Yetişkin sivrisinek tükürük bezi (SG), virüsler ve parazitler de dahil olmak üzere sivrisinek kaynaklı tüm patojenlerin insan konakçılarına iletilmesi için gereklidir. Bu video, SG'lerin larva (L4) evresi Anopheles gambiae sivrisineklerinden verimli bir şekilde izole edilmesini ve daha fazla analiz için L4 SG'lerin hazırlanmasını göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Anopheles gambiae Sivrisineklerinden Larva Tükürük Bezlerinin Diseksiyonu ve İmmünasyon
Bu makalede
Özet
Özet
Sivrisinek tükürük bezleri (SG'ler), böcek kaynaklı patojenlerin iletimi için gerekli bir ağ geçidi organıdır. Virüsler ve sıtmaya neden olan Plazmodium parazitleri de dahil olmak üzere hastalık neden olan ajanlar, SG hücrelerinin salgı boşluklarında birikir. Burada, sonraki bir kan unu sırasında omurgalı konaklarına iletilmek üzere hazırlanırlar. Yetişkin bezleri, erken pupal SG histolizinin ötesinde devam eden larva SG kanal tomurcuk kalıntılarının bir detaylandırılması olarak oluştuğundan, larva SG, hastalık bulaşmasını sınırlayan müdahaleler için ideal bir hedeftir. Larva SG gelişimini anlamak, morfolojisinin ve fonksiyonel adaptasyonlarının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilir ve bu organı hedefleyen yeni müdahalelerin değerlendirilmesine yardımcı olabilir. Bu video protokolü, Anopheles gambiae sivrisineklerinden larva SG'lerini izole etmek, sabitlemek ve lekelemek için etkili bir teknik göstermektedir. % 25 etanol çözeltisinde larvalardan parçalanan bezler, metanol-buzul asetik asit karışımına sabitlenir ve ardından soğuk aseton yıkama. Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde birkaç durulamadan sonra, SG'ler SG eksprese proteinlerine karşı çok çeşitli işaret boyaları ve / veya antisera ile boyanabilir. Larva SG izolasyonu için bu yöntem in situ hibridizasyon analizi, diğer transkriptomik uygulamalar ve proteomik çalışmalar için doku toplamak için de kullanılabilir.
Giriş
Sıtma, 2019'da yaklaşık 230 milyon enfeksiyona ve tahmini 409.000 ölüme neden olan büyük bir halk sağlığıtehdididir 1. Ölümlerin çoğunluğu Sahra altı Afrika'dadır ve parazit Plasmodium falciparumböcek vektörü Anopheles gambiae, bu video gösterisinin konusudur. Rakamlar yüzyılın başlarından bu yana yıllık ölüm oranında önemli bir düşüşe işaret etse de (>300.000 daha az yıllık ölüm), 2000'den 2015'e kadar gözlenen hastalık oranlarındaki umut verici düşüşler sivriliyor ve bu da hastalık bulaşmasını sınırlamak için yeni yaklaşımlara ihtiyaç olduğunu gösteriyor2. Sıtmayı kontrol etmek ve muhtemelen ortadan k....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Çözümlerin ve araçların hazırlanması
- Diseksiyon çözeltisinin hazırlanması
- Diseksiyon çözeltisi hazırlamak için, 15 plastik bir tüpte 7,5 mL damıtılmış H2O'ya% 100 etanol 2,5 mL ekleyin. Karıştırmak için tüpü 3 kez ters çevirin.
NOT: Bu çözelti birkaç hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir.
- Diseksiyon çözeltisi hazırlamak için, 15 plastik bir tüpte 7,5 mL damıtılmış H2O'ya% 100 etanol 2,5 mL ekleyin. Karıştırmak için tüpü 3 kez ters çevirin.
- 10x fosfat tamponlu salin (PBS) stoğunun hazırlanması
- 10x PBS stoğu hazırlamak için 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4, 80 g NaCl ve 2 g KCl ila 800 mL deiyonize su ekleyin. Katı maddeler tamamen çözünene kadar bir karıştırma plakası üzerinde....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tükürük bezlerinin tüm aşama 4 larvalardan parçalanmaları nispeten kolaydır. Erkek ve dişi larvalar geç L4 larva aşamasında dişilerin sırt toraksı boyunca kırmızı bir şeritle ayırt edilebilir, ancak erkeklerin değil (Şekil 2). Ayrıca, anten morfolojisinin erkekte dişi L4 larvalarına göre çok daha ayrıntılı olduğunu gözlemliyoruz (Şekil 2), yetişkin sivrisineklerde bu yapıda gözlenen farklılıklara benzer. L4 aşamasındaki önemli genel büyümenin yanı sıra, tükürük .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan protokol bir Drosophila SG diseksiyon protokolünden ve yetişkin sivrisinek diseksiyon protokolü14 , 15,16'dan uyarlanmıştır. Bununla birlikte, çoğu belirteç yetişkin diseksiyonu ve SG boyama yöntemlerini kullanırken bodrum zarını (gösterilmeyen veriler) nüfuz etmedi. Yetişkin protokolünün uyarlamaları arasında bezlerin% 25 EtOH çözeltisinde parçalanması, bezlerin MeOH ve buzul asetik asit kombinasyonu ile yıkanm.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü'ne An. gambiae larvalarına erişip yetiştirdiği için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 &boğa; 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Aseton | Millipore Sigma | 179124 | |
| Yumuşak kıllı | Amazon (SN NJDF) Detay Boya Fırçası Seti | B08LH63D89 | |
| Kapak fişleri (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Etil alkol 200 kanıt | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipet | Gilson | P200 | |
| Buzul Asetik Asit | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Kuyumcular forseps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Metanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Oje | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nil Kırmızısı (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Kağıt havlu/mendil | ULINE | S-7128 | |
| Petri plakası (macun plakası yapmak için) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipet Uçları | Gilson | Uçları E200ST | |
| Plastik Transfer | Pipeti Fisher Bilimsel | S304671 | |
| Primer antikorlar (örneğin, Crb, Rab11) | Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) veya Tavşan anti-Rab11 | |
| Floresan etiketli ikincil antikorlar (örneğin, Alexa Fluor 488 Keçi-anti Tavşan) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Macun plakası için silikon reçine ve sertleştirici madde | Dow Chemicals - Ximeter Silikon | PMX-200 | |
| Slaytlar, etiketleme için bir ucu buzlu | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Buğday Tohumu Aglütinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
Kaynaklar
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
