırdık - merkezkant bölge, lamel ve fibroblastların kuyruğu. Özellikle, bu protokol hasta örneklerinde sitoskeleton dinamiklerinin in vitro analizi için kullanılabilir ve çeşitli hastalık gelişiminin dinamiklerini anlamaya yönelik bir sonraki adımı sağlar.

Giriş

Huntington hastalığı (HD), mutasyonin gen kodlamasıhuntingtin proteini (HTT) nedeniyle tedavi edilemez bir nörodejeneratif patolojidir. HTT öncelikle veziklinler ve mikrotübüllerle ilişkilidir ve muhtemelen mikrotübül bağımlı taşıma süreçlerinde yer almaktadır1,2. Mutant HTT'nin mikrotübül dinamikleri üzerindeki etkisini incelemek için, büyüyen artı uçları bağlayarak ve stabilize ederek mikrotübüllerin dinamik özelliklerini düzenleyen EB3 proteininin in vitro görselleştirmesini kullandık. Floresan etiketli EB3'ü insan derisi fibroblastlarına yüklemek için plazmid transfeksiyon uygulandı. Bu çalışma için HD hastalarının cilt biyopsisinden elde edilen primer fibroblast kültürünü kullandık.

HTT protein geninde mutasyon poliglutamin sisteminin uzaması3. HTT, endositoz4,hücre taşıma1,2,protein bozulması5,vb. Bu süreçlerin önemli bir kısmı, mikrotübüller de dahil olmak üzere hücre sitoskeletonunun çeşitli unsurlarını içerir.

İnsan birincil hücreleri, hasta hücrelerinde meydana gelen olayları mümkün olduğunca yakından yeniden üretmek için en iyi modeldir. Bu tür modeller oluşturmak için, hücreleri insan biyopsi malzemesinden (örneğin cerrahi örneklerden) izole etmek gerekir. Ortaya çıkan primer hücre hattı, çeşitli genetik, biyokimyasal, moleküler ve hücre biyolojisi yöntemlerini kullanarak patogenez çalışmak için uygundur. Ayrıca, insan birincil hücre kültürleri çeşitli transdifferentiated ve transgenik kültürler oluşturmak için bir öncü olarak hizmet vermektedir6.

Bununla birlikte, ölümsüzleştirilmiş hücre kültürlerinin aksine, birincil hücrelerin önemli dezavantajı sınırlı geçiş kapasiteleridir. Bu nedenle, hücreleri erken geçiş aşamasında (15'e kadar) kullanmanızı öneririz. Eski kültürler çok hızlı bir şekilde dejenere lanır ve benzersiz özelliklerini kaybeder. Bu nedenle, yeni elde edilen birincil hücreler uzun süreli depolama için dondurulmalıdır.

Birincil hücre kültürleri yetiştirme koşullarına karşı hassastır. Bu nedenle, genellikle benzersiz yaklaşımlar ve büyüme koşullarının optimizasyonu gerektirirler. Özellikle, deneylerimizde kullanılan insan derisi birincil fibroblastları substrat üzerinde talep ediyor. Bu nedenle, deney türüne bağlı olarak çeşitli ek kaplamalar (örneğin jelatin veya fibronektin) kullandık.

Hücre sitoskeleton hücre şeklini, hareketliliğini ve hareketliliğini belirler. Sitoskeletonun dinamikleri hem interfaz hem de mitozda birçok hücre içi süreç için çok önemlidir. Özellikle, tübulinden polimerize edilen sitoskeleton, motor protein aracılı hücre içi taşımayı sağlayan son derece dinamik ve polar yapılardır. Mikrotübüllerin uçları sürekli yeniden düzenlenir, montaj aşamaları sökme aşamalarıyla değişir ve bu davranışa "dinamik kararsızlık"7,8,9denir. Çeşitli ilişkili proteinler polimerizasyon reaksiyonunun dengesini değiştirerek polimer oluşumuna veya protein monomer oluşumuna yol açtı. Tübulin alt ünüllerinin eklenmesi esas olarak mikrotübüllerin artı ucunda meydana gelir10. Son bağlayıcı (EB) protein ailesi üç üyeden oluşur: EB1, EB2 ve EB3. Artı uç izleme proteinleri (+TIP' ler) görevi gösterirler ve büyüyen artı uçlarını bağlayarak ve stabilize ederek mikrotübüllerin dinamik özelliklerinidüzenlerler 11.

