Yöntem makalesi

Birincil Hücre Kültürleri için Yenidoğan Fareden Mikroglial Hücrelerin Manyetik İzolasyonu

3.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62964

⸱

25 Temmuz 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48, Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care, APHP-Sorbonne university

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Primer mikroglia kültürleri, yeni anti-enflamatuar molekülleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Mevcut protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntemi tanımlamaktadır.

Özet

Mikroglia, beyinde yerleşik makrofajlar olarak, çevresel strese ve beyin homeostazına yanıt da dahil olmak üzere çeşitli işlevlerin temelidir. Mikroglia, geniş bir aktivasyon fenotipi spektrumunu benimseyebilir. Ayrıca, pro-inflamatuar fenotipi destekleyen mikroglia hem nörogelişimsel hem de nörodejeneratif bozukluklarla ilişkilidir. İn vitro çalışmalar, spesifik hücre tiplerinde potansiyel terapötik stratejileri değerlendirmek için araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu bağlamda, primer mikroglial kültürleri kullanarak in vitro mikroglial aktivasyon ve nöroinflamasyonu incelemek, mikroglial hücre hatlarından veya kök hücre kaynaklı mikroglialardan daha önemlidir. Bununla birlikte, bazı birincil kültürlerin kullanımı tekrarlanabilirlik eksikliğinden muzdarip olabilir. Bu protokol, mikroglia'yı yenidoğan yavrulardan manyetik olarak izole etmek için tekrarlanabilir ve ilgili bir yöntem önermektedir. Burada mRNA ekspresyon nicelemesi ve Cy3-boncuk fagositik testi ile 4 saat ve 24 saat sonra birkaç uyaran kullanılarak mikroglial aktivasyon gösterilmiştir. Mevcut çalışmanın, fizyolojik olarak ilgili mikroglia'yı juvenil gelişim aşamalarından izole etmek için kolayca tekrarlanabilir bir teknik sağlaması beklenmektedir.

Giriş

Mikroglia, erken embriyonik gelişim sırasında nöroepitelyuma göç eden yumurta sarısı kesesinin eritropoetik öncüllerinden türetilen merkezi sinir sistemi yerleşik makrofaj benzeri hücrelerdir1. Bağışıklık fonksiyonlarının yanı sıra, nörogelişim sırasında, özellikle sinaptogenez, nöronal homeostaz ve miyelinasyon2 için önemli bir rol oynarlar. Yetişkinlikte, mikroglia çevreyi sürekli taramak için uzun hücresel süreçler geliştirir. Beyin hasarı veya beyin hastalığı gibi homeostaz rüptürleri durumunda, mikroglia morfolojik görünümlerini amip şeklini benimsemek, yaralı bölgeye göç etmek, birçok sitoprotektif veya sitotoksik faktörü artırmak ve serbest bırakmak için değiştirebilir. Mikroglia, gelişim evrelerine ve devam eden yaralanma tipine bağlı olarak heterojen aktivasyon durumlarına sahiptir 3,4,5. Bu çalışmada, bu aktivasyon durumları genel olarak üç farklı fenotipte sınıflandırılmıştır: pro-enflamatuar / fagositik, anti-enflamatuar ve immüno-düzenleyici, gerçekte durumundaha karmaşık olması muhtemel olduğunu akılda tutarak6.

Beyin gelişiminin erken aşamalarında in vivo mikroglial aktivasyonu ve nöroprotektif stratejilerin taranmasını incelemek, (1) sütten kesilmeden önce hayvanların kırılganlığı ve (2) mikroglial hücrelerin sayısının az olması nedeniyle zor olabilir. Bu nedenle, mikroglia üzerine yapılan in vitro çalışmalar toksisite 7,8,9, nöroprotektif stratejiler5,10,11,12,13,14 ve ko-kültürler 15,16,17,18,19,20,21 için yaygın olarak kullanılmaktadır. . In vitro çalışmalar mikroglial hücre hatlarını, kök hücre kaynaklı mikrogliayı veya birincil mikroglia kültürünü kullanabilir. Tüm bu yaklaşımların avantajları ve dezavantajları vardır ve seçim ilk biyolojik soruya bağlıdır. Birincil mikroglia kültürlerini kullanmanın faydaları, homojen genetik arka plan, patojensiz öykü ve hayvan ölümünden sonra mikroglianın uyarıldığı zamanın kontrolüdür22.

