Bu protokol, birincil hücrelerde veya izole kemiklerde amino asit tüketimini değerlendirmek için yararlı olan radyoişaretli bir amino asit alım testi sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde ve İzole Kemik Şaftlarında Amino Asit Tüketiminin Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Kemik gelişimi ve homeostazı, kemik oluşturan osteoblastların farklılaşmasına ve aktivitesine bağlıdır. Osteoblast farklılaşması sırasıyla proliferasyon, ardından protein sentezi ve nihayetinde kemik matriksi sekresyonu ile karakterizedir. Proliferasyon ve protein sentezi, sürekli bir amino asit kaynağı gerektirir. Buna rağmen, osteoblastlarda amino asit tüketimi hakkında çok az şey bilinmektedir. Burada, radyoaktif etiketli amino asitleri kullanarak amino asit tüketimini ölçmek için tasarlanmış çok hassas bir protokolü açıklıyoruz. Bu yöntem, osteoblast proliferasyonu veya farklılaşması, ilaç veya büyüme faktörü tedavileri veya çeşitli genetik manipülasyonlarla ilişkili amino asit alımındaki değişiklikleri ölçmek için optimize edilmiştir. Önemli olarak, bu yöntem kültürlenmiş hücre hatlarında veya primer hücrelerde in vitro veya izole kemik şaftlarında ex vivo amino asit tüketimini ölçmek için birbirinin yerine kullanılabilir. Son olarak, yöntemimiz amino asitlerin herhangi birinin, glikozun ve diğer radyoaktif etiketli besin maddelerinin taşınmasını ölçmek için kolayca uyarlanabilir.
Giriş
Amino asitler, her amino aside özgü değişken bir yan zincire sahip bir amino (-NH2) ve karboksil (-COOH) fonksiyonel grupları içeren organik bileşiklerdir. Genel olarak, amino asitler proteinin temel bileşeni olarak iyi bilinir. Daha yakın zamanlarda, amino asitlerin yeni kullanımları ve işlevleri açıklığa kavuşturulmuştur. Örneğin, bireysel amino asitler, biyoenerjetik maddelere katkıda bulunan, enzimatik kofaktörler olarak işlev gören, reaktif oksijen türlerini düzenleyen veya diğer amino asitleri sentezlemek için kullanılan ara metabolitler üretmek için metabolize edilebilir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan tüm fare prosedürleri, Dallas'taki Teksas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi'ndeki Hayvan Çalışmaları Komiteleri tarafından onaylanmıştır. Radyasyon protokolü, Dallas'taki Teksas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi'ndeki Radyasyon Güvenliği Danışma Komitesi tarafından onaylandı.
1. Hücrelerde amino asit alımı (Protokol I)
- Plaka 5 x 104 ST2 hücreleri 12 kuyucuklu bir doku kültür plakasının her bir kuyucuğunda. α-MEM'deki plaka hücreleri% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 0.1 μg / mL streptomisin (Pen / Strep) içerir. Adım 1.12'deki normalleştirmeler için koşul başına hücre sayısını ölçmek i....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Amino asit taşınması, substrat özgüllüğü, kinetik ve iyon ve pH bağımlılığı25 dahil olmak üzere sayısız özelliğe dayanan farklı taşıma sistemlerine kategorize edilmiş birçok membrana bağlı amino asit taşıyıcısı tarafından düzenlenir. Örneğin, glutamin alımına Na + bağımlı taşıma sistemleri A, ASC, γ + L ve N veya Na + bağımsız Sistem L tarafından aracılık edilebilir. Na + bağımlı sistemler, Li + 'yı Na + (Sistem N) yerine koyma yeteneği veya a.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan protokol, in vitro veya ex vivo çeşitli deneysel permütasyonlara yanıt olarak amino asit alımını değerlendirmek için hızlı ve hassas bir yaklaşım sağlar. Ticari olarak temin edilebilen kitlerle (örneğin, Glutamin ve Glutamat Belirleme Kiti) karşılaştırıldığında, bu yöntem çok daha hassas, daha hızlı ve daha az emek yoğun16,17,25'tir. Protokolümüzde, Krebs Ringers HEPES tamponundaki alımı değerl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların herhangi bir açıklaması yoktur.
Teşekkürler
Karner laboratuvarı, C.M.K.'ya Ulusal Sağlık Enstitüsü R01 hibeleri (AR076325 ve AR071967) tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.25 tripsin | Gibco | 25200 | |
| 12 oyuklu plaka | Corning | 3513 | |
| 1 mL şırınga | BD hassas | 309628 | |
| 30G İğne | BD hassas | 305106 | |
| Arginin Monohidroklorür L- [2,3,4-3H] -, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 sintilasyon sayacı | |||
| Kalsiyum klorür | Sigma | C1016 | |
| Kolin klorür | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glikoz çözeltisi | Sigma | G8769 | |
| Diseksiyon Aleti | Forseps, makas, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Etilendiamintetraasetik asit | Sigma | E9884 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630 | |
| L- [3,4-3H (N)] -Glutamin | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Sıvı sintilasyon şişeleri | Sigma | Z190535 | |
| Lityum klorür çözeltisi, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnezyum klorür | Sigma | M8266 | |
| MEM ve alfa; | Gibco | 12561 | |
| Mikrosantrifüj tüpü, 15 mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 Sigma | 492016 | ||
| Potasyum klorür | Sigma | P3911 | |
| Sodyum bikarbonat | Sigma | S6014 | |
| Sodyum klorür | Sigma | S9888 | |
| Sodyum Deoksikolat | Sigma | D6750 | |
| Sodyum dodesil sülfat | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic& Malzemeler | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Sintilasyon çözeltisi) | PerkinElmer | 6013329 | |
| &alfa;- (Metilamino)izobütirik asit | Sigma | M2383 |
Kaynaklar
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
