Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde ve İzole Kemik Şaftlarında Amino Asit Tüketiminin Değerlendirilmesi

Amino asitler, her amino aside özgü değişken bir yan zincire sahip bir amino (-NH₂) ve karboksil (-COOH) fonksiyonel grupları içeren organik bileşiklerdir. Genel olarak, amino asitler proteinin temel bileşeni olarak iyi bilinir. Daha yakın zamanlarda, amino asitlerin yeni kullanımları ve işlevleri açıklığa kavuşturulmuştur. Örneğin, bireysel amino asitler, biyoenerjetik maddelere katkıda bulunan, enzimatik kofaktörler olarak işlev gören, reaktif oksijen türlerini düzenleyen veya diğer amino asitleri sentezlemek için kullanılan ara metabolitler üretmek için metabolize edilebilir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Birçok çalışma, amino asit metabolizmasının çeşitli bağlamlarda hücre pluripotensi, proliferasyonu ve farklılaşması için kritik olduğunu göstermektedir 3,6,11,12,13,14,15,16,17.

Osteoblastlar, Kollajen Tip 1 bakımından zengin hücre dışı kemik matriksini üreten ve salgılayan salgı hücreleridir. Kemik oluşumu sırasında yüksek oranda protein sentezini sürdürmek için, osteoblastlar sürekli bir amino asit arzı gerektirir. Bu talebi karşılamak için, osteoblastlar aktif olarak amino asitler edinmelidir. Bununla tutarlı olarak, son çalışmalar osteoblast aktivitesinde ve kemik oluşumunda amino asit alımının ve metabolizmasının önemini ortaya koymaktadır 15,16,17,18,19,20.

Osteoblastlar hücresel amino asitleri üç ana kaynaktan elde eder: hücre dışı ortam, hücre içi protein yıkımı ve de novo amino asit biyosentezi. Bu protokol, hücre dışı ortamdan amino asit alımının değerlendirilmesine odaklanacaktır. Amino asit alımını ölçmek için en yaygın yöntemler, radyoaktif etiketli (örneğin, ³H veya ¹⁴C) veya ağır izotop etiketli (örneğin, ¹³C) amino asitlere dayanır. Ağır izotopomer testleri, amino asit alımını ve metabolizmasını daha ayrıntılı ve güvenli bir şekilde analiz edebilir, ancak numunelerin hazırlanması ve türetilmesi bir gün sürdüğü için tamamlanması birkaç gün sürdüğü için tamamlanması daha fazla zaman alır ve numune sayısına bağlı olarak kütle spektrometresinde analiz etmek için birkaç gün sürer^21,22. Buna karşılık, radyoaktif etiketli amino asit alım analizleri aşağı akış metabolizması hakkında bilgilendirici değildir, ancak ucuz ve nispeten hızlıdır, deneyin başlangıcından itibaren 2-3 saat içinde tamamlanabilir^23,24. Burada, kültürlenmiş primer hücrelerde veya in vitro hücre hatlarında veya bireysel kemik şaftlarında radyoaktif işaretli amino asit alımını değerlendirmek için tasarlanmış kolayca değiştirilebilir bir temel protokolü ex vivo olarak tanımlamaktayız. Bu iki protokolün uygulanması, diğer radyoaktif etiketli amino asitlere ve diğer kemikle ilişkili hücre tiplerine ve dokularına genişletilebilir.

Burada açıklanan tüm fare prosedürleri, Dallas'taki Teksas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi'ndeki Hayvan Çalışmaları Komiteleri tarafından onaylanmıştır. Radyasyon protokolü, Dallas'taki Teksas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi'ndeki Radyasyon Güvenliği Danışma Komitesi tarafından onaylandı.

