Yöntem makalesi

Y-27632 Kullanarak Birincil İnsan Dişeti Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/62978

⸱

6 Kasım 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regeneration, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 2Department of Orthodontics, School and Hospital of Stomatology, Cheeloo College of Medicine, Shandong University & Shandong Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration & Shandong Engineering Laboratory for Dental Materials and Oral Tissue Regeneration, 3Department of Stomatology, Shengli Oilfield Central Hospital, 4Department of Pediatric Surgery, Shengli Oilfield Central Hospital, 5Ningbo Stomatology Hospital of Savaid Stomatology School, Hangzhou Medical College

Bu makalede

Özet

Burada geleneksel yönteme Kaya inhibitörü Y-27632 eklenerek insan dişeti epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için değiştirilmiş bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem daha kolay, daha az zaman alıcıdır, kök hücre özelliklerini geliştirir ve hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için daha fazla sayıda yüksek potansiyelli epitel hücresi üretir.

Özet

Diş eti dokusu periodontal dokuları koruyan ve birçok oral fonksiyonda anlamlı roller oynayan ilk yapıdır. Diş eti epitel, özellikle periodontal dokunun onarımı ve yenilenmesinde diş eti dokusunun önemli bir yapısıdır. Diş eti epitel hücrelerinin işlevlerini incelemek, oral kusurları onarmak ve biyomalzemelerin uyumluluğunu tespit etmek gibi çok önemli bilimsel değere sahiptir. İnsan dişeti epitel hücreleri son derece farklılaştırılmış keratinize hücreler olduğundan, ömürleri kısadır ve geçişleri zordur. Şimdiye kadar, diş eti epitel hücrelerini izole etmenin ve kültürlemenin sadece iki yolu vardır, doğrudan eksplant yöntemi ve enzimatik bir yöntem. Bununla birlikte, doğrudan eksplant yöntemini kullanarak epitel hücreleri elde etmek için gereken süre daha uzundur ve enzymatic yöntemin hücre sağkalım oranı daha düşüktür. Klinik olarak, diş eti dokusunun kazanımı sınırlıdır, bu nedenle istikrarlı, verimli ve basit bir in vitro izolasyon ve kültür sistemine ihtiyaç vardır. Epitel hücrelerinin büyümesini seçici olarak teşvik edebilecek Rho ile ilişkili bir kinaz (ROCK) inhibitörü olan Y-27632'yi ekleyerek geleneksel enzimmatik yöntemi geliştirdik. Modifiye enzymatic yöntemimiz, geleneksel enzymatic yöntemin adımlarını basitleştirir ve doğrudan eksplant yöntemine ve enzymatic yönteme göre önemli avantajlara sahip olan epitel hücrelerinin kült verimliliğini arttırır.

Giriş

Periodontal dokuyu koruyan ilk hat savunma yapısı olan insan dişeti, sadece fiziksel ve kimyasal bir bariyer1değil, aynı zamanda bağışıklık yanıtlarına katılan ve bağışıklık bariyeri oluşturan farklı inflamatuar mediatör sınıflarını salgılar2,3. Diş eti epitel, periodontal dokunun onarımında ve yenilenmesinde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, diş eti epitelinin savunmasını ve bağışıklığını incelemek periodontitin oluşumunu, tanısını ve tedavisini anlamak için büyük öneme sahiptir. Diş eti epitel hücrelerinin insan dişeti dokusundan izolasyonu ve kültürü, diş eti epitelinin incelenmesi için gerekli ilk adımdır. Böyle bir prosedür, doku mühendisliği için tohum hücreleri üretmek, periodontal ilişkili hastalıkların in vitro modelleri ve periodontal kusurları onarmak için malzemeler gibi temel operasyonları gerektirir.

