Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

2.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62974

⸱

8 Eylül 2021

 ,  , 
1Center for Quantitative Biology, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, DNA üzerinde birleşen EWS-FLI1 kondensatlarının biyofiziksel mekanizmasını incelemek için tek moleküllü görüntüleme yöntemi olan DNA Perdeleri'nin kullanımını açıklıyoruz.

Özet

Kromozomal translokasyondan kaynaklanan füzyon genleri birçok solid tümörde veya lösemide bulunmuştur. Füzyon onkoproteinlerinin FUS/EWS/TAF15 (FET) ailesine ait olan EWS-FLI1, Ewing sarkomunda en sık tutulan füzyon genlerinden biridir. Bu FET ailesi füzyon proteinleri tipik olarak N-terminuslarında düşük karmaşıklıklı bir FET proteini alanı (LCD) ve C-terminuslarında bir DNA bağlayıcı alan (DBD) barındırır. EWS-FLI1'in LCD-LCD ve LCD-DBD etkileşimleri nedeniyle hedef bağlanma lokuslarında biyomoleküler kondensatlar oluşturduğu doğrulanmıştır ve bu yoğuşmalar gen transkripsiyonunu arttırmak için RNA polimeraz II'yi işe alabilir. Bununla birlikte, bu yoğuşmaların bağlanma bölgelerinde nasıl monte edildiği belirsizliğini korumaktadır. Son zamanlarda, EWS-FLI1 yoğuşmalarının bu montaj süreçlerini görselleştirmek için tek moleküllü bir biyofizik yöntemi olan DNA Perdeleri uygulandı. Burada, DNA Perdelerinin hedef DNA üzerine monte edilen biyomoleküler kondensatların incelenmesinde uygulanması için ayrıntılı deneysel protokol ve veri analizi yaklaşımları tartışılmaktadır.

Giriş

Transkripsiyonel düzenleme, canlı hücrelerde kesin gen ekspresyonu için çok önemli bir adımdır. Kromozomal modifikasyon, transkripsiyon faktörleri (TF'ler) ve kodlamayan RNA'lar gibi birçok faktör bu karmaşık sürece katılır 1,2,3. Bu faktörler arasında, TF'ler, promotörler veya arttırıcılar olarak bilinen spesifik DNA dizilerini tanıyarak ve bağlayarak ve daha sonra transkripsiyonuaktive etmek veya bastırmak için diğer fonksiyonel proteinleri işe alarak transkripsiyonel düzenlemenin özgüllüğüne katkıda bulunur 4,5,6,7. Bu TF'lerin insan genomundaki hedef bölgelerini aramayı ve histon olmayan DNA bağlayıcı proteinlerle kaplı DNA ile etkileşime girmeyi nasıl başardıkları, bilim adamlarını on yıllardır şaşırttı. Son birkaç yılda, TF'lerin hedef arama mekanizması için birkaç klasik model, DNA zinciri 8,9,10,11 boyunca nasıl "kaydıklarını", "zıpladıklarını", "zıpladıklarını" veya "bölümler arası transferi" tanımlamak için inşa edilmiştir. Bu modeller, tek bir TF molekülünün DNA'sı üzerindeki arama davranışına odaklanmıştır. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan çalışmalar, bazı TF'lerin çekirdekte tek başına veya Mediator kompleksi12 ile sıvı-sıvı faz ayrımına (LLPS) maruz kaldığını göstermektedir. TF'lerin gözlemlenen damlacıkları, promotör veya arttırıcı bölgelerle ilişkilidir ve biyomoleküler kondens oluşumunun transkripsiyondaki rolünü ve üç boyutlu genom 13,14,15'i vurgulamaktadır. Bu biyomoleküler kondensatlar, in vivo ve in vitro membran eksikliği olan bölmelerle bağlantılıdır. Modüler biyomakromoleküllerin ve proteinlerin içsel olarak düzensiz bölgelerinin (IDR'ler) çok değerli etkileşimlerin iki ana itici gücü olduğu LLPS aracılığıyla oluşturulurlar16. Böylece, TF'ler sadece DNA'yı aramakla kalmaz, aynı zamanda bu yoğuşmalar 4,17,18 içinde sinerjik olarak işlev görür. Bugüne kadar, bu transkripsiyon kondensatlarının DNA üzerindeki biyofiziksel özelliği belirsizliğini korumaktadır.

