Method Article

Peptidomik Çalışmalar için Aminlerin Indirgeyici Metilasyonunu Kullanarak Numune Hazırlama ve Göreli Nicellik

DOI:

10.3791/62971

⸱

November 4th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP), 2Biodiversity of Coastal Environments Postgraduate Program, Bioscience Institute, Sao Paulo State University (UNESP)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, ölüm sonrası bozulmayı önleyen endojen peptitleri korumak için ısı inaktivasyonuna dayanan bir örnek hazırlama yöntemi ve ardından izotopik etiketleme artı LC-MS kullanarak göreli nicelik açıklanmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptidomik, biyolojik bir örnekteki peptitlerin nitel ve nicel analizi olarak tanımlanabilir. Başlıca uygulamaları arasında hastalık veya çevresel stresin peptit biyobelirteçlerinin tanımlanması, nöropeptidlerin, hormonların ve biyoaktif hücre içi peptitlerin tanımlanması, protein hidrolisatlarından antimikrobiyal ve nutraceutical peptitlerin keşfedilmesi ve proteolitik süreçlerin anlaşılması için yapılan çalışmalarda kullanılabilecektir. Numune hazırlama, ayırma yöntemleri, kütle spektrometresi teknikleri ve protein dizilimi ile ilgili hesaplamalı araçlardaki son gelişmeler, tanımlanan peptit sayısının ve karakterize peptidomların artmasına katkıda bulunmuştur. Peptidomik çalışmalar sıklıkla hücrelerde doğal olarak üretilen peptitleri analiz eder. Burada, ısı inaktivasyonuna dayanan, proteaz aktivitesini ortadan kaldıran ve hafif koşullarla ekstraksiyon yapan bir örnek hazırlama protokolü tanımlanmıştır, bu nedenle peptit bağları bölünmesi yoktur. Ek olarak, aminlerin indirgeyici metilasyonu ile kararlı izotop etiketlemesi kullanılarak peptitlerin bağıl niceliği de gösterilmiştir. Reaktifler ticari olarak mevcut, diğerlerine göre ucuz, kimyasal olarak kararlı ve tek bir LC-MS çalışmasında beş numunenin analizine izin verdiğinden, bu etiketleme yönteminin bazı avantajları vardır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"Omics" bilimleri, DNA, RNA, proteinler, peptitler, metabolitler vb. Bu büyük ölçekli veri kümeleri (genomik, transkriptomik, proteomik, peptidomik, metabolomik vb.) biyolojide devrim yaratmış ve biyolojik süreçlerin ileri düzeyde anlaşılmasına yol açmıştır1. Peptidomik terimi 20. Bununla birlikte, peptidomiklerin belirgin özellikleri vardır, burada ana ilgi hücresel süreçler sırasında doğal olarak üretilen peptit içeriğini ve bu moleküllerin biyolojik aktivitesinin karakterizasyonunu araştırmaktır3,4.

Başlangıçta, biyoaktif....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptit ekstraksiyonu ve indirgeyici metilasyon için aşağıdaki prosedür daha önce yayınlanan prosedürlerden uyarlanmıştır24,25,26,27. Bu protokol, Ulusal Hayvan Deneyi Kontrol Konseyi'nin (CONCEA) yönergelerine uydu ve Sao Paulo Devlet Üniversitesi Biyobilim Enstitüsü Hayvan Kullanımı Etik Komisyonu (CEUA) tarafından onaylandı. protokol adımları Şekil 1'de gösterilmiştir.

NOT: Tüm sulu çözeltileri ultra saf suda hazırlayın.

1. Peptit ekstraksiyonu

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kütle spektrometresi üzerinde gerçekleştirilen çalışmalardan elde edilen sonuçlar, kütle spektrometresi yazılımında açılabilen ham veri dosyalarında saklanır. MS spektrumunda, 2-5 etiket arasında değişen etiketli peptitleri temsil eden tepe gruplarını kullanılan etiketleme şemasına göre gözlemlemek mümkündür. Örneğin, Şekil 2'de, kromatografik bir zamanda algılanan tepe çiftleri, aynı çalıştırmada iki farklı örnekte yalnızca iki izotopik etiketin kullanıldığı bir denemede temsil edilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoğu peptidomik çalışmada, kritik adımlardan biri, şüphesiz, proteazlar tarafından üretilen peptit parçalarının ölümünden birkaç dakika sonra varlığını önlemek için dikkatlice yapılması gereken örnek preparattır. Mikrodalga olmayan örneklerden hazırlanan beyin özleri üzerinde yapılan ilk çalışmalarda, 10 kDa mikrofiltratlarda çok sayıda protein parçasının bulunduğu görüldü. Protein bozulmasından peptit spektrumunu önlemek için farklı yaklaşımlar tanımlanmıştır: odaklanmış mikrodalga ışınlama hayvan kurban

