Sivrisinek Aedes aegypti'de Yüksek Çözünürlüklü Eriyik Analizi Kullanarak CRISPR/Cas9 Mutagenesis'i Takip Eden Indel Tespiti

^Dang1, ^Zika2 ve chikungunya3 virüsleri gibi patojenlerin vektörleri ve sıtma ^parazitleri4 olarak, sivrisinekler insanlar için önemli bir halk sağlığı tehdidini temsil eder. Tüm bu hastalıklar için, sivrisinek vektörlerinin kontrolüne önemli bir bulaşma müdahalesi odağı vardır. Örneğin, patojenlere izin verme, sivrisinek zindeliği, hayatta kalma, üreme ve insektisitlere karşı dirençte önemli genlerin incelenmesi, yeni sivrisinek kontrol stratejileri geliştirmek için anahtardır. Bu amaçlar için, sivrisineklerde genom düzenleme, özellikle HE'ler, ZFN'ler, TALEN'ler ve en son CAS9 ile CRISPR gibi teknolojilerin geliştirilmesiyle yaygın bir uygulama haline gelmektedir. Gen düzenlemeli suşların kurulması tipik olarak hedef dışı ve kurucu (darboğaz) etkileri en aza indirmek için birkaç nesil boyunca istenen mutasyonları taşıyan bireylerin geriye doğru geriye doğru dönmesini ve ardından homoziöz veya trans-heterozipöz çizgiler oluşturmak için heterozipöz bireyleri geçmeyi içerir. Baskın bir belirtecin yokluğunda, moleküler genotipleme bu süreçte gereklidir, çünkü çoğu durumda heterozipöz mutantlar için net fenotipik özellikler tespit edilemez.

Sıralama genotipik karakterizasyon için altın standart olmasına rağmen, bunu yüzlerce veya muhtemelen binlerce bireyde gerçekleştirmek, özellikle sivrisinekler gibi kısa ömürlü organizmalar için kritik olan sonuç elde etmek için gereken önemli maliyetler, emek ve zaman oluşturur. Surveyor nükleaz tahlil5 (SNA), T7E1 tahlil6 ve yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA, ⁱⁿ⁷) yaygın olarak kullanılan alternatiflerdir. Hem SNA hem de T7E1, yalnızca eşleşmeyen tabanları ayıran endonucleases kullanır. Heterozygous mutant genomunun mutasyona uğramış bir bölgesi yükseltildiğinde, mutant ve vahşi tip alellerden dna parçaları, eşleşmeyen çift iplikli DNA (dsDNA) yapmak için tavlanır. SNA, uyumsuzlığa özgü bir endonokleaz ve basit agarose jel elektroforezi ile sindirim yoluyla uyuşmazlıkların varlığını tespit eder. Alternatif olarak, HRMA, dsDNA bağlayıcı floresan boyalar tarafından tespit edilen dsDNA'nın termodinamik özelliklerini kullanır ve boyanın ilişkiden çıkarma sıcaklığı mutasyonun varlığına ve türüne bağlı olarak değişir. HRMA, tek nükleotid polimorfizmlerinin (SNP'ler)⁸, zebra balıklarının mutant genotiplemesinin^, mikrobiyolojik ^{uygulamaların10} ve bitki genetik araştırmalarının tespiti için ^{kullanılmıştır11}.

Bu makalede, CRISPR/Cas9 teknolojisi tarafından üretilen mutant sivrisinekler için basit bir moleküler genotipleme yöntemi olan HRMA açıklanmaktadır. HRMA'nın alternatif tekniklere göre avantajları arasında 1) esneklik, çeşitli genler, çok çeşitli indel boyutlarının yanı sıra farklı indel boyutları ile heterozipöz, homozigot ve trans-heterozygöz farklılaşma arasındaki ayrım için yararlı olduğu kanıtlanmıştır12,13,14, 2) maliyet, yaygın olarak kullanılan PCR reaktiflerine dayandığı için ve 3) zaman kazandıran, sadece birkaç saat içinde gerçekleştirilebileceği için. Ek olarak, protokol DNA kaynağı olarak küçük bir vücut parçası (bacak) kullanır, sivrisineklerin genotipleme işleminden kurtulmasını sağlar, mutant hatlarının kurulmasına ve bakımına izin verir.

1. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler), HRMA astar tasarımı ve astar doğrulaması için tarama

1. Vahşi tip laboratuvar koloni sivrisineklerinde SNP tanımlaması
   1. Uygun polipeptid çevirisini bozmak için hedef eksonunu seçin.
      NOT: Hedef başlangıç kodonuna yakın veya protein fonksiyonu için gerekli anahtar kalıntılar arasında olmalıdır. Ekson ne kadar kısa olursa (örneğin, ≤200 baz), hedeflemek ve analiz etmek o kadar zordur. Bir eksonun sınırlarına yakın düzenleme yapmaktan kaçının, çünkü bu, HRMA astarlarından birini bir intron'dan geçmeye veya bir intronda olmaya zorlar. Bu istenmeyen bir durumdur, çünkü SNP oranları bu bölgelerde çok daha büyük olma eğilimindedir.
   2. Astar tasarımı
      1. NCBI Blast - Primer Blast web sitesine ^gidin15, seçilen ekson kopyalayıp sayfanın üst kısmındaki kutuya yapıştırın | PCR ürün boyutunu seçin (dış denetimin çoğunu kapsadığından emin olun) | organizmayı seçin.
      2. Gelişmiş parametreler | tıklayın Tercih edin (PCR Ürün Tm için) ve 60 ekleyin (60 °C optimum sıcaklık için) | Primers'ı getir. Diğer parametreleri varsayılan olarak saklayın.
   3. Vahşi tip laboratuvar kolonisinden genomik DNA (gDNA) elde edin. 10 sivrisinek ayır, _CO2 ile uyuşturun ve hareketsiz tutmak için buz üzerinde bir Petri kabına yerleştirin. Dokudan DNA salınımı için reaktifin 0,5 μL'si ve 20 μL seyreltme tamponu içeren 10 tüp kurun, her ikisi de Malzeme Tablosunda önerilen DNA serbest bırakma kitinde sağlanmıştır.
   4. Forseps kullanarak tek bir sivrisinekten bir bacağı çıkarın ve DNA salınımlı reaktifin seyreltilmiş bir çözeltisinin ilgili tüpüne yerleştirin (adım 1.1.3'ten itibaren), bacağı çözeltiye tamamen batırın. Bu adımı kalan sivrisineklerle tekrarlayın, bir sonrakine geçmeden öncepsleri% 70 etanol ile silin.
   5. Bacak içeren çözeltiyi oda sıcaklığında 2-5 dakika, daha sonra 98 °C'de 2 dakika kuluçkaya bırakın ve PCR reaksiyonlarını ayarlarken soğumasını bekleyin.
      NOT: Serbest bırakılan gDNA'yı içeren plakalar -20 °C'de saklanabilir ve protokol bu noktada duraklatılabilir.
   6. 10 μL 2x PCR Master Mix içeren 10 tüp, 0,5 μM son konsantrasyona astarlar ve 20 μL'lik son hacme moleküler dereceli su hazırlayın ve seyreltilmiş numunenin 1 μL'sini her tüpe aktarın. Bu döngü parametrelerini izleyerek PCR gerçekleştirin: 98 °C 5 dk, 5 s için 98 °C 40 döngü, 60 °C 30 s, kb başına 72 °C 20 s; 1 dakika boyunca 72 °C'nin son uzantısı.
   7. Artık PCR astarlarını bozmak ve fazla dNTP'leri veya herhangi bir kolon temizleme kitini defosforilasyona düşürmek için PCR ürünlerini bir enzimle arındırın. Örnekleri sıralamaya devam edin.
   8. Çift tepe/belirsiz bazların varlığı için her elektroferogramı analiz edin ve uygun dejenere baz kodunu kullanarak her sırada temel çağrıları manuel olarak ayarlayın.
      NOT: Bu adım, temel çağıran yazılımın SNP'lerin yokluğunun yanlış izlenimini veren "gerçek" temel çağrı olarak daha belirgin tepeyi seçmesi yaygın olduğundan, birden çok sıra hizalamadan önce gerçekleştirilmelidir.