Birçok çalışma, mikrotübülleri in vitroolarak görselleştirmek için zaman atlamalı görüntüleme ve video analizi ile floresan molekül etiketli tübulin mikroenjeksiyonu veya transfeksiyonu kullanır. Bu yöntemler istilacı ve hücrelere, özellikle birincil insan hücrelerine zararlı olabilir. En zorlu adım hücre transfeksiyon için koşulları bulmaktır. Canlılığı ve doğal hücre morfolojisini etkilemeden mümkün olan en yüksek transfeksiyon seviyesine ulaşmaya çalıştık. Bu çalışma, sağlıklı donörlerin ve Huntington hastalığı olan hastaların cilt fibroblastlarındaki mikrotübül dinamiklerindeki farklılıkları incelemek için klasik yöntemi uygular.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, Federal Tıbbi Biyolojik Ajansı Fiziksel-Kimyasal Tıp Federal Araştırma ve Klinik Merkezi'nin 08 Eylül 2015 tarihli yönergelerini takip eder.

NOT: Şekil 1 protokole genel bir bakış sağlar.

1. İnsan derisi fibroblastlarının birincil kültürünü elde etmek (Şekil2)

  1. Biyopsiyi Dulbecco'nun Modifiye Eagle Media (DMEM) ortamında 50 μg/mL penisilin ve 50 U/mL streptomisin ile desteklenmiş olarak birkaç saat içinde bir laboratuvara teslim edin.
    NOT: Bir hasta bilgilendirilmiş bir onay verdikten sonra bir doktor tarafından steril koşullarda cilt biyopsisi yapılmalıdır.
  2. Biyopsi dokusunu az miktarda ortamla birlikte 6 cm Petri kabına yerleştirin.
  3. Steril bir neşter kullanarak biyopsi örneğini yaklaşık 0,5-1 mm büyüklüğünde parçalar halinde kesin. Elde edilen 1-2 parçayı 3,5 cm Petri kabına yerleştirin ve biyopsi parçalarının üzerine steril bir kapak parçası yerleştirin. Aşağıdaki bileşime yavaşça 1,5 mL büyüme ortamı ekleyin: DMEM, 50 U/mL penisilin-streptomisidin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS).
  4. Bir CO2 inkübatörü içindeki büyüme ortamındaki kültür fibroblastları% 5 CO2, 37 ° C,% 80 nemde tutulur.
    NOT: 4-7 gün sonra, önce keratinositler, sonra fibroblastlar, dokudan yemeğin dibine göç etmeye başlar.

2. Birincil kültürün depolanmasını, dondurulmasını ve dondurulmasını

  1. Kültür çanaktan hücreleri çıkarın (bkz. noktalar 3.2-3.4).
  2. Hücre süspansiyonu 200 x g'da 5 dakika boyunca 15 mL konik tüpe ve santrifüje aktarın. Daha sonra süpernatantı atın ve hücre peletini 900 μL soğutulmuş FBS'de yeniden diriltin.
  3. Damla damla bir kriyoprezervasyon tüpüne aktarın ve 100 μL dimetil sülfit (DMSO) ekleyin.
  4. Kriyoprobe'u -80 °C'de düşük sıcaklıktaki bir dondurucuya yerleştirin. Yirmi dört saat sonra, uzun süreli depolama için cryovial'ı sıvı nitrojene (−196 °C) aktarın.
  5. Kriyoprezer korunmuş hücrelerin buzunu çıkarmak için, cryovial'ı azot deposundan çıkarın ve 1 dakika içinde, içeriğin 1 mL'lik kısmını önceden 37 °C'ye ısıtılmış taşıma ortamının 9 mL'lik bir kısmını içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın.
  6. Tüpü dikkatlice yeniden dirildi ve ardından 200 x g'da 5 dakika santrifüj edin. Üst tabakayı atın, hücre peletini büyüme ortamının gerekli hacmine yeniden koyun ve gerekli çapta bir Petri kabına yerleştirin.

