Bu protokol, hücre dışı vezikül (EV) boyutu, EV sayısı, EV fenotipi ve EV biyobelirteç kolokalizasyonunun çok seviyeli ve kapsamlı ölçümleri için tasarlanmış tek parçacıklı interferometrik yansıma görüntülemesi sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tek Parçacıklı İnterferometrik Yansıma Görüntüleme Bireysel Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Popülasyon Dinamiği
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre dışı veziküller (EV'ler), çoğu hücre tarafından salgılanan bir lipid çift tabakasına sahip nanometre boyutunda veziküllerdir. EV'ler, protein, lipid, DNA ve RNA dahil olmak üzere çok sayıda farklı biyolojik molekül taşır ve çeşitli doku ve organlarda hücreden hücreye iletişimi kolaylaştırdığı varsayılır. Son zamanlarda, EV'ler çeşitli hastalıklar için tanı ve tedavi ajanları için biyobelirteçler olarak büyük ilgi görmüştür. EV karakterizasyonu için birçok yöntem geliştirilmiştir. Bununla birlikte, EV analizi için mevcut yöntemlerin hepsinin farklı sınırlamaları vardır. Bu nedenle, EV izolasyonu ve karakterizasyonu için verimli ve etkili yöntemler geliştirmek, olgunlaştıkça bu son teknoloji araştırma alanı için çok önemli adımlardan biri olmaya devam etmektedir. Burada, saflaştırılmamış biyolojik kaynaklardan EV'leri ve diğer metodolojilerle saflaştırılmış EV'leri tespit edebilen ve karakterize edebilen bir yöntem olarak tek parçacıklı interferometrik yansıma görüntüleme sensörünü (SP-IRIS) özetleyen ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu gelişmiş teknik, EV boyutu, EV sayısı, EV fenotipi ve biyobelirteç kolokalizasyonunun analizi için çok seviyeli ve kapsamlı ölçümler için kullanılabilir.
Giriş
Hücre dışı veziküller (EV'ler), kan, anne sütü, tükürük, idrar, safra, pankreas suyu ve beyin omurilik ve periton sıvıları dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik sıvıdan izole edilebilen, hücresel kökenli nanometre boyutunda zar vezikülleridir. EV'lerin türetilmesi üç ana mekanizma ile gerçekleşir: apoptoz, multiveziküler cisimlerin plazma zarı ile füzyonu yoluyla salınması ve plazma zarınınkanaması 1. Donör hücre bileşenlerinin komşu veya uzak hücrelere ve dokulara EV transferine ilişkin kanıtlar, bu zarla çevrili paketlerin parakrin ve uzun mesafeli veya endokrin sinyal kaskadlarında önemli roller oynayabileceğini düşündürme....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Serum örnekleri, Kansas Üniversitesi Tıp Merkezi (KUMC) protokolünde onaylanmış bir Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitelerine (IACUC) göre farelerden toplandı. Bu biyolojik örneklerin bu deneylerde kullanılması KUMC tarafından da onaylanmıştır.
1. Numune hazırlama (1. Gün)
- Nanopartikül izleme veya eşdeğer bir teknik kullanarak EV konsantrasyonunu belirleyin.
- Numuneyi inkübasyon çözeltisi ile 5 x 107-5 x 108 EVs/mL konsantrasyona seyreltin; minimum 50 μL gereklidir.