Primer diş eti epitel hücreleri düşük bölünme oranı in vitro4ile karakterizedir Araştırmacılar on yıllardır optimal bir izolasyon ve yetiştirme yöntemi aramaktadır. Bugüne kadar laboratuvarlarda primer diş eti epitel hücrelerini in vitro4,5elde etmek için iki farklı teknik, doğrudan eksplant yöntemi ve enzimatik bir yöntem yaygın olarak kullanılmaktadır. Doğrudan eksplant yöntemi, daha az miktarda doku örneğinin gerekliliği ve basit izolasyon prosedürü gibi avantajlara sahiptir, ancak daha uzun kültür süresi ve kontaminasyona yatkınlık dezavantajlarına sahiptir5. Enzimmatik yöntem gereken kültür süresini kısaltsa da, verimlilik nispeten düşüktür ve kullanılan enzimlere ve ortama bağlı olarak değişir. Kedjarune ve ark.6, alt kültürden önce (2 hafta) daha fazla zaman gerektiren doğrudan eksplant yönteminin, enzimatik yönteme kıyasla diş eti epitel hücrelerini kültlemede daha başarılı göründüğünü göstermiştir. Bununla birlikte, bu iki yöntemi karşılaştıran Klingbeil ve ark.7, enzmatik yöntemin oral epitel hücrelerinin birincil kültürleri için en iyi sonuçlara sahip olduğunu ve en kısa süre içinde (11.9 gün ile 14.2 gün) optimal hücre verimini elde etmenin mümkün olduğunu buldu.

Bu nedenle, oral epitel hücrelerinin izolasyonu ve kültürü için daha uygun ve etkili bir yöntem geliştirmek önemliydi4. Daha önce Rho ile ilişkili protein kinazının (ROCK) bir inhibitörü olan Y-27632'nin eklenmesinin, insan primer epidermal hücrelerinin ve keratinositlerin yetişkin cilt dokularından izolasyon prosedürünü basitleştirdiğini bildirdik8,9,10. Epidermal hücrelerin büyümesini ve verimini destekleyen ve epidermal hücrelerin büyümesini ve verimini destekleyen yeni bir şartlandırılmış aşılama ortamı olan G-medium'u geliştirdik8,9,10. Bu çalışmada G-medium ile Y-27632'yi birleştirerek diş eti epitel hücreleri için yeni bir serumsuz izolasyon ve kültür tekniği geliştirdik. Özünde, yöntemimiz geleneksel iki adımlı enzymatic yöntemin basitleştirilmesine dayanmaktadır, bu nedenle yeni yöntemimizi doğrudan explant yöntemiyle karşılaştırdık. Bu modifiye enzimatik yöntem, diş eti epitel hücrelerini diş eti dokusundan ayırmak için gereken süreyi önemli ölçüde kısaltır ve diş eti epitel hücrelerinin kültleme verimliliğini arttırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokolde kullanılan insan dokuları, Kurumun İnsan Araştırmaları Etik Kurulu yönergelerine göre Maksillofasiyal Cerrahi Anabilim Dalı'nda etkilenen dişlerin ekstraksiyonlarından atılan taze erişkin diş eti dokularıdır (Protokol No. GR201711, Tarih: 02-27-2017).

1. Hazırlıklar

  1. %3 penisilin/streptomisidin (P/S) ile desteklenmiş 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 15 mL tüplerde taze yetişkin dişeti dokularını toplayın ve dokuları 4 °C'de tutun.
    NOT: Dokuları eksizyondan sonra 24 saat içinde aşağıda ayrıntılı olarak belirtildiği gibi tedavi edin.