3. Hücre ekimi

  1. Bulaşık tabanını damıtılmış suda hazırlanan otomatik kapatılmış% 0.1 jelatin çözeltisi ile örtün. 15 dakika kuluçkaya yaslanın.
    NOT: Transfeksiyon görselleştirme için cam tabanlı tabaklar (cam kalınlığı 170 μm olan konfokal yemekler) kullanılmalıdır.
  2. Aşağıdaki bileşime sahip bir kültür ortamı hazırlayın: %10 FBS, 2 mM L-alanil-L-glutamin, 50 U/mL penisilin-streptomisidin ile desteklenmiş DMEM. İyice karıştırın ve 4 °C'de saklayın. Hücrelere eklemeden önce ortamı 37 °C'ye ısıtın.
  3. Kültürü mikroskop altında değerlendirin. Ortamı çıkarın ve fibroblastları Dulbecco'nun fosfat-tuz çözeltisi (DPBS) ile yıkayın.
  4. Hücrelere 1 mL önceden ısıtılmış %0,25 tripsin çözeltisi ekleyin. Mikroskop altındaki hücreleri, alt tabakadan tamamen ayrılırlarsa kontrol edin. Tripini 1 mL kültür ortamı ile devre dışı bırak.
  5. Hücre süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın. Tüpü 200 x g'da 5 dakika santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini kültür ortamının 1 mL'sinde yeniden diriltin.
  6. Hücre sayısını sayın. 8-15 x 103/cm2 yoğunlukta tohumlamak için gerekli hücre sayısını hesaplayın ve kültür ortamının 2 mL'sinde yeniden biriktirin.
  7. Jelatin çözeltisini kültür çanaktan çıkarın ve hemen hücre süspansiyonunun 2 mL'lik kısmını ekleyin. Co2 inkübatörde 37 °C'de fibroblast yetiştirin.
  8. Ortamı her 2-4 günde bir yenileyin.
    NOT: Deneyler için 4-11 pasajın hücrelerini kullanın.

4. Transfection

  1. Transfection öncesi kültür ortamını 24 saat taze bir kültür ortamıyla değiştirin.
    NOT: Hücre birleşmesi %70-80 olmalıdır.
  2. Hücre tohumlama alanına ve yoğunluğuna göre bir DNA lipit kompleksi hazırlayın. Lipozom bazlı transfeksiyon maddesi kullanın.
    NOT: Hücre tohumlama yoğunluğunu 1 x 104 hücre/cm2olarak kullanın.
  3. Tüpün duvarlarına dokunmadan, antibiyotik içermeyen 125 μL optimal minimum esansiyel ortama (Opti-MEM) 3 μL ticari transfeksiyon reaktifi ekleyin. Yavaşça yeniden dirilt.
  4. Plazmid DNA'sını (GFP-EB3) 125 μL Opti-MEM'e 1 μg ekleyerek seyreltin. Yavaşça yeniden dirilt.
    NOT: GFP-EB311'i kodlayan ifade vektörü, Dr. A. Akhmanova'nın (Erasmus Üniversitesi, Rotterdam) izniyle Dr. I. Kaverina'dan (Vanderbilt Üniversitesi, Nashville) nazik bir hediye olarakalınmıştır.
  5. Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin her tüpüne seyreltilmiş plazmid DNA ekleyin (1:1). 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
  6. DNA lipit kompleksini hücre içeren 6 cm Petri kabına ekleyin ve 30 sn boyunca bir haç salınımı ile karıştırın. Hücreleri 24 saat boyunca bir transfeksiyon ajanı ile kuluçkaya yatırın ve sonra taze ortama değiştirin. 24 saat ve 48 saat sonra transfeksiyonun verimliliğini analiz edin.
    NOT: Transfeksiyondan 24 saat sonra verimlilik% 10-15 ve 48 saat sonra% 40'a kadardı.