Bu nedenle, bu çalışma, TF'lerin DNA üzerinde oluşturduğu transkripsiyon kondensatlarının oluşumunu ve dinamiklerini in vitro olarak doğrudan görüntülemek için tek moleküllü bir yöntem olan DNA Perdeleri'ni uygulamayı amaçlamıştır. Proteinler ve DNA arasındaki etkileşimi incelemek için yüksek verimli bir in vitro görüntüleme platformu olan DNA Perdeleri, DNA onarımı19,20,21, hedef arama 22 ve LLPS 17,23,24'te uygulanmıştır. DNA Perdelerinin akış hücresi, yüzeyi pasifleştirmek ve biyomoleküllerin yüzeyde dağılmasına izin vermek için biyotinile lipit çift katmanları ile kaplanmıştır. Nanofabrikasyon zikzak desenleri DNA'nın hareketini sınırlar. Biyotinile Lambda DNA substratları bariyer kenarları boyunca hizalanabilir ve yönlendirilmiş tampon akışı tarafından gerilebilir. Tüm moleküllerin aynı başlangıç ve bitiş dizileri, proteinin DNA üzerinde izlenmesine izin verir ve bağlanma olaylarının konum dağılımını tanımlar25,26. Dahası, DNA Perdelerinin toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) ile kombinasyonu, arka plan gürültüsünü en aza indirmeye ve sinyalleri tek molekül düzeyinde algılamaya yardımcı olur. Bu nedenle, DNA Perdeleri, DNA motifleri üzerindeki transkripsiyon kondens oluşumunun dinamiklerini araştırmak için umut verici bir yöntem olabilir. Bu yazıda, kromozomal translokasyon tarafından üretilen bir FUS/EWS/TAF15 (FET) ailesi füzyon onkoproteini olan EWS-FLI1 örneği açıklanmaktadır. 25× GGAA içeren Lambda DNA'sı - EWS-FLI127'nin bağlanma dizisi - EWS-FLI1 moleküllerinin DNA üzerinde LLPS'ye nasıl maruz kaldığını gözlemlemek için DNA Perdeleri deneylerinde DNA substratı olarak kullanıldı. Bu yazıda deneysel protokol ve veri analiz yöntemleri ayrıntılı olarak ele alınmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Lipid çift katmanlı ana karışımın hazırlanması

  1. Cam şişeleri çift damıtılmış su (ddH2O) ve% 99 etanol ile durulayın ve 60 °C kurutma fırınında kurulayın.
  2. 1 g 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC), 100 mg polietilen glikol ile reaksiyona giren (PEGylated) lipitleri (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[metoksi (polietilen glikol)-2000] (amonyum tuzu) (PEG2000 DOPE) ve 25 mg biyotinillenmiş lipitleri (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(kapak biyotinil) (sodyum tuzu) (Biotinyl Cap DOPE)) 10 mL kloroform içine çözerek lipit ana karışımını yapın.
  3. Şişe başına lipit ana karışımının 1 mL alikotunu hazırlayın ve temiz cam şişelerde -20 ° C'de saklayın.
    NOT: Çözünmüş lipiti cam şişelerde saklayın ve depolama sırasında şişe kapağını parafilm ile örtün.