2. Reaktifleri ve kültür ortamını hazırlayın

  1. Yıkama solüsyonunun hazırlayın: %3 P/S. 50 mL PBS'yi 1,5 mL penisilin (100 U/mL) ve 1,5 mL streptomisilin (100 mg/L) ile karıştırın.
  2. 500 mL büyüme faktörü içeren ortam hazırlayın (G-medium olarak adlandırılır): %1 P/S içeren DMEM/F12 (3:1) ortamı, %2 B27 takviyesi, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 40 ng/mL fibroblast büyüme faktörü 2 (FGF2) ve 40 μg/mL mantar zonklama.
  3. Yeni yöntem için enzim sindirim çözeltileri hazırlayın: 50 mL DMEM'de 125 mg Dispase tozu ve 125 mg Tip I kollajenaz tozunu çözün.
    NOT: Tüm enzim çözeltilerini 0,22 μm süzgeçten filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
  4. Enzimamatik sindirimi nötralize etmek için ortamın 500 mL'sini hazırlayın: DMEM ortamında% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 P / S.

3. Doğrudan explant yöntemi

  1. Dişeti dokusu önksezisi
    1. Dişeti dokusunu 30 s için 5 mL% 75 etanol ile yıkayın. Ardından, 5 mL yıkama çözeltisi (adım 2.1) ile iki kez 5 dakika durulayın.
      NOT: Tüm yıkamaları 50 mm çapındaki hücre kültürü yemeklerinde gerçekleştirin.
  2. Diş eti epitel hücre kültürü
    1. Diş eti dokusunu 1 mm3 parçaya bölün ve 100 mm hücre kültürü kabına saçın. Kesme işlemleri için ince sivri forseps ve oftalmik makas kullanın.
    2. G-medium'u (adım 2.2) kültür yemeğine ekleyin. Ardından, kültür çanasını 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörde kuluçkaya yatırın. Her 24 saatte bir dokuları incelemek için ters bir mikroskop (40x) kullanın.
    3. Epitel hücreleri doku parçalarının etrafında 2-5 mm çapında yayıldığında diş eti doku parçalarını çıkarın. G-medium'u her 2-4 günde bir değiştirin.

4. Yeni modifiye enzymatic yöntem

  1. Dişeti dokusu önksezisi
    1. Bunun için, doğrudan explant yöntemi olan 3.1.1 adımı için açıklanan adımları izleyin.
  2. Diş eti dokusunun sindirimi
    1. Diş eti dokusunu iki sterilize bıçak ile yaklaşık <1 mm büyüklüğünde küçük parçalar halinde kesin. İki cerrahi bıçakla parçalama işlemini tekrarlayın.
    2. Diş eti doku parçalarını içeren 1,5 mL santrifüj tüpüne 1 mL 2,5 mg/mL dispaz + kollajenaz çözeltisi ekleyin ve ardından tüpü 37 °C'de bir inkübatörde 15-20 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Doku şeffaf ve flokülent olduğunda, sindirimi sonlandırmak için nötralizasyon çözeltisinin 1 mL'sini ekleyin. Çözeltiyi 10-15 kez yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Çözeltiyi 100 μm örgü filtreden geçirin.
    4. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj.
    5. Süpernatant çıkarın ve 10 mL büyüme faktörü içeren ortamda alttaki hücre peletini yeniden atın (adım 2.2). Hücre süspansiyonunu 100 mm hücre kültürü çanasına aktarın. Hücre kültürü yemeğine 10 μM Y-27632 ekleyin.
    6. %5 CO2 inkübatörde 37 °C'deki hücreleri kültüre edin. Eski G-medium'u her 2 günde bir taze G-medium ile değiştirin. 1. Gün ve 3.