5. Görüntülemeye hazırlık

  1. Hücrelerin canlı görüntülenmesinden önce, otofluoresansı azaltmak için kültür ortamını pH göstergesi boyası olmayan bir ortama değiştirin.
  2. Orta yüzeyi tamamen örtmek için orta yüzeye mineral yağı dikkatlice uygulayın, O2 penetrasyonunu ve orta buharlaşmayı azaltmak için dış ortamdan izole edin.
  3. Görüntüleri çekmek için yüksek rakamlı diyafram açıklığına sahip bir cıva lambası ve yağ daldırma 60x veya 100x objektif lens kullanın.
    NOT: In vivo gözlemler için mikroskop, nesne tablosunu ve lensi +37 °C'ye ısıtmak, CO2 beslemeli kapalı bir oda ve nem seviyesi desteği de dahil olmak üzere hücreler için gerekli koşulları korumak için bir inkübatör ile donatılmalıdır. Nem oluşturmak için çift damıtılmış su kullanın. Çekimden önce çift damıtılmış su seviyesini kontrol edin.
  4. Konfokal kabı görüntülemeden önce mikroskop tutucusuna hücrelerle yerleştirin. Görüntü çekerken sürüklenmeyi önlemek için çanağın ve kameranın tutucuya güvenli bir şekilde takıldığından emin olun.

6. Görüntüleme parametrelerini ayarlama

  1. Işık hücreye zarar veren reaktif oksijen türlerine (ROS) neden olduğundan düşük pozlama değerlerini seçin.
    NOT: İnsan derisi fibroblastlarındaki mikrotübüllerin dinamiklerini incelemek için 300 ms'lik bir maruziyet seçilmiştir.
  2. İlgi çekici nesneye odaklanın.
    NOT: Uzun süreli zaman atlamalı görüntüleme için, z ekseni boyunca olası bir kaymayı telafi etmek için otomatik odak sabitleme sistemini kullanın.
  3. Hücrelerin ışığa duyarlılığına ve florokrom solma hızına bağlı olarak en uygun görüntüleme koşullarını seçin.
    NOT: Mikrotübüller son derece dinamik yapılar olduğundan, oldukça kısa bir zaman aralığı seçilebilir ve kare hızı yeterince yüksek olmalıdır. Cilt fibroblastlarındaki mikrotübül dinamiklerini araştırmak için 3-5 dakika boyunca 1 kare/s frekansta kullandık.
  4. Görüntüyü almak için bir sonraki nesneyi seçerken, zaten görüntülenmiş alandan uzaklaşın. Bu alan ışığın etkisi altında olduğu için gözle görülür bir fotoğraf ağartma olacaktır.
    NOT: Nispeten yüksek bir görüntüleme frekansı kullanıldığından, deklanşör görüntüler arasında kapanmadı ve lamba tüm görüntüleme süresi boyunca yandı, bu yüzden solgunluk arttı.
  5. Transeksiyon kalitesini, mikrotübüllerin görüntülerinin kalitesini (optimum sinyal-gürültü oranı) ve analiz edilen hücre durumunda sürüklenmenin olmamasını dikkate alarak mikrotübüllerin dinamiklerini görsel olarak incelemek için en uygun videoyu seçin (Şekil 3).
  6. Seçilen videoları ImageJ veya Fiji programında izleyerek mikrotübüllerin artı uç dinamiklerini incelemek için kullanın (Şekil 4).
    NOT: Nicel analiz talimatları için ek şekil 2 ve tamamlayıcı dosya 1 'ebakın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Protokol kullanılarak üretilen GFP-EB3 filmleri (Şekil 1) mikrotübüllerin dinamik özelliklerini göstermektedir. Mikrotübüller farklı hücre süreçlerine dahil olur ve dinamik özellikleri hastaların biyopsi materyalinden birincil insan hücre kültürünün çeşitli yaşam özelliklerini etkiler (Şekil 2).