2. Lipozom çözeltisinin hazırlanması

  1. 2 mL'lik bir cam şişeyi ddH2O ve %99 etanol ile durulayın ve 60 °C'lik bir kurutma fırınında iyice kurulayın.
  2. 250 μL'lik bir cam şırıngayı kloroform ile durulayın ve ardından lipit ana karışımının 200 μL'sini kuru cam şişeye aktarın.
  3. Flakonu sürekli olarak bir yönde döndürürkenN2'yi nazikçe akıtmak için bir azot püskürtme tabancası kullanın.
    NOT:N2 , kloroformun buharlaşmasına yardımcı olacak ve artık lipitler cam şişenin duvarında ince bir film oluşturacaktır. Azot akışını ilk başta çok yumuşak olacak şekilde ayarlayın ve şişede beyaz bir film göründüğünde akışı artırın; Bu buharlaşma işlemini 5 dakika içinde tamamlayın.
  4. Cam şişeyi, kloroformun lipitlerden tamamen çıkarılması için oda sıcaklığında (RT) 16-24 saat vakumlu kurutma fırınına aktarın.
  5. Cam şişeye 2 mL taze lipit tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 100 mM NaCl) ekleyin ve lipitleri RT'de 2 saat boyunca çözün. Çözeltiyi birkaç kez vorteksleyin ve 5 mL'lik bir polipropilen kültür tüpüne aktarın.
  6. Aşağıdaki ayarları kullanarak, küçük unilamellar veziküller oluşturmak için bir mikro uçlu sonikatör ile buz üzerindeki lipit çözeltisini sonikleştirin: 6 döngü için 6 s on-12 s kapalı (% 20 genlik), daha sonra 3 döngü için 6 s on-6 s kapalı (% 30 genlik), son olarak 10 s açık (% 40 genlik).
    NOT: Sonikasyon sırasında sıcaklık artışı köpüğün patlamasına neden olabilir ve lipozomları tahrip edebilir. Bu nedenle, köpüğün durumunu ve sıcaklığını kontrol edin ve buzu sık sık doldurun.
  7. Lipozomları 0.22 μm naylon şırınga filtresi, aliquot ile filtreleyin ve 4 ° C'de saklayın.
    NOT: Uzun süreli depolama ile hareketlilikleri azaldığından, lipozomlar 2-3 ay içinde kullanılmalı veya kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır.