   9. Malzeme Tablosunda listelenen SeqMan Pro hizalama yazılımını veya ClustalW16 veya T-Coffee17 gibi diğer açık kaynaklı hizalama yazılımlarını kullanarak birden çok sıra hizalama gerçekleştirin.
      1. Hizalama yazılımı | Sıra Ekle | tıklayın istediğiniz sıraları seçin ve Ekle'ye tıklayın| tüm diziler seçildikten sonra Bitti'ye tıklayın.
      2. Hizalamayı gerçekleştirmek için Birleştir'i tıklatın. Hizalamayı açmak için Contig 1'e tıklayın ve hizalamayı analiz edin ve SNP'leri tanımlayın (Şekil 1).
         NOT: 1.1.3-1.1.6 adımlarına alternatif olarak, PCR toplu örneklerden elde edilen izole genomik DNA'dan yapılabilir (>10 kişiden türetilir). Sıralı ampliconlar doğrudan elektroferogramda çift tepe noktası olarak görünen SNP'lerin varlığı için analiz edilebilir, ancak nadir SNP'lerin tespit edilmesi daha zor olacaktır.
   10. Yukarıda tanımlanan herhangi bir SNP içeren bölgeleri, ^18'de açıklanan protokolü izleyerek önleyen 3-5 tek kılavuz RNA'sı (sgRNA) tasarlayın.
2. HRMA astar tasarımı
   1. ^mFold19 kullanarak PCR sırasında ikincil yapıların olası oluşumu için ekson sırasını test edin.
      1. UNAFold Web Sunucusu | gitme mFold | tıklayın açılır menüsünde Uygulamalar | DNA Katlama Formu.
      2. Sıra adını kutuya girin ve dış işlemi yapıştırın.
      3. Katlama sıcaklığını 60 °C'ye değiştirin; Ionic koşullarında[ Mg⁺⁺] öğesini 1,5 olarak değiştirin ve Birimler mM'ye geçin; Fold DNA'ya tıklayın.
      4. Çıktı'da, Yapı 1'in altında, Dairesel Yapı Çizimlerini açmak için pdf'ye tıklayın.
   2. Astar tasarımı için NCBI Blast - Primer ^Blast15'e gidin.
   3. Sayfanın üst kısmındaki kutuya, 1.1 adımında (en düşük sayıda SNP içeren veya SNP içermeyen sıra) sıralanarak belirlenen seçili ekson sırasını kopyalayıp yapıştırın.
   4. SNP'leri, hedef siteyi ve olası ikincil yapı oluşumuna sahip bölgeleri içeren dizileri işaretlemek ve dışlamak için sembol < > kullanın.
   5. PCR ürün boyutunu 80 ila 150 bp arasında olacak şekilde seçin ve organizmayı seçin.
      NOT: Daha büyük parça boyutları başarıyla kullanılabilir (~300 bp). Ancak, daha uzun ampliconlar bir veya sadece birkaç baz çiftte farklı diziler arasındaki duyarlılığı azaltabilir.
   6. Primer Al'a tıklayın. Test edilecek 2-3 astar çifti seçin (ideal olarak, astar siteleri ≥20-50 bp uzaklıktadır.
3. Astar doğrulaması
   1. Tek bir kişiden gDNA kullanarak degrade PCR gerçekleştirin.
      1. Ana karışım hazırlayın ve şablon olmayan denetim (NTC) için ayrı bir tüpte bir örneği çıkarın. Şablonu kalan ana karışıma ekleyin ve 96 kuyulu bir tabağa aliquot ekleyin.
      2. Bisiklet parametrelerini izleyin: 98 °C 30 s, 10 s için 98 °C 34 döngü, 55-65 °C 30 s, 72 °C 15 s; 10 dakika boyunca 72 °C'lik son uzatma.
      3. Parametreleri izleyerek termal eriyik profilleri oluşturun: 1 dakika boyunca denatürasyon adımı 95 °C, 1 dakika boyunca 60 °C tavlama, 0,2 °C artışlarla 75 °C ile 95 °C arasında erime eğrisi algılama, her sıcaklıkta 10 s tutma süresi.
         NOT: Sadece tek bir termal eriyik profiline sahip tavlama sıcaklıkları kullanılmalıdır.
4. ^12'de açıklandığı gibi embriyo enjeksiyonları ile mutant çizgilerini üretmeye devam edin.