5. Hücre geçişi

  1. Yemeği inkübatörden çıkarın, harcanan ortamı çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Her 100 mm'lik tabak için 2 mL% 0.05 tripsin ekleyin.
    NOT: Trypsin çözeltisi ile bulaşık tabanı arasında yeterli temas olduğundan emin olmak için yemeği çalkalayın.
  2. Sindirim işlemi için kabı 37 °C'de yaklaşık 5 dakika bir inkübatörde bırakın.
  3. Hücreleri incelemek ve çoğu hücrenin çanağın dibinden ayrıldığından emin olmak için bir mikroskop (40x) kullanın.
  4. Sindirimi durdurmak ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarmak için nötralizasyon çözeltisinin 2 mL'lik kısmını ekleyin. Pipet 10-15 kez yukarı ve aşağı. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj edin.
  5. Üstnatant yavaşça çıkarın. Hücreleri 10 mL G-medium ile yeniden biriktirin ve hücre sayısını sayın.
  6. Her 100 mm'lik yemeğe10 mL G-medium ve 10 μM Y-27632'de yaklaşık 1 x 10 6 hücre ekleyin.
  7. G-medium ve Y-27632'yi her 2 günde bir yenileyin. Hücreleri 1.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1, doğrudan eksplant yönteminin ve değiştirilmiş enzymatic yönteminin şematik diyagramını gösterir. Doğrudan eksplant yöntemi tüm süreç boyunca herhangi bir sindirim enzimi gerektirmez. Buna karşılık, geleneksel enzymatic yöntem genellikle epitel tabakasını alttaki fibroblast tabakasından ayırmak için dispaz ve kollajenaz olmak üzere iki sindirim enzimi kümesine ihtiyaç duyar ve daha sonra epitel hücrelerini süspansiyona serbest bırakmak için tripsin gerekir. Yeni yöntemimiz ayırma adı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Diş eti dokusu periodontal bütünlüğü ve sağlığı koruyan anahtar bir yapıdır. Dişeti epitel hücreleri periodontal dokunun onarımında ve yenilenmesinde önemli rollere sahiptir ve oral biyoloji, farmakoloji, toksikoloji ve oral mukoza eksiklikleri de dahil olmak üzere bilimsel araştırma ve klinik uygulamalarda ve ilgili alanlarda kullanılabilir18. Bu nedenle, oral epitel hücrelerini hasat etmek için istikrarlı ve verimli bir yöntem geliştirmek gerekir19. Birincil epitel hücrel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Bu çalışma, Shandong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (ZR2019ZD36) Anahtar Programı ve Shandong Eyaleti Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2019GSF108107) tarafından X.W.'ye desteklenmiştir; Shandong Eyaleti Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (2018GSF118240) J.G.'ye; Shandong Eyaleti Tıbbi ve Sağlık Bilim ve Teknoloji Geliştirme Projesi (2018WS163) Z.X.'ye ve Shandong Eyaleti Tıbbi ve Sağlık Bilim ve Teknoloji Geliştirme Projesi (2019WS045) J.S.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İsimlerKısaltmalar &