NOT: EV konsantrasyonunun bilinmediği numuneler için, 1 μg/mL'deki toplam protein ikame ölçü olarak kullanı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 7 (sol panel), çip üzerindeki CD63 noktasına bağlı ve sırasıyla yeşil, kırmızı ve mavi kanallarda CD81, CD63 ve CD9 için boyanmış HEK293 koşullu ortamdan türetilen EV'lerin üç renkli bir kompozit görüntüsünü göstermektedir. Şekil 7 (sağ üst panel), yakalanan EV'lerin her birinin, her kanalda değişen yoğunluklarda bir veya daha fazla rengin birlikte lokalizasyonunu görüntüleyebildiğini gösteren yakınlaştırılmış bir görüntüdür. Yakalanan EV'lerin boyanmasınd.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Mevcut EV karakterizasyon yöntemleri, büyük ölçüde, EV saflaştırma yöntemlerinin 9,10,11,12,13 mevcut deneysel sınırlamaları ile kısıtlanan saflaştırılmış EV'lere dayanmaktadır. Tek parçacıklı interferometrik yansıma görüntüleme (SP-IRIS), numune analizi için gereken saflaştırma adımlarını ortadan kaldırabilen ve böylece zaman.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Clayton Deighan ve George Daaboul, NanoView Biosciences, Inc.'in çalışanları ve hissedarlarıdır.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen Kansas Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma Ekipmanı ve Kaynak Tedarik Ödül Programı tarafından desteklenmiştir. PCG, LKC, FD ve AR, NIA R21 AG066488-01'den sağlanan fonlarla desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10 cm steril Petri kabı | Fisher | FB0875712 | |
| 15 mL steril tüp | n/a | çeşitli | |
| 24 oyuklu hücre kültürü plakası, düz tabanlı | Fisher | 08-772-1 | |
| Engelleme Çözümü | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | , ExoView'da bulunabilir İnsan Tetraspanin Kit. |
| Chipfiles | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | , ExoView İnsan Tetraspanin Kitinde bulunabilir. |
| Chips | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | , ExoView İnsan Tetraspanin Kitinde bulunabilir. |
| Chuck | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | , ExoView İnsan Tetraspanin Kitinde bulunabilir. |
| Corning Easy Grip Tek Kullanımlık Polistiren Steril Şişeler 250 ml | Fisher | 09-761-4 | |
| Corning Easy Grip Tek Kullanımlık Polistiren Steril Şişeler 500 ml | Fisher | 09-761-10 | |
| Deiyonize (DI) su | Fisher | LC267404 | |
| Karbon Fiber uçlu EMS tarzı cımbız | Fisher | 50-193-0842 | |
| ExoView İnsan Tetraspanin Kiti | hCD81, hCD9, hCD63, IgG için NanoView Biosciences EV-TETRA-C Yakalama hEV-A için + lekeler (hEV-CD63-647, hEV-CD81-555, hEV-CD9-488) Kit başına 16 çip | ||
| ExoView R100 Görüntüleyici | NanoView Biosciences | EV-R100 | 3 renkli floresan ve etiketsiz hücre dışı vezikülleri boyutlandırma ve sayma içeren yüksek özellikli kamera içeren interferometrik mikroskop |
| Floresan etiketli huma CD9 IgG antikoru | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | ExoView İnsan Tetraspanin Kitinde bulunabilir. |
| Floresan etiketli insan CD63 IgG antikoru | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | , ExoView İnsan Tetraspanin Kitinde bulunabilir. |
| Floresan etiketli insan CD81 IgG antikoru | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | , ExoView İnsan Tetraspanin Kitinde bulunabilir. |
| Kuluçka Çözümü | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | , ExoView İnsan Tetraspanin Kitinde bulunabilir. |
| 500 rpm'de sallayabilen dijital ayarlara sahip orbital çalkalayıcı veya mikroplaka çalkalayıcı | n/a | çeşitli | |
| Plaka Contası | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | , ExoView İnsan Tetraspanin Kitinde bulunabilir. |
| Çözüm A: | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | , ExoView İnsan Tetraspanin Kitinde bulunabilir. |
| Çözüm B | : NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | ExoView İnsan Tetraspanin Kitinde bulunabilir. |
| Çözüm C | : NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | , ExoView'da bulunabilir. İnsan Tetraspanin Kit. |
| Çözüm D | NanoView Biosciences | EV-TETRA-C | , ExoView İnsan Tetraspanin Kitinde bulunabilir. |
| Kare/düz uçlu cımbız | Fisher | 50-239-62 | |
| Düz güçlü nokta Boley tarzı cımbız | Fisher | 16-100-124 | |
| Termo Bilimsel Yapıştırıcı PCR Plaka Contaları | Fisher | AB-0558 |
Kaynaklar
- Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular vesicles: Unique intercellular delivery vehicles. Trends in Cell Biology. 27 (3), 172-188 (2017).
- Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New E....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