2. Sivrisinek bacaklarından genomik DNA hazırlanması

1. _G1 sivrisineklerini pupal aşamasında cinsiyete göre ayırın, böylece genotiplemeden önce çiftleşmezler ve yaşla eşleşen, vahşi tip kontrol sivrisineklerinin referanslar ve geri dönüşler için kullanılacağından emin olun. Aynı şekilde seks ayır.
2. Gerekli malzemeleri toplayın (Şekil 2A) ve genotipli olmak için kişi başına 0,5 μL DNA salınım reaktifi ve 20 μL seyreltme tamponu (gDNA serbest bırakma kitinden) ile 96 kuyu PCR plakası hazırlayın ve buz üzerinde bırakın. NTC için iki reaksiyon ayır.
3. Sivrisinek şişeleri (Drosophila şişeleri) için bir tepsi etiketleyin, böylece 96 plakadaki her kuyu tepsideki ilgili sivrisinek şişesine karşılık gelir.
4. _G1 sivrisineklerini _CO2 ile uyuşturun ve yatıştırıcı tutmak için cam bir Petri kabına yerleştirin (Şekil 2C, D). Anestezi edin ve 8 yabani tip sivrisinekleri ikinci bir Petri kabına yerleştirin.
5. Bir çift cımbızı% 70 etanol ile silin ve sivrisinek arka ayaklarından birini çıkarın (Şekil 2E, F).
6. Bacağı DNA salınımlı reaktif çözeltisine batırın, sivrisinekleri ilgili şişeye yerleştirin ve bir süngerle kapatın (Şekil 2G, H).
7. Cımbızı tekrar% 70 etanol ile silin ve bacağı bir sonraki sivrisinekten çıkarmaya devam edin. 96 kuyu plakası tamamlanana kadar 2,5-2,7 arası adımları yineleyin.
   NOT: Cımbızı% 70 etanol ile silmek önemlidir. Bu, DNA çapraz kontaminasyonlarını en aza indirir.
8. Plakayı optik pcr plaka contası (Şekil 2I) ile kapatın ve bacakları oda sıcaklığında (RT) içeren 96 kuyu plakasını 2-5 dakika ve ardından 98 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatırın. PCR karışımını hazırlarken plakanın RT'ye soğumasını bekleyin.
   NOT: Tüm işlem genellikle 3-4 saat sürer. Sivrisineklerin beklenen süreden (özellikle ≥1 gün) daha fazla süre şişelerde tutulması gerekiyorsa, uzun kuluçkalar sırasında sivrisineklerin hayatta kalmasını sağlamak için her sivrisinekle küçük bir parça kuru üzüm (veya şeker ve su kaynağı) yerleştirin.

3. HRMA

1. PCR gerçekleştirin.
   1. Her reaksiyon başına aşağıdaki bileşenleri içeren bir ana karışım hazırlayın: 10 μL 2x tampon (gDNA serbest bırakma kitinden), her astarın 0,5 μM'si, EvaGreen boyasının 1 μL'si, 0,4 μL polimeraz (gDNA serbest bırakma kitinden) ve moleküler dereceli su ile 19 μL'ye kadar tamamlayın.
   2. Çok kanallı bir pipet kullanarak, ana karışımın 19 μL'lik kısmını her kuyuya aktarın. Bölüm 2'de hazırlanan sivrisinek DNA'sını içeren DNA salınım çözeltisinin 1 μL'lik kısmını plakaya aktarın (Şekil 3A). Plakayı optik PCR plaka contası ile kapatın.
   3. PCR'yi bisiklet parametrelerini izleyerek gerçekleştirin: 5 dakika için 98 °C, 10 s için 98 °C'nin 39 döngüsü, 30 s için seçilen tavlama sıcaklığı (72 °C); 2 dakika boyunca son uzatma 72 °C.
2. Parametreleri izleyerek termal eriyik profilleri oluşturun: 1 dakika boyunca denatürasyon adımı 95 °C, 1 dakika boyunca 60 °C tavlama, 0,2 °C artışlarla 75 °C ile 95 °C arasında erime eğrisi algılama, her sıcaklıkta 10 s tutma süresi. CFX96 Gerçek Zamanlı Sistemi kullanılarak yürütülen HRMA için yazılım kurulumunun ayrıntılı açıklaması için Ek Malzeme ve Ek Şekil S1-S5'e bakın.
3. Eriyik profillerini inceleyin (Şekil 3B). Başvuru kümesine vahşi tür denetimi atayın.
   NOT: Yazılım ( bkz. Malzeme Tablosu) verileri otomatik olarak normalleştirir ve farklı erime eğrileri için renklerle kümeler belirler.
4. Farklı kümeleri 96 kuyulu şablonda karşılık gelen renklerle işaretleyin (Şekil 3C).
5. İlgi kıvrımları olan bireyleri seçin, tüplerden çıkarın ve geriye dönün (Şekil 3D). Çiftmiş dişileri kanla besleyin ve _G2 yumurtalarını toplayın.