3. Lambda DNA'sının sekans klonlaması ve biyotinilasyonu

  1. Lambda DNA'sına bağlayıcı motiflerin yerleştirilmesi
    1. Bağlayıcı motifleri ve Lambda DNA'sını içeren hedef parçayı NheI ve XhoI ile sindirin. Hedef parçayı RT'de bir gecede T4 ligaz kullanarak Lambda DNA'sı ile bağlayın.
    2. Kültür E.coli VCS257 hücreleri antibiyotiksiz LB ortamında OD600 0.6'ya ulaşana kadar. Bakterileri daha sonra kullanmak üzere 4 ° C'de saklayın.
    3. T4 ligazını denatüre etmek için ligasyon çözeltisini 65 °C'de 20 dakika ısıtın.
    4. Lambda faj ekstraktını çözün, künt uçlarla pipetleyerek bağlı ürünle nazikçe karıştırın ve karışımı RT'de 2 saat boyunca inkübe edin.
    5. Adım 3.1.4'ten itibaren ambalaj karışımına 500 μL SM tamponu (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl ve 8 mM MgCl 2, 0,22 μm filtreden süzülmüş) ve 20 μL kloroformekleyin, iyice karıştırın ve çözeltiyi santrifüj edin.
      NOT: Ambalaj ekstraktının aktivitesi uzun süre 4 °C'de tutulabilir.
    6. 10 μL ambalaj ekstraktını 90 μL SM tamponu ve VCS257 hücrelerinin 100 μL'si (adım 3.1.2'den itibaren) ile karıştırarak reaksiyon karışımını hazırlayın ve karışımı 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Ambalaj çözeltisi konsantrasyonu, ertesi gün faj plaklarının yoğunluğuna bağlıdır; gerektiğinde seyreltilebilir veya eklenebilir.
    7. 15 mL'lik bir tüpte ~5 mL erimiş üst agar (15 g / L agar ile 22 g / L NZCYM suyu) alın. Üst agar ~ 42 ° C'ye soğuduğunda, kör uçlu bir pipet kullanarak reaksiyon karışımını (adım 3.1.6'dan itibaren) yavaşça ekleyin ve sıvıyı antibiyotik içermeyen bir LB agar plakasına dökün. Plakayı gece boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde tutun.
    8. Üst agar plakasındaki şeffaf faj plakları arasındaki pozitif plakları PCR ile onaylayın. Pozitif plakları pipetli yeni bir üst agar plakasına aktarın ve plakayı gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde tutun.
    9. 10 mM MgCl 2 ve 10 mM CaCl 2 içeren 400 μL tampona 400 μLVCS257 hücresi ekleyin, bu hücre karışımına bir plak aşılayın ve 15 dakika boyunca 250 rpm'de 37 ° C'lik bir çalkalayıcıda inkübe edin.
    10. Faj plağını içeren bu süspansiyonun 800 μL'sini 2 L'lik bir şişede 200 mL NZCYM suyuna ekleyin ve 125 rpm'de 37 ° C'lik bir çalkalayıcıda inkübe edin.
    11. ~ 4 saatlik ekimden sonra bakteriyel süspansiyonun OD600'ünü ölçün. OD600 değerinin önce yükseleceğini ve ardından ~0,2'de bir oluğa düşeceğini unutmayın. OD600 değeri tekrar yükselmek üzereyken inkübasyonu durdurun, 500 μL kloroform ekleyin ve 80 rpm'de 5 dakika daha çalkalayın.
      NOT: Oluktan sonra OD600'deki artış hızlı bir şekilde gerçekleşecektir; Bu nedenle, kültürde aşırı VCS257 hücre büyümesini önlemek için OD600 değeri 0.3'e düştüğünde daha sık ölçülmelidir.
    12. Faj kültürünü 500 mL'lik bir şişeye aktarın, 11.7 g NaCl ekleyin ve şişeyi sallayın. Şişeyi 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
    13. Süspansiyonu eşit olarak dört adet 50 mL tüpe aktarın. Tüpleri 10 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.
      NOT: Bölüm 3.1'deki tüm bu santrifüjleme adımlarının 4 °C'de yapılması gerekir.
    14. Süpernatantları dört yeni 50 mL tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca aynı hızda tekrar santrifüj yapın.
    15. Süpernatantları toplayın,% 10 (w / v) PEG8000 tozu ekleyin ve 30 dakika boyunca inkübe etmek için 4 ° C'de döndürün.
    16. Faj peletlerini elde etmek için 3.1.15 adımındaki süspansiyonları 12.000 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın.
    17. Peletleri dört tüp halinde 1 mL faj seyreltme tamponunda (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl ve 10 mM MgCl2) yeniden askıya alın ve bu karışımların 4 mL'sini 50 mL'lik bir tüpe dökün.
    18. RNaz A (10 mg / mL) ve DNaz I (4 mg / mL) 20 μg / mL ve 5 μg / mL nihai konsantrasyonlara ekleyin ve fazla nükleik asitleri parçalamak için 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    19. Tüpe 4,5 mL 300 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,76 mL 0,5 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), 1,67 mL% 10 sodyum dodesilsülfat (SDS) ve 75 μL proteinaz K (10 mg / mL) ekleyin ve 10 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edin.
    20. 4,5 mL önceden soğutulmuş 3 M potasyum asetat ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
    21. 10 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı 10.000 x g'de 5 dakika daha döndürün.
    22. Toplanan süpernatantın içine yeterli karıştırma ile% 70 izopropanol hacmi ekleyin (adım 3.1.21'den itibaren), RT'de 2 dakika inkübe edin ve ardından 10 dakika boyunca 8.000 x g'de santrifüj yapın. İzopropanolü atın ve 5 dakika boyunca tekrar döndürün.
      NOT: DNA peleti ilk 10 dakikalık santrifüjlemeden önce bulaşacaktır; Pelet, ikinci 5 dakikalık santrifüjlemeden sonra tüpün dibinde yoğunlaşacaktır.
    23. Çökeltilmiş DNA'yı 2-3 mL% 70 etanol ile yıkayın ve 1 dakika boyunca tekrar aşağı doğru döndürün. Peleti 2 saat boyunca 4 ° C'de kurutun ve ardından DNA'yı RT'de gece boyunca 500 μL TE tamponunda (10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ve 1 mM EDTA) yeniden askıya alın.
    24. DNA'yı 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 3 dakika boyunca 18.000 x g'de döndürün. DNA'yı yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın. Saflaştırılmış Lambda DNA'sını alıkoyun ve -20 ° C'de saklayın.
  2. Biotin-Lambda DNA preparatı
    1. 50 μL saflaştırılmış Lambda DNA'sını klonlanmış motiflerle 65 °C'de 10 dakika eritin.
      NOT: Lambda DNA'sı ~ 48 kbp uzunluğunda olduğundan, DNA kırılmalarını önlemek için pipetlemeden önce ısıtılmalıdır.
    2. 50 μL Lambda DNA'sı, 1 μL Biotin primer (5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 μM) ve 54 μL ddH2O'yu birlikte karıştırın. Karışımı 65 ° C'de 5 dakika boyunca birlikte inkübe edin ve RT'ye soğuması için tezgahta bırakın.
    3. 12 μL 10x T4 ligaz tamponu ve 3 μL T4 ligaz ekleyin ve RT'de birkaç saat veya gece boyunca inkübe edin.
    4. Ligasyon ürününe eşit miktarda fenol-kloroform (1: 1) karışımı ekleyin, hemen iyice karıştırın ve RT'de 2 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.
    5. DNA'yı içeren üst sulu fazı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın, eşit miktarda kloroform ekleyin, iyice karıştırın ve ardından 2 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.
    6. Üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın, eşit miktarda izopropanol ve 3 M sodyum asetat hacminin% 10'unu ekleyin ve RT'de 2 dakika boyunca inkübe edin. Karışımı 5 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj edin.
    7. Süpernatanı çıkarın, peleti% 75 etanol ile yıkayın ve ardından 5 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.
    8. % 75 etanol çıkarın, DNA'yı RT'de 10 dakika boyunca hava ile kurutun ve DNA'yı çözmek için 120 μL TE tamponu kullanın.
    9. Adım 3.2.8'den itibaren çözeltinin120 μL'sine 60 μL Tampon A (% 30 (w/v) PEG8000 ve 30 mM MgCl 2) ekleyin ve 20-24 saat boyunca 4 °C'de döndürün.
    10. Karışımı 5 dakika boyunca 18.000 g'da santrifüj edin ve süpernatanı çıkarın.
    11. Peleti yıkamak için 180 μL önceden soğutulmuş% 75 etanol kullanın ve adım 3.2.10'u tekrarlayın.
    12. Peleti RT'de kurutun ve DNA'yı çözmek için 100 μL TE150 tamponu kullanın.