Yıllar geçtikçe, hem yenidoğan hem de yetişkin 23,24,25,26,27,28,29 kemirgenlerinden birincil mikroglia kültürlenmesi için farklı yöntemler (akış sitometrisi, sallama veya manyetik etiketleme) geliştirilmiştir. Bu çalışmada, fare yenidoğan yavrularından mikroglia izolasyonu, mikroboncuk kaplı anti-fare CD11b25,27,29 kullanılarak daha önce tarif edilen manyetik aktive hücre sıralama teknolojisi kullanılarak gerçekleştirilmektedir. CD11b, mikroglia da dahil olmak üzere miyeloid hücrelerin yüzeyinde eksprese edilen bir integrin-reseptörüdür. Beyinde enflamatuar bir zorluk olmadığında, neredeyse tüm CD11b + hücreleri mikroglia30'dur. Daha önce yayınlanmış diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında 23,24,25,26,27,28,29, mevcut protokol acil ex vivo mikroglial aktivasyon analizlerini ve yaygın in vitro primer mikroglial kültürü dengelemektedir. Bu nedenle, mikroglia (1) doğum sonrası günde (P) 8'de miyelin çıkarılması olmadan izole edilir, (2) serum olmadan kültürlenir ve (3) beyin izolasyonundan sadece 48 saat sonra siRNA, miRNA, farmakolojik bileşik ve / veya enflamatuar uyaranlara maruz kalır. Bu üç yönün her biri, mevcut protokolü alakalı ve hızlı hale getirir. Her şeyden önce, pediatrik mikroglia kullanımı, in vitro mikroglial reaktiviteyi potansiyel olarak değiştirebilecek ek bir demiyelinizasyon adımı gerektirmeden kültürde dinamik ve reaktif canlı hücrelerin elde edilmesini sağlar. Mevcut protokol, mikroglia'nın fizyolojik ortamına mümkün olduğunca yaklaşmayı amaçlamaktadır. Gerçekten de, mikroglia asla serum ile karşılaşmaz ve bu protokol de serum kullanımını gerektirmez. Dahası, mikroglia'yı kültürden sonra 48 saat kadar erken bir sürede açığa çıkarmak, fizyolojik fakültelerini kaybetmelerini önler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Protokol onaylandı ve tüm hayvanlar Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique'in (Inserm, Fransa) kurumsal yönergelerine göre ele alındı. P8'deki 24 OF1 fare yavrusunun (hem erkek hem de dişi) beyinlerinden mikroglia'nın manyetik izolasyonu, 6 kuyulu, 12 kuyulu veya 96 kuyucuklu plakalara bölünmüş olarak sunulmuştur. Deneysel çalışma, steril koşulları korumak için bir başlık altında gerçekleştirildi.

1. İzolasyon ve hücre kültürü için steril çözeltilerin hazırlanması

  1. Ticari olarak temin edilebilen 10x çözeltiden Ca 2+ve Mg 2+ (HBSS-/-) olmadan 50 mL 1x Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) hazırlayın (bkz.
  2. Ticari olarak temin edilebilen bir doku ayrışma kiti kullanarak Tablo 1'de verilen bileşime göre ayrışma karışımını hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu).
  3. Ticari olarak temin edilebilen 10x çözümünden Ca 2+ ve Mg2+ (HBSS+/+) ile200 mL 1x HBSS hazırlayın.
  4. 200 mL 1x PBS + %0,5 BSA (hücre sıralama arabelleği olarak adlandırılır) hazırlayın.
  5. CD11b-mikroboncukları Tablo 2'ye göre hazırlayın.
  6. 500 mL makrofaj serumsuz kültür ortamı (SFM) + %1 Penisilin-Streptomisin (P/S) hazırlayın. 50 mL tüplerden alikotlar yapın ve bunları 4 ° C'de saklayın. Bu, metnin ilerleyen kısımlarında mikroglia ortamı olarak adlandırılır.
    NOT: Tüm izolasyon çözeltileri, deney gününde steril koşullar altında taze olarak hazırlanmalı ve buz üzerinde tutulmalıdır. Mikroglia hücre kültürü ortamı hazırlanabilir, 50 mL tüplerde aliquoted edilebilir ve gelecekte kullanılmak üzere 4 ° C'de tutulabilir. Filtreleme gerekli değildir.