1. Hücrelerde amino asit alımı (Protokol I)

1. Plaka 5 x 10⁴ ST2 hücreleri 12 kuyucuklu bir doku kültür plakasının her bir kuyucuğunda. α-MEM'deki plaka hücreleri% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 0.1 μg / mL streptomisin (Pen / Strep) içerir. Adım 1.12'deki normalleştirmeler için koşul başına hücre sayısını ölçmek için hücrelerin ekstra kuyucuklarını plakalayın. Nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründeki hücreleri% 5 CO 2 ile 37 ° C'de_{inkübe edin}.
2. Hücreleri birleşene kadar 2-3 gün boyunca kültürleyin.
3. Deney gününde, aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: 1x Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuz (PBS), pH 7.4 ve Krebs Ringers HEPES (KRH) tamponu, pH 8.0: (120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl₂, NaHCO₃, 5 mM HEPES, 1 mM D-Glikoz). 37 °C'ye kadar ısıtın.
4. Ortamı aspire edin ve hücreleri 1 mL 1x PBS, pH 7.4 ile iki kez yıkayın.
   NOT: Bu protokol, akıcı olmayan hücreleri hızla bölmek için de uygundur. Bu durumda, radyoaktiviteyi mutlak hücre sayısına veya DNA içeriğine normalleştirmek önemlidir. Ek olarak, genel hücre sayısını ve cpm değerlerini artırmak için kültür plakasının veya şişenin boyutunu artırmayı düşünün. Bu, bireysel olarak ampirik olarak belirlemek için önemlidir.
5. 1x PBS'yi aspire edin ve hücreleri 1 mL KRH ile bir kez yıkayın.
6. 1 mL KRH başına 4 μL [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-Glutamin stoğu seyrelterek 4 μL [^3,4-3H]^-Glutamin çalışma ortamı yapın.
   NOT: Radyoaktif malzemeleri kullanmadan önce, onay almak için lütfen kendi kurumunuzdaki Radyasyon Güvenliği Ofisi ile iletişime geçin. Radyasyonla ilgili tüm prosedürler pleksiglas kalkanın arkasında yapılmalıdır.
7. 4 μCi/mL L-[3,4-3 H]-Glutamin çalışma ortamı içeren 0,5 mL KRH içeren hücreleri 5 dakika boyunca inkübe edin.
8. Radyoaktif ortamı toplayın ve sıvı atık kabına dağıtın. Reaksiyonu sonlandırmak için hücreleri buz gibi soğuk KRH ile üç kez kısaca yıkayın. Tüm yıkamaları radyoaktif sıvı atık kabında toplayın ve atın.
9. Her bir kuyucuğa 1 mL% 1 SDS ekleyin ve hücreleri lize etmek ve homojenize etmek için 10x'i tritüre edin. Hücre lizatlarını 1.5 mL tüplere aktarın. Hücre kültürü plakalarını, serolojik pipetleri ve pipet uçlarını katı radyoaktif atık kabına atın.
10. 10 dakika boyunca >10.000 x g'de santrifüj. Süpernatantları, 8 mL sintilasyon çözeltisi içeren sintilasyon şişelerine aktarın. Parıltılı şişeleri kuvvetlice sallayarak karıştırın. Tüpleri ve pipet uçlarını katı radyoaktif atık kabına atın.
11. Bir Scintillation sayacı kullanarak radyoaktiviteyi dakika başına sayım (cpm) cinsinden okuyun. Parıltılı şişeleri sintilasyon şişesi atık konteynerine atın.
12. Lised, radyoaktif kültürlerdeki hücre sayısını tahmin etmek için hücrelerin kalan radyoaktif olmayan plakalarından hücreleri tripsinize edin, yeniden askıya alın ve sayın (bkz. adım 1.1). Bir hemositometre kullanarak, her deneysel durum için radyoaktif olmayan kuyu başına düşen hücre sayısını sayın. CPM'yi adım 1.11'den radyoaktif olmayan plakalardan tahmini hücre numarasına normalleştirin.
13. Deneyin tamamlanmasından sonra, hücre kültürü başlığını, tezgahı ve tüm aletleri radyoaktivite dekontaminant spreyi ile dekontamine edin. Son olarak, çalışma alanının radyasyonsuz olduğundan emin olmak için silme testleri yapın.