4. Nanofabrikasyon zikzak bariyerler

  1. Slaytları sonikasyonla 20 dakika boyunca asetonda temizleyin ve 20 dakika daha sonikasyon için 1 M NaOH ile yeni bir cam kaba aktarın. 90 mLH2SO4'ü 30 mL H2O2 ile karıştırın ve slaytları 30 dakika boyunca bu karışıma batırın. Slaytları aseton ve izopropanol ile durulayın ve slaytlarıN2 ile kurulayın.
    NOT: H2S04 veH2O2'ninkarıştırılması ekzotermik bir işlemdir; Operasyon sırasında yeterli güvenlik önlemlerini almak.
  2. Temizlenmiş sürgüyü polimetilmetakrilat (PMMA) 25 kDa, PMMA 49.5 kDa ve üst iletken koruyucu kaplama tabakası ile art arda kaplayın. Zikzak bariyerleri yazmak için elektron ışını litografisini kullanın (Şekil 1A).
  3. İletken koruyucu kaplamayı çıkarmak için slaytları ddH2O ile yıkayın ve slaytlarıN2 ile kurulayın.
  4. Bir magnetron püskürtme makinesi kullanarak 30 nm'lik bir krom tabakası (Cr) biriktirin ve kalan PMMA katmanlarını asetonla çıkarın.
    NOT: Bir akış hücresi 20'den fazla DNA Perdesi deneyi için yeniden kullanılabilir. Akış hücresini tekrar kullanmak için etanol, deterjan ve NaOH ile yıkayın.

5. EWS-FLI1 proteininin saflaştırılması

NOT: Lambda DNA'sı üzerinde 25 × GGAA motifli 500 nM EWS-FLI1'in gözlemlenmesi, DNA Perdelerinin yoğuşma oluşumuna uygulanması için iyi bir örnek teşkil etmektedir. EWS-FLI1, EWSR1'in N-terminalini (1-265) ve FLI1'in C-terminalini (220-453) birleştiren bir füzyon proteinidir. Bir mCherry etiketi, görselleştirme için EWS-FLI1 füzyon proteininin N-terminaline kaynaştırıldı.