2. Beyin diseksiyonu

  1. Önceden genel anestezi olmadan büyük makas kullanarak yavrunun kafasını kesin.
  2. Sagital sütürü (15-20 mm) takiben deriyi boyundan buruna kadar küçük makasla kesin (Şekil 1A-C).
  3. Kafatasına paralel Foramen magnumunun içine küçük bir makas ucu yerleştirin. Her iki taraftan da gözlere dikkatlice kesin (Şekil 1D,E).
  4. Kafatasını ve beyni kafadan ayırmak için gözler arasında küçük makasla kesin (Şekil 1F).
  5. İki forseps ile, kafatasını koku alma ampullerine yakın tutun ve altta yatan beyne zarar vermemeye dikkat ederek kafatasını dikkatlice yırtın (Şekil 1G-I).
  6. Beyincik ve olfaktif ampulü jilet ile çıkarın ve beyni iki parçaya bölün (Şekil 1J).
  7. Beyin parçalarını 30-40 mL HBSS-/- içeren bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 1K).

3. Beyin ayrışması ve manyetik mikroglial izolasyon

NOT: Tüm hücre manipülasyonları ve yeniden süspansiyonları 1.000 μL'lik bir pipetle büyük bir dikkatle yapılmalıdır. Yüksek mekanik bir etki uygulamak mikroglia hücrelerini aktive edebilir veya öldürebilir.

  1. Tablo 1'e göre ayrışma karışımı içeren ayrışma tüpü başına 12 beyin parçasını (~ 1.2 g) aktarın. 24 yavru için dört C-Tüpüne ihtiyaç vardı (Şekil 2A-B).
  2. C-Tüplerini ayrışıcıya yerleştirin (ısıtma modu ile). Üreticinin talimatına göre ekipmanda optimize edilmiş NTDK programını başlatın (Şekil 2D).
  3. Tüm hücreleri toplamak için 20 s (4 ° C'de) için 300 x g'de santrifüj. 1.000 μL pipetle üç kez yukarı ve aşağı pipetle pipetleyerek mekanik ayrışmayı tamamlayın (Şekil 2E).
  4. Hücreleri dört adet 15 mL tüp + süzgeçlere aktarın. Süzgeçleri 10 mL HBSS+/+ ile durulayın (Şekil 2F).
  5. 10 dakika (4 ° C'de ) 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Peleti 10 mL HBSS+/+ ile dikkatlice askıya alın (Şekil 2G).
  6. 10 dakika (4 ° C'de ) 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Peleti 6 mL ayıklama tamponu ile dikkatlice yeniden askıya alın (adım 1.4) (Şekil 2H).
  7. 10 dakika (4 ° C'de ) 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Tüp başına 200 μL CD11b-mikroboncuk çözeltisi (adım 1.5) ekleyin ve dikkatlice askıya alın (Şekil 2I).
  8. Tüpleri 4 ° C'de 15-20 dakika boyunca inkübe edin. Peleti 6 mL ayıklama tamponu ile dikkatlice yeniden askıya alın (Şekil 2I-J).
  9. 10 dakika (4 ° C'de ) 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Peleti 8 mL ayıklama tamponu ile dikkatlice yeniden askıya alın (Şekil 2K).
  10. Sekiz sütun hazırlamak için separatördeki POSSEL programını takip edin (bkz. Sütundaki hücreleri 1 mL'ye 1 mL'ye aktarın. Başka bir mL eklemeden önce tüm hücrelerin geçmesini bekleyin. CD11b+ hücrelerini steril elüsyon plakası üzerinde 1 mL ayıklama tamponu ile elute edin (Şekil 2L).
  11. CD11b+ hücrelerini yeni bir 50 mL tüpte havuzlayın (Şekil 2M).
  12. 10 dakika (4 ° C'de ) 300 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Peleti 10 mL soğuk mikroglia ortamı (adım 1.6) ile dikkatlice askıya alın (Şekil 2N).
  13. CD11b+ hücrelerini sayın. P8'de, beyin başına ~ 650.000 hücre elde edilmelidir.
    NOT: Mevcut protokolde, hücreler otomatik bir hücre sayacı kullanılarak sayılmıştır (bkz.
  14. Soğuk mikroglia ortamındaki hücreleri 650.000-700.000 hücre / mL'lik son konsantrasyona kadar askıya alın ve hücre kültürü plakalarına dağıtın.
    NOT: 6 delikli plakalar Western Blot içindir (kuyu başına 2 mL); 12 delikli plakalar RT-qPCR analizi içindir (kuyu başına 1 mL) ve 96 delikli plakalar fagositik analiz içindir (kuyu başına 250 μL); üçü de bu iş için kullanıldı. Ancak bu yazıda Western Blot analizinden elde edilen sonuçlar gösterilmemiştir, ancak bu protokol ile gerçekleştirilmesi mümkündür.
  15. Plakaları gece boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'ye yerleştirin. Önceden ısıtılmış mikroglia ortamına sahip 1.000 μL'lik bir pipetle ortamı dikkatlice değiştirin.
  16. Plakaları, stimülasyondan önce gece boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'ye yerleştirin.
    NOT: Mikroglia'nın 36'dan fazla yavrudan ve P9'dan sonra izole edilmesi önerilmez. Bu, mikroglia'yı aktive etmek için kontaminasyon ve hücre kalıntılarının birikmesi riskini artıracaktır.