4. Sanger dizileme ile sıra doğrulaması

1. PCR ürününü, artık PCR astarlarını bozmak için bir enzim kullanarak ve fazla dNTP'leri defosforilasyon yaparak seçilen sivrisineklerle (bölüm 3.1'de hazırlanan plakadan) kuyulardan arındırın. Alternatif olarak, herhangi bir sütun temizleme kiti kullanın ve örnekleri sıralamaya devam edin.
   NOT: PCR ürün boyutu küçük olduğunda (≤200 bp) doğrudan sıralama daha zor olabilir. Bu gibi durumlarda, hedef bölgeyi (≥250 bp) kapsayan daha büyük parçaları yükseltmek ve 96 kuyu plakasındaki DNA'yı kullanarak PCR ile yükseltmek için astarlar tasarlayın (adım 2.2).
2. İzleme görüntüleyici yazılımını kullanarak indelleri analiz edin ve tanımlayın (Şekil 4). Alternatif olarak, Poly Peak Parser ^software20 heterozygöz bireylerdeki mutasyonu tespit etmenize yardımcı olabilir.
   1. Poly Peak Parser web sitesine gidin, Gözat menüsündeki mutant bireylerden sırayı seçin ve referans sırasını kopyalayıp kutuya yapıştırın.
      NOT: Alternatif alel ve referans arasındaki hizalama otomatik olarak ekranın sağ tarafında görünecektir.

AaeZIP11 (putatif demir taşıyıcı21) ve miyo-fem (uçuş kaslarıyla ilgili kadın taraflı bir miyosin geni13) genlerinde mutasyon içeren sivrisinekler CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak, HRMA kullanılarak genotiplenmiş ve sırayla doğrulanmış olarak elde edilmiştir (Şekil 5). Şekil 5A ve Şekil 5C, sırasıyla AaeZIP11 ve myo-fem mutant örneklerinden hrm eğrilerinden normalleştirilmiş floresan yoğunluğunu ve vahşi tip kontrolleri göstermektedir. Şekil 4B ve Şekil 4D, her eğriyi vahşi tip referansından çıkardıktan sonra yazılım tarafından atanan farklı kümelerin eriyik profilleri arasındaki fark eğrilerinin (sırasıyla AaeZIP11 ve myo-fem mutant örneklerinden) büyütmesini göstermektedir. Heterozipöz ve homozigöz mutant AaeZIP11 bireyleri farklı kümelere yerleştirildi ve vahşi tip kontrollerden kolayca ayırt edildi (Şekil 5B). Heterozygöz mutant myo-fem bireyleri de kontrollerden farklıdır (Şekil 5D). Her iki durumda da, büyük olasılıkla hedef bölgede SNP'lerin varlığı nedeniyle vahşi tür denetimleri içinde iki küme bulunduğunu unutmayın (Şekil 5), SNP'ler önlenemediğinde denetimleri mutant olarak kategorize etmekten kaçınmak için birden çok denetim örneği kullanma gereğini vurgulamaktadır.