  1. EWS-FLI1 genini yeniden yapılandırılmış bir pRSF vektörüne veya başka bir uygun prokaryot ekspresyon vektörüne klonlayın.
  2. 7x His-mCherry-EWSFLI1 plazmid kodlamasını E.coli BL21 (DE3) suşuna dönüştürün; gece boyunca 37 ° C'de 5 mL LB ortamında tek bir koloni yetiştirin. 2 L LB ortamına aktarıldıktan sonra OD600 değeri 0.6-0.8'e ulaştığında, 0.5 mM IPTG ekleyin ve hücre kültürünü 16-18 saat boyunca 18 °C'de sallayın.
  3. Süpernatantı çıkarmak ve hücreleri lizis tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 M KCl; 1 M üre; 10 mM imidazol; 1.5 mM beta-merkaptoetanol (β-ME); ve% 5 gliserol) ile yeniden askıya almak için kültürü santrifüj edin.
  4. ~ 30 dakika boyunca 18000 × g'de sonikasyon ve santrifüjlemeden sonra, süpernatantı 5 kat hacimli bir lizis tamponunda dengelenmiş Ni-NTA reçinesine yükleyin ve ardından reçineyi 10 kat hacimli bir yıkama tamponu (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 M KCl, 1 M üre, 40 mM imidazol, 1.5 mM β-ME ve% 5 gliserol) ile yıkayın.
  5. Bağlı proteini 15 mL elüsyon tamponu (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 M KCl, 1 M üre, 500 mM imidazol, 1.5 mM β-ME ve% 5 gliserol) ile süzün ve elüsyonu ~ 500 μL'ye yoğunlaştırın.
  6. Konsantre protein çözeltisini bir jel filtrasyon kolonuna yükleyin ve ürünleri SDS-poliakrilamid jel elektroforezi ile analiz edin. Saflaştırılmış proteini sıvı azotta hızla dondurun ve -80 ° C'de saklayın.

6. DNA Perdeleri akış hücresinin hazırlanması

  1. DNA Perdeleri deneyi için zikzak nanofabrikasyon bariyerlere sahip bir akış hücresi hazırlayın ve akış yönünü belirleyin. Bunu yapmak için, giriş ve çıkış tüplerini doğru yönde bağlayın.
  2. Akış hücresini iki adet 3 mL şırınga kullanarak 2,5 mL lipit tamponu ile yıkayın. Akış hücresinde kabarcık olmadığından emin olun.
  3. Şırıngayı çıktıdan çıkarın ve her enjeksiyondan sonra 5 dakikalık inkübasyonla üç kez 1 mL lipozom çözeltisi (bölüm 2'den 40 μL lipozom stoğu ve 960 μL lipit tamponu) enjekte edin.
  4. İyileşme adımı için, akış hücresini 2,5 mL lipit tamponu ile yavaşça yıkayın ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
    NOT: İyileşme süresi gerekirse daha uzun olabilir; Herhangi bir kabarcık görünürse, kabarcıkları çıkarmak için 5.3 ve 5.4 adımlarını tekrarlayarak çift iyileştirme gerçekleştirin.
  5. Yüzey pasivasyonu için 30 mL sığır serum albümini (BSA) tamponu (40 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM ditiyotreitol ve 0.5 mg / mL BSA) hazırlayın. 30 dakikalık iyileşmeden sonra, akış hücresini çıkış tarafından 2,5 mL BSA tamponu ile yıkayın.
    NOT: BSA stoğu, 4 °C'de depolanan 20 mg/mL'lik bir çözeltidir ve 1-2 hafta içinde kullanılmalıdır. Tampondaki BSA konsantrasyonu yüzey durumuna göre ayarlanabilir.
  6. 800 μL streptavidin tamponunu (1 mg/mL streptavidin stoğunun 10 μL'si, 790 μL BSA tamponu) giriş tarafından akış hücresine her adımdan sonra 10 dakikalık inkübasyonla iki adımda enjekte edin.
    NOT: Streptavidin, biyotinile lipitler ve biyotinile DNA arasında köprü kurarak çok değerliliği nedeniyle DNA'yı lipitlere demirler.
  7. Tüm serbest streptavidin moleküllerini çıkarmak için akış hücresini 2,5 mL BSA tamponu ile yıkayın.
  8. Biotin-Lambda DNA'sını BSA tamponu (2.5 μL DNA ve 998 μL BSA tamponu) kullanarak bölüm 3'teki klonlanmış motiflerle seyreltin. Lambda DNA'sını 5 dakikalık aralıklarla 4 kez yavaşça enjekte edin.
  9. Enjeksiyon sırasında mikroskopu ve bilimsel Tamamlayıcı Metal Oksit Yarı İletken (sCMOS) sistemini açın. Boruyu 10 mL ddH 2 O ile yıkayın Prizmayı ve boru konektörünü su,%2sıvı küvet temizleyici ve% 99 etanol ile durulayın. Sırasıyla 150 mM ve 0,5 nM'lik nihai konsantrasyonları elde etmek için BSA tamponuna KCl ve çift sarmallı DNA boyası ekleyerek görüntüleme tamponunu hazırlayın ve görüntüleme tamponunun en az 20 mL'sini 30 mL'lik bir şırıngaya alın.
  10. Akış hücresini mikroskop aşamasına yerleştirin ve mikroakışkan sisteme bağlayın.
  11. DNA moleküllerini 10 dakika boyunca bariyere yıkamak için 0.03 mL / dak'lık bir akış hızı kullanın, akış durduğunda 30 dakika boyunca inkübe edin ve ardından DNA'nın yanal olarak dağılmasına izin vermek için kapatın.
    NOT: Bu 30 dakikalık inkübasyonun amacı, DNA molekülünün basit difüzyon yoluyla bariyerin önünde daha eşit bir şekilde dağılmasına izin vermektir, çünkü DNA molekülleri, bariyerin yıkandıkları girişe kapalı olan tarafında birikme eğilimindedir. Kuluçka süresi gerektiği gibi ayarlanabilir.