4. Hücre stimülasyonları

  1. Ticari olarak temin edilebilen reaktifleri kullanarak stimülasyon reaktiflerini Tablo 3'e göre hazırlayın (bakınız Malzeme Tablosu).
  2. Uyarılan her kuyuya uygun hacmi ekleyin.
    NOT: Uygun hacim, uyaranın konsantrasyonuna ve kuyunun boyutuna bağlıdır.
  3. Plakaları 37 ° C'de, 6 saatte,24saatte veya 48 saatte stimülasyonun sonuna kadar% 5 CO 2 ile yerleştirin.
  4. Western Blot analizi için, süpernatantı aspire edin ve bir pipetle 50 μL protein lizis tamponu ekleyin (bkz. Uçları kullanarak, lize hücreleri ayırmak ve bunları 1,5 mL tüplere aktarmak için plakanın altını çizin. -80 °C'de saklayın.
    NOT: Kültür plakaları, süpernatant doğru şekilde aspire edilirse -80 ° C'de yıllarca saklanabilir.
  5. RT-qPCR analizi 6,31 için, süpernatantı aspire edin ve mRNA ekstraksiyonuna kadar kültür plakalarını doğrudan -80 ° C'de saklayın (adım 5).
  6. Fagositik analiz için lütfen adım 6'ya bakın.

5. mRNA ekstraksiyonu ve RT-qPCR analizi

  1. Üreticinin protokolünü izleyerek RNA ekstraksiyonu, RT-PCR ve RT-qPCR gerçekleştirin (bkz. 5,6,31 astar dizileri için Tablo 4'e bakınız.
  2. Daha önce yayımlanmış5 numaralı raporu takip ederek RT-qPCR analizi gerçekleştirin.