2. Yeni izole edilmiş kemik dokularında amino asit alımı (Protokol II)

1. KRH'yi 37 ° C'ye kadar ısıtın.
2. 3 günlük bir fareyi ötenazi yapın ve kollardaki cildi çıkarın. Humeriyi omuzdan makas kullanarak parçacıklayın ve her iki humeri'yi de parçalara ayırın. Bir neşter ve forseps kullanarak tüm çağdaş dokuları çıkarın. Epifizleri kemikten çıkarın.
   NOT: Humerii'ye ek olarak, bu protokol yenidoğan femora, tibiae ve calvariae'nin yanı sıra 2 ve 4 aylık farelerden izole edilen humerii, femora ve tibiae'ye uyarlanabilir (yayınlanmamış veriler).
3. Kemik iliğini kemikten temizleyin ve adım 2.14'te normalleştirmek için kemik şaftlarını tartın.
4. Kemiği desellülarize etmek için 100 ° C'de 1x PBS'de bir humerusu 10 dakika kaynatın. Desellülarize haşlanmış kemik negatif kontrol olarak kullanılır.
   NOT: Bir kalite kontrol olarak, parafin, kaynatmanın kemiğin hücreden arındırılmasında etkili olduğunu görsel olarak doğrulamak için histolojik lekeler için kaynamış ve kaynatılmamış kemikleri gömer.
5. Her iki humeri'yi de 37 ° C'de hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca 1 mL KRH'de dengeleyin.
6. 1 mL KRH başına 4 μL 1μCi/μL L-[2,3,4-3 H]- Arginin stoğunu seyrelterek KRH'de 4 μCi/mL L-[^2,3,4-3H]-Arginin çalışma çözeltisi yapın.
   NOT: Bu protokol, hangi radyo-etiketli besin maddesinin seçildiğini değerlendirmek için uygundur. L-[2,3,4-3 H]-glutamin, L-[¹⁴C_U]-alanin ve L-[2,3-3 H]-prolin benzer sonuçlarla test edilmiştir. Arginin verilerinin bu protokolün faydasını vurguladığı gösterilmiştir.
   DİKKAT: Radyasyon kullanan tüm prosedürler, uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanılırken pleksiglas kalkanın arkasında yapılmalıdır.
7. Hem deneysel hem de haşlanmış kontrol kemiğini 4 μCi/mL L-[2,3,4-3 H]-Arginin içeren KRH'de ^ayrıayrı 37 °C'de 90 dakikaya kadar inkübe edin.
   NOT: Bir zaman kursu gerçekleştirerek, farelerin yaşı, farklı iskelet elemanları ve radyoaktif işaretli amino asit türleri de dahil olmak üzere farklı koşullar için kuluçka sürelerini ampirik olarak belirlemek önemlidir. Doygunluk çoğunlukla yaklaşık 3-4 saat sonra ortaya çıkar. Alım, alımın doğrusal öfkesindeki bir zaman noktasında değerlendirilmelidir.
8. Radyoaktif ortamı çıkarın ve sıvı radyoaktif atık kabına atın. Reaksiyonu sonlandırmak için humeri'yi buz gibi soğuk 1 mL KRH kullanarak üç kez yıkayın. Tüm yıkamaları sıvı radyoaktif atık kabına atın.
9. Her kemiği 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. 500 μL RIPA tamponu ekleyin [150 mM NaCl; 5 mM EDTA; 50 mM Tris (pH 8.0); %0.5 NP40 (v/v); %0.5 DOX (w/v); %0.1 SDS (w/v)]. Kültür plakalarını, serolojik pipetleri ve pipet uçlarını radyoaktif katı atık kabına atın.
10. Bir RIPA tamponunda makasla 100 kez doğrayarak humeri'yi homojenleştirin.
11. Sonicate (Genlik:% 35, Darbe 1 s) 10 s için ortaya çıkan homojenize kemik.
    NOT: Sonication ayrıca aerosol üretmek için bilinir. Sonication adımları biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilebilir. Aerosol oluşumunu azaltmak için, tüpleri fazla doldurmamak önemlidir. Küçük numune hacimlerinin sonikasyonu, köpüklenme nedeniyle eksik sonikasyon veya numune kaybına neden olabilir. Köpüklenme meydana gelirse, numuneyi yerleşmesi için 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
12. Lizatı oda sıcaklığında >10.000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile netleştirin. Süpernatantın 200 μL'sini, 8 mL sintilasyon çözeltisi içeren sintilasyon şişelerine aktarın. Parıltılı şişeleri kuvvetlice sallayarak karıştırın. Tüm katı radyoaktif atıkları (ör. kullanılmış tüpler, pipet uçları, plakalar vb.) katı radyoaktif atık kabına atın.
13. Scintillation sayacını kullanarak radyoaktiviteyi (cpm) okuyun. Kullanılmış parıltı şişelerini, parıltı şişeleri için belirlenmiş radyoaktif atık kabına atın.
14. Kaynamış kemiğin cpm'sini (bazal değer) deneysel kemiğin cpm'sinden çıkarın. Radyoaktiviteyi adım 2.3'ten itibaren kemik ağırlığı ile normalleştirin.
15. Hücre kültürü başlığını, aletleri ve tezgahı radyoaktivite dekontaminantı ile püskürtün. Çalışma alanının radyasyonsuz olduğunu doğrulamak için silme testleri gerçekleştirin.