Aşağıdaki parametreler mikrotübüllerin dinamik kararsızlığını belirler: büyüme (polimerizasyon) ve küçülme (depolimerizasyon) oranları; felak...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mikrotübüllerin dinamik analizi için daha kaliteli sonuçlar yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerden elde edilebilir. Canlı hücrelerin hızlandırılmış görüntülemesi için gerekli tüm koşulları gözlemlemek ve görüntüleme parametrelerini doğru ayarlamak önemlidir. Cam tabanlı özel hücre kültürü yemekleri (konfokal yemekler) kullanmak önemlidir, çünkü cam plastikten farklı bir kırılma indeksine sahiptir. Camın kalınlığı ve tüm alanı üzerindeki homojenliği de son derece önemlidir, çünkü bu parametreler normal numune odaklama ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı tarafından finanse edildi, Hibe No. 075-15-2019-1669 (fibroblastların transfeksiyon), Rusya Bilim Vakfı tarafından hibe 19-15-00425 (fibroblast in vitroekimi ile ilgili diğer tüm çalışmalar). Lomonosov Moskova Devlet Üniversitesi Geliştirme programı PNR5.13 (görüntüleme ve analiz) tarafından kısmen desteklendi. Yazarlar, A. N. Belozersky Fiziko-Kimyasal Biyoloji Enstitüsü'ndeki Nikon Mükemmeliyet Merkezi'nin desteğini kabul ediyor. Seslendirme konusundaki yardımları için Ekaterina Taran'a özel teşekkürlerimizi sunmak istiyoruz. Yazarlar ayrıca Pavel Belikov'a video düzenleme konusundaki yardımları için teşekkür etti. El yazmasındaki figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kamera iXon DU897 EMCCDAndor Teknolojisi
Eppendorf Santrifüj 5804 REppendorf Kurumsal
Floresan filtre seti HYQ FITCNikonAlternatifi: Leica, Olympus, Zeiss
LUNA-II Otomatik Hücre SayımıLogoları BiyosistemlerL40002
Ömür boyu çekim için mikroskop inkübatörüOkolabSıcaklık kontrolörü H301-T-UNIT-BL-PLUS
Gaz kontrol cihazı CO2-O2-UNIT-BL
Objektif lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)NikonAlternatifi: Leica, Olympus, Zeiss
Geniş Alan floresan ışık mikroskobu Eclipse Ti-ENikonAlternatif: Leica, Olympus, Zeiss
Software
Fiji (Image J sürüm 2.1.0/1.53c)Açık kaynaklı görüntü işleme yazılımı
NIS ElementsNikonAlternatifi: Leica, Olympus, Zeiss
Ek reaktifler
Mineral yağ (Hafif beyaz yağ)MP151694
< güçlü > Hücre kültürü kabı< / güçlü >
Hücre Kültürü KabıSPL Lifesciences20035
Konfokal Çanak (cam kalınlığı 170 ve mikro; m)SPL Yaşam Bilimleri211350Alternatif: MatTek
Konik Santrifüj tüpüSPL Yaşam Bilimleri50015
Kriyojenik ŞişelerCorning-Costar430659
Mikrosantrifüj TüpüYuvası615001
lipofektamin 3000 Transfeksiyon ReaktifiThermo Fisher ScientificL3000001
Dimetil sülfoksitPanEkofigure-materials-1135
DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı)PanEkoC420figure-materials-2
DPBS (Dulbecco'nun fosfat-tuz çözeltisi)PanEkoP060figure-materials-3
Fetal sığır serumu (FBS)HycloneK053/SH30071.03
Jelatin (sığır derisi)PanEkofigure-materials-4070
GlutaMAXTermo Balıkçı Bilimsel35050038
Opti-MEM (1x) + GlutamaxGibco519850026
Penisilin-streptomisinPanEkoA063figure-materials-5
Tripsin-EDTA (%0.25)Thermo Fisher Scientific25200072
Transfeksiyon
EB3-GFP'li plazmid DNADr. I. Kaverina'nın [Vanderbilt Üniversitesi, Nashville] nazik hediyesi, Dr. A. Akhmanova
[Erasmus Üniversitesi, Rotterdam]		Stepanova ve ark., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003

Kaynaklar

  1. Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
  2. Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).
  3. MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
  4. Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus. Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).
  5. Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
  6. Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
  7. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  8. Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
  9. Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).
  10. Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
  11. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  12. Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
  13. O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
  14. Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
  15. Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
  16. Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
  17. van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
  18. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  19. Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
  20. Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884(2016).
  21. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
  22. Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikrot b l DinamikleriArt U G rselle tirmensan Deri FibroblastlarFloresan Protein TransfeksiyonuZaman Atlamal MikroskopiH cre skeleti DinamikleriEB3 Proteini G r nt lemeKonfokal MikroskopiImageJ Analizi

İlgili makaleler