6. Fagositik tahlil

  1. Hücreleri uyarın ve stimülasyonun son 3 saati boyunca fagositik tahlil yapın. Örneğin, 6 saatlik stimülasyon için, 3 saatlik stimülasyondan sonra fagositik tahliline başlayın; ve 12 saatlik stimülasyon için, stimülasyonun başlamasından 9 saat sonra fagositik tahlili başlatın.
  2. Oranı göz önünde bulundurarak hazırlamak için gereken boncuk sayısını hesaplayın (1 hücre: 50 boncuk). 96 delikli plakanın bir kuyucuğu için 8,1 x 106 boncuk gereklidir. Boncuk karışımını Tablo 5'e göre hazırlayın.
    NOT: PBS/FBS karışımına eklemeden önce boncuk stok şişesini dikkatlice vorteksine alın.
  3. 37 °C'de bir su banyosunda 1 saat kuluçkaya yatırın. Her 10 dakikada bir vorteks.
  4. Her bir kuyucuğa eklenecek çözüm hacmini hesaplayın. Çözeltiyi ekleyin ve 3 saat boyunca inkübe edin.
  5. Kuyucukları 1x PBS ile üç kez durulayın. 550 nm (Cy3 emisyon dalga boyu) floresan emisyonunu okuyun.

7. Saflık kalite kontrolü

  1. CD11b manyetik izolasyonunun saflığını akış sitometrisi (FACS) ile değerlendirin (hücre sıralamadan önce ve sonra) ve ardından RT-qPCR'yi gerçekleştirin.
    1. Hücreleri sayın ve adım 3.5 ve adım 3.14'ten sonra 10 x 106 hücre / mL'lik bir seyreltme elde etmek için FACS tamponunda (PBS + 2 mM EDTA + Sığır Serum Albüminin% 0.5'i) yeniden askıya alın.
    2. Geleneksel Fc blokajı 32,33'ün 15 dakikasından sonra, hücreleri 15 dakika boyunca canlılık probu (FVS780) ve fare CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4'e veya bunlara karşılık gelen kontrol izotipleri 32,33'e karşı florofor konjuge antikorları ile üreticiler tarafından önerilen konsantrasyonda inkübe edin (bkz.
    3. Hücreleri FACS tamponu ile yıkayın, sabitleyin ve ticari olarak temin edilebilen bir geçirgenlik kiti ile geçirgenleştirin (bkz.
    4. Geçirgenleştirilmiş hücreler üzerinde tekrar Fc blokajı yapın ve daha sonra NeuN'ye karşı florofor konjuge antikoru ile inkübe edin (bakınız Malzeme Tablosu) veya kontrol izotipi 15 dakika boyunca.
    5. FACS tamponu ile yıkadıktan sonra FACS analizi yapın.
    6. Morfolojik parametrelere ve FVS780 boyamasına dayanan çiftleri ve ölü hücreleri sırasıyla dışladıktan sonra, pozitif hücrelerin yüzdesinin analizi için CX3CR1 (mikroglia), ACSA-2 (astrositler), O4 (oligodendrositler) ve NeuN'un (nöronlar) hücre içi varlığının yüzey ekspresyonu için geçit stratejisini seçin.
  2. 5. adımı takiben, mRNA'yı ayıklayın ve Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, Sinaptophysin ve Gfap mRNA'yı ölçmek için RT-qPCR gerçekleştirin. Rpl13a mRNA'yı muhabir olarak kullanarak Cq'yu normalleştirin ve Itgam mRNA'ya göreceli bir ekspresyon gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Microglia, çevresel zorluklara (travma, toksik moleküller, inflamasyon) maruz kaldığında aktive olan CNS yerleşik makrofajıdır (Şekil 3A). Mikroglia üzerine yapılan in vitro çalışmalar, bu çevresel zorluklarla ilgili hücre otonom mekanizmalarını değerlendirmek ve farmakolojik veya genetik manipülasyon sonrası aktivasyon durumunu karakterize etmek için yayg...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut çalışma, manyetik olarak sıralanmış CD11b + hücrelerini kullanarak birincil bir mikroglial hücre kültürü sunmaktadır. Mikroglial fonksiyonel değerlendirmeye (RT-qPCR ve fagositik tahliller) ek olarak, mikroglial kültür saflığı da belirlendi.