7. DNA Perdelerinde EWS-FLI1 yoğuşma oluşumunun görüntülenmesi

  1. Görüntüleme yazılımını açın, parlak alan altında 3 × 3 zikzak deseninin konumlarını bulun ve işaretleyin.
  2. DNA'yı çift sarmallı DNA boyasıyla 10 dakika boyunca boyamak için akışı 0,2 mL / dak'da açın.
  3. mCherry-EWS-FLI1'i görüntüleme tamponu ile tüp içindeki 100 μL'de 100 nM konsantrasyonuna kadar seyreltin.
  4. Protein numunesini valften 100 μL'lik bir cam şırınga ile yükleyin ve akış hızını 0,4 mL / dak olarak değiştirin.
  5. 488 nm lazeri açın ve DNA dağılım durumunu kontrol etmek için her bölgeyi önceden tarayın; DNA moleküllerinin eşit olarak dağıldığı bölgeyi seçin. Lazer gücünü 488 nm lazer için %10 ve 561 nm lazer için %20 olarak ayarlayın. Prizmanın yakınındaki gerçek lazer gücünü ölçmek için güç ölçeri kullanın: 488 nm lazer için 4,5 mW ve 561 nm lazer için 16,0 mW.
  6. Görüntü alma
    1. Aynı anda hem 488 nm hem de 561 nm lazerlerle 2 s aralıklarla görüntü almaya başlayın.
    2. Görüntüleme tamponunun protein numunesini 60 sn'den sonra akış hücresine yıkamasına izin vermek için valfi manuel moddan enjeksiyon moduna değiştirin.
      NOT: Bu işlem ~ 30 s sürecek ve görüş alanı, EWS-FLI1 proteinleri akış hücresine ulaşır ulaşmaz mCherry sinyalleri ile kaplanacaktır.
    3. Serbest EWS-FLI1'i çıkarmak için, akış hücresini görüntüleme arabelleğiyle yalnızca 561 nm lazer açıkken 5 dakika boyunca yıkamaya devam edin. Akışı durdurun ve 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    4. DNA'nın genişlemesine izin vermek için akışı 0,4 mL / dak'da açın ve EWS-FLI1 kondens oluşumunun yüksek verimli verilerini elde etmek için farklı çerçeveler arasında 2 s aralıklarla görüntüler elde edin.