Yorumlar Kontes otomatik hücre sayacıŞangay Ruiyu Biyo-bilim & Teknoloji Co.Ltd.BBA0218ACOtomatik hücre sayımı
Hücre inkübasyonu içinCO2 İnkübatörüThermo Scientific51026333
Sorvall ST 16R SantrifüjThermo Scientific75004380Hücre santrifüjü
Hücre Kültürü KabıEppendorf30702115Hücre kültürü için
50 ml Santrifüj TüpüKIRGEN171003Hücre santrifüjlemesi için
1.5 ml mikrosantrifüj TüpleriKIRGEN190691JHücre sindirimi için
Hücre SüzgeciCorning dahil431792Hücre filtrasyonu
Fosfat tamponlu çözeltiSolarbio Life ScienceP1020-500Yıkama solüsyonu
DMEMThermo ScientificC11995500Nötralizasyon ortamının bileşeni
Tanımlanmış K-SFMÖmrü Teknolojiler10785-012Dişeti epitel ve nbsp; hücre kültürü ortamı
Penisilin StreptomisinThermo Scientific15140-122Antibiyotikler
Fetal Sığır SerumuBiyolojik Endüstriler04-001-1AC5Nötralizasyon ortamının bileşeni
%0.05 TripsinYaşam Teknolojileri25300-062HGGEPC'lerin ayrışması
için Seyreltme OrtamıYaşam Teknolojileri50-9701Kaplama matrisi için
DispaseGibco17105-041HGGEPC'lerin izolasyonu için
Kollajenaz Tip IYaşam Teknolojileri17100-017HGGEPC'lerin izolasyonu için
F12 Besin Karışımı, HamsLife Technologies31765035G-medium
B27 Takviyesi BileşeniYaşam Teknolojileri17504044G-orta
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences'ta341595G-ortamı
Y-27632'deGen ÇalışmasıIAD1011ROCK inhibitörü
FungizoneGibco15290026G-ortamı
EGF Rekombinant İnsan ProteiniGibcoPHG0311için Hazırlık G-ortamı
Hücre Sayma Kiti-8'debüyüme faktörüHücreproliferasyon testi içinCK04
Tavşan Anti-İnsan CK18Abcamab82254HGGEPC'lerin farklılaşma markörünü kontrol etmek için immünofloresan boyama için
Tavşan Anti-İnsan Sitokeratin10Abcamab76318HGGEPC'lerin farklılaşma belirtecini kontrol etmek için immünofloresan boyama için
Fare anti-insan VimentinHücre Sinyalizasyon Teknolojisi3390Dişeti fibroblastlarının immünofloresan boyaması için
Tavşan Anti-İnsan pan-ckBD550951HGGEPC'lerin tavşan anti-Ki67 Abcam'ın farklılaşma belirtecini kontrol etmek için immünofloresan boyama için
15580HGGEPC'lerin tavşan anti-p63'ünün farklılaşma markörünü kontrol etmek için immünofloresan boyama için
Biolegend619002HGGEPC'lerin farklılaşma markörünü kontrol etmek için immünofloresan boyama için
tavşan anti-p75NGFRAbcamab52987HGGEPC'lerin farklılaşma markörünü kontrol etmek için immünofloresan boyama için
büyüme faktörü büyüme faktörü Dojindo Moleküler Teknolojiler