Klasik mikroglia hücre kültürleri genellikle P1 veya P2 kemirgen yenidoğan beyninden ve astrositlerle en az 10 gün boyunca ortak kültürden üretilir. Mikroglia daha sonra yörüngesel bir çalkalayıcı kullanılarak mekanik olarak ayrılır. Mikroglia'yı

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Figürler BioRender kullanılarak oluşturulmuştur. Araştırma, Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco ve Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS and Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E. tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti fare ACSA-2 PE Vio 615Miltenyi Biotec130-116-246
Anti fare CD11b BV421Sony Biyoteknoloji1106255
Anti fare CD45 BV510Sony Biyoteknoloji1115690
Anti fare CX3CR1 PE Cy7Sony Biyoteknoloji1345075
Anti fare NeuN PEMilli-MarkFCMAB317PE
anti fare O4 Vio Parlak B515Miltenyi Biotec130-120-016
BD Cytofix / Cytoperm geçirgenleştirme kitiBD Biosciences554655
Sığır Serumu AlbüminiMiltenyi Biotec130-091-376
CD11b (Mikroglia) Mikro Boncuklar, h, mMiltenyi Biotec130-093-634
Konfokal mikroskopLeica TCS SP8
D-PBS (10x)Thermo Scientific14200067
EDTASigma-AldrichE1644
Falcon Hücre kültürü 12 oyuklu plaka, düz tabanlı + kapakDutscher353043
Falcon Hücre kültürü 96 oyuklu plaka, düz tabanlı + kapakDutscher353072
Falcon tüpleri 50 mLDutscher352098
Fc bloke edici reaktif (Fare CD16/32)BD Biosciences553142
Floresan mikroskobuNikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tüpler (4 x 25 tüp)Miltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Isıtıcılı Okto AyrıştırıcıMiltenyi Biotec130-096-427
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10xThermo Scientific14065049
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10xTermo Bilimsel14185045
iQ SYBR  Yeşil SupermixBio-rad1725006CUST
Iscript c-DNA senteziBio-rad1708890
Lateks boncuklar, amin modifiyeli polistiren, floresan kırmızıSigma-AldrichL2776-1mL
Lipopolisakkaritler (LPS)   Escherichia coli  O55:B5Sigma-AldrichL2880
Makrofaj-SFM serumsuz ortamThermo Scientific12065074
MACS BSA Stok ÇözümüMiltenyi Biotec130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μ m), 4 x 25 adetMiltenyi Biotec130-110-916
Fare IgG1 PEMilliporeMABC002H
Fare IgG2a PE Cy7Sony Biyoteknoloji2601265
Fare IL1 betaMiltenyi Biotec130-101-684
Çoklu-24 Kolon BloklarıMiltenyi Biotec130-095-691
MultiMACS Cell24 AyırıcıMiltenyi Biotec
Nöral Doku Ayrışma Kiti - PapainMiltenyi Biotec130-092-628
Nükleometre NC-200Chemometec
Nucleospin RNA Plus XSMacherey Nagel740990.5
Rahibe EZFlip Üst Konik Santrifüj TüpleriThermo Scientific362694
OPTILUX Petri kabı - 100 x 20 mmDutscher
Pé nicilline-streptomisin (10 000 U/mL)Thermo Scientific15140122
Sıçan IgG2b, k BV421BD Biosciences562603
Sıçan IgG2b, k BV510Sony Biyoteknoloji2603230
REA kontrolü (S) PE vio 615Miltenyi Biotec130-104-616
REA kontrolü (S) Vio Bright B515Miltenyi Biotec130-113-445
Rekombinant Fare IFN-gama Proteini R& D System485-MI
Rekombinant Fare IL-10 Protein R& D System417-ML
Rekombinant Fare IL-4 Protein R& D System404-ML
RIPA TamponSigma-AldrichR0278
Canlılık probu (FVS780)BD Biosciences565388
353003

Kaynaklar

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286(2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819(2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297(2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378(2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463(2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748(2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769(2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15(2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237(2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166(2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242(2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147(2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70(2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651(2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834(2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22(2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428(2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809(2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545(2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99(2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277(2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal 'On' and 'Off' signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, Suppl. 1 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikrogliya zolasyonuManyetik H cre Ay rmaPrimer Mikrogliya K lt rNeonatal Fare BeyniCD11b MikroboncuklarFagositoz AnaliziAk SitometrisiKonfokal MikroskopiMikrogliya AktivasyonuRT qPCR Analizi

İlgili makaleler