8. mCherry-EWS-FLI1 için yoğunluk analizi

  1. Verileri görüntü dizileri olarak ImageJ yazılımına aktarın, 8× 8 piksel karede 25 × GGAA sitelerindeki puncta'yı seçin ve görüntüyü .tif formatında kaydedin.
  2. Yoğunluğu, tüm punkta dahil olmak üzere 8×8 piksel karedeki yoğunluğun toplamı olarak hesaplayın ve 8 x 8 piksellik karenin yakınında aynı boyuttaki bir alanda arka planın yoğunluğunu çıkararak arka planı kaldırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

DNA Perdelerinin şeması Şekil 1A, Şekil 1B ve Şekil 1D'de gösterilmiştir. GGAA'nın 25 kesintisiz tekrarını içeren klonlanmış hedef dizisi, Ewing sarkomundaki NORB1 promotöründe bulunur. Bu hedef dizisi EWS-FLI1 işe alım28 için çok önemlidir. EWS-FLI1 molekülleri, 561 nm lazer ile elde edilen mCherry etiketli EWS-FLI1 sinyalleri tespit edilerek görselleştirildi (Şekil 1C ve Şekil ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tek moleküllü yaklaşımlar reaksiyon sisteminin içeriğine karşı son derece hassas olduğundan, DNA Perdeleri deneyleri sırasında, özellikle bölüm 1 ve 2'de hazırlanan lipitler ve bölüm 5'te kullanılan tamponlar olmak üzere tüm malzemelerin ve çözeltilerin iyi kalitede olmasını sağlamak için ekstra çaba harcanmalıdır. Tamponları hazırlamak için daha yüksek saflıkta reaktifler kullanılmalı ve tamponlar tek moleküllü tahlil için taze hazırlanmalıdır.

500 nM mCherry etiketli EWS-FLI1 odaya yıkandığı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
488 nm diyot pompalı katı hal lazerTutarlıOBIS488LS
561 nm diyot pompalı katı hal lazerTutarlıOBIS561LS
AgarRhawnR003215-50g
biyotinile DOPEAvanti870273P
Sığır Serumu AlbüminSigmaA7030
KloroformAmresco1595C027
Kaplama Electra 92Allresist GmbHAR-PC 5090.02İletken koruyucu kaplama
Deoksiribonükleaz I sığırSigmaD5139-2MG
DOPCAvanti850375P
DTTSigmaD9779
Cam lamelFisher Scientific12-544-7
Hellmanex IIISigmaZ805939-1EA
KClSigma60130
Lambda DNANEBN3013S
Lambda Ambalaj EkstraktlarıEpicentreMP5120
MgCl2SigmaM2670
NaClSigmas3014
NanoportIdexN-333-01
NheI-HFNEBR3131S
Nikon Ters MikroskopNikonEclipse Ti
NZCYM Et SuyuSigmaN3643-250G
PEG-2000 DOPEAvanti880130P-1G
PEG-8000Amresco25322-68-3
PMMA 200K, ETİL LAKTAT %4Allresist GmbHAR-P 649.04
PMMA 950K, ANİSOL 2%Allresist GmbHAR-P 672.02
Prime 95B Bilimsel CMOS kameraFOTOMETRİPrime95B
proteinaz KNEBP8107S
Silika cam slaytG.Finkenbeiner
Altı enjeksiyon vanasıIdexMXP9900-000
StreptavidinThermoS888ddH < sub > 2 < / sub>O ile seyreltilmiş
Şırınga pompasıHarvard AparatPompası11 Elit
T4 DNA LigazNEBM0202S
Tris tabanıSigmaT6066
XhoINEBR0146V
YOYO-1 İyodür (491/509)İnvitrojenY3601DMSO ile Seyreltilmiş

Kaynaklar

  1. Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
  2. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
  3. Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
  4. Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
  5. Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
  6. Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
  7. Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
  8. Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  9. Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
  10. Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).
  11. Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101(2009).
  12. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  13. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
  14. Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
  15. Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
  16. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  17. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  18. Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
  19. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  20. Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
  21. Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
  22. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  23. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
  24. Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491(2021).
  25. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  26. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  27. Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
  28. Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
  29. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  30. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  31. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
  32. Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  33. Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

DNA PerdeleriFaz AyrımıFüzyon OnkoproteinleriTranskripsiyon Faktörü KondensatlarıBiyomoleküler KondensatlarElektroforetik Mobilite KaymasıMikroakışkan Akış HücresimCherry Etiketlemesi
DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.