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rakip finansal çıkarlar yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan tekniklerin geliştirilmesi ve kullanımı Brezilya Ulusal Araştırma Konseyi hibe 420811/2018-4 (LMC) tarafından desteklendi; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (www.fapesp.br) 2019/16023-6 (LMC), 2019/17433-3 (LOF) ve 21/01286-1 (MEME) hibeleri verir. Fon sağlayıcılar çalışma tasarımında, veri toplama ve analizinde, yayınlanma kararında veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rol oynamamışlardır.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 kDa kesme filtreleriMerck MilliporeUFC801024Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa
AsetonSigma-Aldrich179124
AsetonitrilSigma-Aldrich1000291000
Amonyum bikarbonatSigma-Aldrich11213
analitik kolon (EASY-Column)EASY-Column(SC200)  10 cm, ID75 ve mikro; m, 3 ve mikro; m, C18-A2
Etil 3-aminobenzoat metansülfonatSigma-AldrichE10521MS-222
FloresidaminSigma-AldrichF9015
Formaldehit çözeltisiSigma-Aldrich252549
Formaldehit-13< / sup>C, d2< / sub>, çözeltiSigma-Aldrich596388
Formaldehit-d2 çözeltiSigma-Aldrich492620
Formik asitSigma-Aldrich33015
Çeker ocakQuimisQ216
Hidroklorik asit - HClSigma-Aldrich258148
LoBind-Protein tutma tüpleriEppendorfEP0030108116-100EA
LTQ-Orbitrap VelosThermo Fisher ScientificLTQ Velos
Mikrodalga fırınPanasonicNN-ST67HSRU
n Easy-nLC II nanoHPLCThermo Fisher ScientificLC140
PEAKS StudioBiyoinformatik Çözümleri A.Ş.VERSİYON 8.5
Fosfat tamponlu salinInvitrogen3002tabletler
ön kolon (EASY-Column)Thermo Fisher Scientific(SC001)2 cm, ID100 & mikro; M, 5 ve mikro; m, C18-A1
Konik tüpler içinsoğutmalı santrifüjHermleZ326K
Mikrotüpler içinsoğutmalı santrifüjVisionVS15000CFNII
Ters fazlı temizleme kolonları    (Oasis HLB 1 cc Kartuş)Sular186000383Oasis HLB 1 cc Kartuş
Sodyum siyanoborodeuteride - NaBD 3< / sub>CNSigma-Aldrich190020
Sodyum siyanoborohidrit - NaBH < sub> 3< / sub>CNSigma-Aldrich156159
Sodyum fosfat dibazikSigma-AldrichS9763NOT: 0,2 M PB= 0,1 M fosfat tampon pH 6,8 (26,85 mL Na2HPO<>sub3 1M) artı 0,1 M fosfat tamponu pH 6,8 (23,15 mL NaH2PO3 1M) ila 250 ml su
Sodyum fosfat monobazikSigma-AldrichS3139
SonikatörQsonicaQ55-110
Standart peptitProteimaxamino asit dizisi: LTLRTKL
Trietilamonyum tamponu - TEAB 1 MSigma-AldrichT7408
Trifloroasetik asit - TFASigma-AldrichT6508
Ultra arıtılmış suMilli-QDirect-Q 3UV
Vakumlu santrifüjGeneVacMiVac DNA yoğunlaştırıcı
Su banyosuCientec266
Xcalibur YazılımThermoFisher ScientificOPTON-30965

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kandpal, R., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. Biotechniques. 46 (5), 354-355 (2009).
  2. Farrokhi, N., Whitelegge, J. P., Brusslan, J. A. Plant peptides and peptidomics. Plant Biotechnology Journal. 6 (2), 105-134 (2008).
  3. Schulz-Knappe, P., Schrader, M., Zucht, H. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Peptidomics StudiesReductive MethylationIsotopic LabelingPeptide QuantitationSample PreparationMass SpectrometryPeptide ExtractionHeat InactivationNeuroblastoma CellsPeptide Biomarkers

Related Articles