Kaynaklar

  1. Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158(2019).
  2. Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Immunology. 43, 1264-1273 (2013).
  3. Bedran, T. B., Mayer, M. P., Spolidorio, D. P., Grenier, D. Synergistic anti-inflammatory activity of the antimicrobial peptides human beta-defensin-3 (hBD-3) and cathelicidin (LL-37) in a three-dimensional co-culture model of gingival epithelial cells and fibroblasts. PloS one. 9, 106766(2014).
  4. Sciezynska, A., et al. Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review. Experimental Dermatology. 28, 107-112 (2019).
  5. Bryja, A., et al. Overview of the different methods used in the primary culture of oral mucosa cells. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 33, 397-401 (2019).
  6. Kedjarune, U., Pongprerachok, S., Arpornmaeklong, P., Ungkusonmongkhon, K. Culturing primary human gingival epithelial cells: comparison of two isolation techniques. Journal of Cranio-Maxillo-Facial Surgery: Official Publication of the European Association for Cranio-Maxillo-Facial Surgery. 29, 224-231 (2001).
  7. Klingbeil, M. F., et al. Comparison of two cellular harvesting methods for primary human oral culture of keratinocytes. Cell and Tissue Banking. 10, 197-204 (2009).
  8. Qian, H., et al. One-step simple isolation method to obtain both epidermal and dermal stem cells from human skin specimen. Methods in Molecular Biology. 1879, 139-148 (2019).
  9. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12, 1251-1255 (2018).
  10. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2018).
  11. Lauer, G., Wiedmann-Al-Ahmad, M., Otten, J. E., Hubner, U. Immunohistochemical study during healing of free palatal mucosa grafts on plastic-embedded samples. Journal of Oral Pathology & Medicine: Official Publication of the International Association of Oral Pathologists and the American Academy of Oral Pathology. 30, 104-112 (2001).
  12. Locke, M., Hyland, P. L., Irwin, C. R., Mackenzie, I. C. Modulation of gingival epithelial phenotypes by interactions with regionally defined populations of fibroblasts. Journal of Periodontal Research. 43, 279-289 (2008).
  13. Shabana, A. H., Ouhayoun, J. P., Sawaf, M. H., Forest, N. Cytokeratin patterns of human oral mucosae in histiotypic culture. Archives of Oral Biology. 36, 747-758 (1991).
  14. Kasai, Y., et al. biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine. Regenerative Therapy. 4, 71-77 (2016).
  15. Oda, D., Dale, B. A., Bourekis, G. Human oral epithelial cell culture. II. Keratin expression in fetal and adult gingival cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 596-603 (1990).
  16. Guarino, M., Tosoni, A., Nebuloni, M. Direct contribution of epithelium to organ fibrosis: epithelial-mesenchymal transition. Human Pathology. 40, 1365-1376 (2009).
  17. Hatakeyama, S., Yaegashi, T., Takeda, Y., Kunimatsu, K. Localization of bromodeoxyuridine-incorporating, p63- and p75(NGFR)- expressing cells in the human gingival epithelium. Journal of Oral Science. 49, 287-291 (2007).
  18. Bayar, G. R., Aydintug, Y. S., Gunhan, O., Ozturk, K., Gulses, A. Ex vivo produced oral mucosa equivalent by using the direct explant cell culture technique. Balkan Medical Journal. 29, 295-300 (2012).
  19. Daniels, J. T., Kearney, J. N., Ingham, E. Human keratinocyte isolation and cell culture: a survey of current practices in the UK. Burns: Journal of the International Society for Burn Injuries. 22, 35-39 (1996).
  20. Carrel, A., Burrows, M. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. Journal of the American Medical Association. 55, 1379-1381 (1910).
  21. Rheinwald, J. G., Green, H. Formation of a keratinizing epithelium in culture by a cloned cell line derived from a teratoma. Cell. 6, 317-330 (1975).
  22. Oda, D., Watson, E. Human oral epithelial cell culture I. Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium. In Vitro Cellular & Developmental Biology: Journal of the Tissue Culture Association. 26, 589-595 (1990).
  23. Boyce, S. T., Ham, R. G. Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology. 81, 33-40 (1983).
  24. Guo, A., Jahoda, C. A. An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells. Experimental Dermatology. 18, 720-726 (2009).
  25. Smola, H., Krieg, T. The keratinocyte handbook. Irene, M., Leigh, E., Lane, B., Watt, F. M. 375, Cambridge University Press. FEBS Letters 311(1994).
  26. Shwetha, H. R., et al. Ex vivo culture of oral keratinocytes using direct explant cell culture technique. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology: JOMFP. 23, 243-247 (2019).
  27. Yin, J., Yu, F. S. Rho kinases regulate corneal epithelial wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 295, 378-387 (2008).
  28. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. The Journal of Clinical Investigation. 120, 2619-2626 (2010).
  29. Strudwick, X. L., Lang, D. L., Smith, L. E., Cowin, A. J. Combination of low calcium with Y-27632 rock inhibitor increases the proliferative capacity, expansion potential and lifespan of primary human keratinocytes while retaining their capacity to differentiate into stratified epidermis in a 3D skin model. PloS One. 10, 0123651(2015).
  30. Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin. Biomedical Reports. 3, 304-308 (2015).
  31. Rosin, F. C. P., et al. Keratin expression in gingival tissue and primary cultured gingival keratinocytes: Are there differences. Archives of Oral Biology. 117, 104780(2020).
  32. Wang, T., Kang, W., Du, L., Ge, S. Rho-kinase inhibitor Y-27632 facilitates the proliferation, migration and pluripotency of human periodontal ligament stem cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21, 3100-3112 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Primer H cre zolasyonuEnzimatik Y ntemROCK nhibit rDi Eti DokusuH cre K lt rDoku SindirimiKollajenaz SindirimiOral Rejenerasyon

İlgili makaleler