Şekil 4A , AaeZIP11 mutantının sıra analizini göstermektedir. AaeZIP11 heterozid mutantlarından alınan elektroferogram, indelin meydana geldiği nükleotid konumunu gösterir. Polimorfik pozisyonlar her iki nükleotidleri de birlikte göstereceğinden, bu tekten çift tepeye bir kayma ile temsil edilir (Şekil 4A). Dna iplikçiklerinden biri sırasıyla silinen veya eklenen taban çiftlerinin sayısına göre diğerinden daha kısa veya daha uzun olacağından, koşunun sonundaki tek tepeler sayılarak (Şekil 4B) silinen veya eklenen temel çiftlerin sayısı hesaplanır. Sonraki nesiller için HRMA analizlerine yardımcı olmak için heterozygotların tanımlanması için mutantlardan sırayla doğrulanmış gDNA kullanılması önerilir. Benzer eğriler otomatik olarak farklı kümelere atandığında eğriler için el ile atama gerekebilir. Bu, sıcaklık kaydırılan eğriler ve fark eğrileri karşılaştırılarak yapılabilir. Örnekleri kümelere düzgün bir şekilde atamak için yazılımın el ile ayarlanmasında gerekebilir. AaeZIP11 ve Aeflightin adlı bir mutanttan elde edilen HRMA sonuçları, heterozygotları, homozigotları ve trans-heterozygotları başarılı bir şekilde kategorize etmek için bireysel örnek analizlerine ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir. Başlangıçta, yazılımdan otomatik küme ataması gruplar arasında uygun bir ayrım yapamadı (Şekil 6A, Şekil 6C, Şekil 6E ve Şekil 6G). Daha sonra her örnek ayrı ayrı analiz edildi ve heterozygotlar, homozigotlar ve trans-heterozygotların (daha önce sıralama ile doğrulanmış) referans örneklerine benzerlik esas alınarak doğru gruplara atandı (Şekil 6B, Şekil 6D, Şekil 6F ve Şekil 6H).