Amino asit taşınması, substrat özgüllüğü, kinetik ve iyon ve pH bağımlılığı25 dahil olmak üzere sayısız özelliğe dayanan farklı taşıma sistemlerine kategorize edilmiş birçok membrana bağlı amino asit taşıyıcısı tarafından düzenlenir. Örneğin, glutamin alımına Na + bağımlı taşıma sistemleri A, ASC, γ + L ve N veya Na + bağımsız Sistem L tarafından aracılık edilebilir. Na + bağımlı sistemler, Li + 'yı Na + (Sistem N) yerine koyma yeteneği veya amino asit analogu 2-(metilamino) izobütirik aside (MeAIB) (Sistem A) duyarlılık ile ayırt edilir. Bu deneyin amacı, her taşıma sistemine atfedilebilecek glutamin tüketimi miktarını tanımlamaktı. L-[3,4-3 H] glutamin alımı, 120 mM NaCl içeren normal KRH, 120 mM Kolin klorür içeren Na + serbest KRH, 5 mM MeAIB içeren normal KRH veya 120 mM LiCl içeren Na + serbest KRH'de akan ST2 hücrelerinde ölçülmüştür. Toplam radyoaktivite (dakika başına sayım) hücre sayısına normalleştirildi. Na + çıkarılması, glutamin alımında% 90 azalmaya yol açtı. Bu, Sistem L'nin glutamin alımının% 10'unu oluşturduğunu, glutamin alımının% 90'ının ST2 hücrelerinde Na + bağımlı olduğunu göstermiştir (Şekil 2). Li + 'nın varlığı, Na + serbest duruma kıyasla glutamin alımını sadece% 2 arttırırken, 5 mM MEAIB glutamin alımını etkilemedi. Bu veriler, glutamin alımının çoğunluğunun Sistem ASC ve γ + L tarafından aracılık edildiğini, Sistem N ve Sistem A'nın ise sırasıyla Na + bağımlı glutamin alımının kabaca% 2 ve% 0'ından sorumlu olduğunu göstermektedir.

Protokol I'i, kemik şaftlarında ex vivo amino asit alımını karakterize etmek için değiştirdik. Bu deneyde, 3 günlük (p3) farelerden izole edilmiş uzun kemiklerde arginin alım kinetiğini karakterize etmek için Protokol II'yi izledik. Bunu yapmak için, önce her iki humeri'yi de p3 farelerinden disseke ettik. Epifizler çıkarıldı ve kemik iliği döndürüldü ve her humerus normalizasyon için tartıldı. Kontralateral humerus negatif kontrol olarak belirlendi ve hücresel aktiviteyi öldürmek için kaynatıldı. Deneysel ve haşlanmış humeri daha sonra radyoetiketli 4μCi / mL L-[2,3,4-3 H]-Arginin ile 2 saate kadar inkübe edildi. Arginin alımı bu deney boyunca doğrusal bir şekilde artmıştır (Şekil 3A). Karşılaştırma için, haşlanmış humeri bu deneyde arginin alımında dinamik bir artış göstermedi, bunun yerine kemik matrisindeki probun adsorpsiyonuna atfedilen bazal bir radyoaktiviteye sahipti. Normalleştirilmiş ve düzeltilmiş arginin alımı Şekil 3B'de gösterilmiştir.

Şekil 1: Radyoişaretli amino asit alım tahlillerinin iş akışı. Amino asit alım tahlillerine şematik genel bakış in vitro (Protokol I) ve in bones ex vivo (Protokol II). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: ST2'de L-[3,4-3 H]-Glutamin alımının in vitro kinetik özellikleri. (A) L-[3,4-3 H]-ST2 hücrelerinde sodyum (Na+), MeAIB veya lityum (Li+) varlığında (+) veya yokluğunda (-) yapılan glutamin alım tahlilleri. (B) Sistem A, N, L veya ASC ve γ + L'nin glutamin alımına tahmini katkılarının yüzdesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Ex vivo L-[2,3,4-3 H]-Yenidoğan humerisinde arginin alımı. (A) L-[2,3,4-3 H]-Argininalımı, 3 günlük C57BL/6 farelerden izole edilen canlı ve haşlanmış humeride 2 saatlik bir süre boyunca gerçekleştirilir. (B) Normalleştirilmiş L-[2,3,4-3 H]-Haşlanmış humeri ile Arginin alımı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.