Şekil 1: SNP tanımlaması. Vahşi türden AaeZIP11 parçasının birden çok sıra hizalamasının şematik gösterimi. Kırmızıda SNP'ler ve yeşilde SNP'lerden arındırılmış parçalar vardır; bu SNP'suz bölge sgRNA ve astar tasarımı için önerilir. Kısaltmalar: SNP = tek nükleotid polimorfizmi; sgRNA = tek kılavuz RNA; LVP = Liverpool gerginliği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: HRMA için sivrisinek bacaklarından genomik DNA elde etmek için deneysel prosedür. (A) Pipetler, uçlar, PCR plakası, optik conta, rezervuar, seyreltme tamponu ve DNA salınım çözeltisi dahil olmak üzere genomik DNA elde etmek için malzemeler. (B) DNA salınım reaktifi ve seyreltme tamponu içeren PCR plaka hazırlığı. (C) CO2 ile sivrisinek anestezisi. (D) Numuneler arasındaki kirlenmeyi önlemek için cımbızın p etanol ile silinmesi. (E) Cımbız, sivrisinek şişeleri için raf, uyuşturulmış sivrisineklerin bulunduğu bir buz kabının üzerine Petri kabı ve daha önce hazırlanmış PCR plakasını içeren deneysel kurulum. (F) Sivrisinek bacağının çıkarılması. (G) DNA salınım reaktif çözeltisine batırılmakta olan sivrisinek bacağının yakınlaştırma görünümü. (H) Şişeye yerleştirilen tek sivrisinek. (I) Sivrisinek bacaklarını içeren PCR plakasını kapatmak. Kısaltma: HRMA = yüksek çözünürlüklü eriyik analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İkM analizleri için deneysel prosedür. (A) Serbest bırakılan gDNA'yı PCR karışımını içeren 96 kuyulu bir tabağa aktarın. (B) Fark eğrilerinin görsel incelemesi. (C) 96 kuyulu şablondaki her örneği ilgili fark eğrisi rengiyle aynı renkle işaretlemek. (D) Aynı kümedeki bireyleri ters acrossing. Kısaltmalar: HRM = yüksek çözünürlüklü erime; gDNA = genomik DNA. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: AaeZIP11 mutantının sıra analizi. (A) AaeZIP11Δ56 mutantının nükleotid hizalaması. Sarı ile vurgulanan tireler silinen tabanlardır. Kutuda, elektroferogram tek tepelerden çift tepelere geçiş yaparak silmenin gerçekleştiği konumu (ok) tasvir eder. (B) Sıralama koşusunun sonunun elektroferogramı ve çift tepelerden tek tepelere geçiş. Tek tepe sayısının silinen taban sayısını (gri dikdörtgen) temsil ettiğini unutmayın. Astar dizileri Ek Tablo S1'de verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Sivrisinek bacaklarından çıkarılan DNA'nın HRMA'sı. DNA, AaeZIP11 (A ve B) ve myo-fem (C ve D) nakavt Ae. aegypti sivrisineklerinden tek bir bacaktan çıkarıldı ve HRMA tarafından analiz edildi. A ve C , örneklerin normalleştirilmiş floresan sinyallerini 1,0 ila 0 göreli değerlerine gösterir. B ve D , her eğriyi vahşi tip referansından (Liverpool suşu) çıkararak eğri farklılıklarının büyütülmüş olduğunu gösterir. Kısaltmalar: HRMA = yüksek çözünürlüklü eriyik analizi; LVP = Liverpool gerginliği; RFU = göreli floresan üniteleri. Astar dizileri Ek Tablo S1'de verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: El ile grup atama örnekleri. (A-D) Aeflightin mutantları için HRMA. (A ve C) Eriyik eğrileri (sırasıyla normalleştirilmiş doğrusal ölçek eğrileri ve fark eğrileri) Hassas Eriyik Analiz Yazılımı tarafından otomatik olarak gruplandırılır. (B) Diferansiyel eğrilerin normalleştirilmesi manuel olarak değiştirilmiştir. (D) Diferansiyel eğrilerin normalleşmesini değiştirdikten sonra, her örnek, karşılık gelen pozitif kontroller için fark eğrilerindeki en yüksek sıcaklıklar tarafından ayrı ayrı atandı (daha önce Δ4 ve Δ5 heterozygotlar ve Δ4Δ5 trans-heterozygotlar tarafından tanımlanan sıralanmış numuneler), 3 grubun net tanımlanmasını sağladı. Farklı sıcaklıklarda zirveleri vurgulamak için kırmızı ve kahverengi oklar eklenir. (E-H) AaeZIP11 mutantları için HRMA. (E ve G) Eriyik eğrileri yazılım tarafından otomatik olarak atanır. (F ve H) İkinci heterozipöz kendinden çaprazdaki mutantlar, normalleştirilmiş ve fark eğrilerinin daha önce belirlenen referanslara benzerliği ile doğru gruplara uygun şekilde atanmıştır (eğrilerde renk kodlu). Heterozygotes asg, Homozygotes asg ve Trans-heterozygotes asg: Precision Melt Analysis Software tarafından atanan eriyik eğrileri. Kısaltmalar: HRMA = yüksek çözünürlüklü eriyik analizi; LVP = Liverpool gerginliği; RFU = göreli floresan üniteleri. Astar dizileri Ek Tablo S1'de verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Materyal: CFX96 Gerçek Zamanlı Sistemde HRMA'yı kurmak için ayrıntılı protokol (örneğin, Bio-rad).

Ek Şekil S1: Bio-rad CFX Manager'da bisiklet protokolünü ayarlamak için adım adım talimatlar. Bkz. Ek Malzeme 2.1-2.3. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S2: Bio-rad CFX Manager'da plaka kurulumu için adım adım yönergeler. Bkz. Ek Malzeme 3.1-3.4. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S3: Bio-rad CFX Manager'da plaka kurulumu için adım adım talimatlar. Bkz. Ek Malzeme 3.5-3.6. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S4: Bio-rad CFX Manager'da çalıştırma kurulumu için adım adım yönergeler. Bkz. Ek Malzeme 4.1. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil S5: Bio-rad CFX Manager'da HRMA analizi için adım adım talimatlar. Bkz. Ek Malzeme 5.1-5.3. Kısaltma: HRMA = yüksek çözünürlüklü eriyik analizi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S1: Astarların listesi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.