Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63013

⸱

27 Eylül 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, The University of British Columbia, 2Biochemistry and Molecular Biology, The University of British Columbia, 3Faculty of Medicine, The University of British Columbia

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, hızlı hücre yuvarlaması yapışması sırasında yapışma olaylarını görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testini gerçekleştirmek için deneysel prosedürleri sunar.

Özet

Selelin aracılı etkileşimlerle kolaylaştırılan yuvarlanan yapışıklık, lökositlerin iltihaplanma bölgesine alınmasında son derece dinamik, pasif bir hareketliliktir. Bu fenomen, kan akışının endotel hücreleri üzerinde yuvarlanan bir hareketle lökositleri ittiği postkapsiller venülelerde ortaya çıkar. Kararlı haddeleme, yapışma bağı oluşumu ile mekanik olarak tahrik edilen ayrışmaları arasında hassas bir denge gerektirir ve hücrenin akış yönünde yuvarlanırken yüzeye bağlı kalmasını sağlar. Nispeten statik ortamlarda meydana gelen diğer yapışma işlemlerinin aksine, yuvarlanan hücreler saniyede onlarca mikronda binlerce mikronun üzerinde hareket ettiği için yuvarlanan yapışma son derece dinamiktir. Sonuç olarak, çekiş kuvveti mikroskopisi gibi geleneksel mekanobiyoloji yöntemleri, gerekli kısa zaman ölçeği ve yüksek hassasiyet nedeniyle bireysel yapışma olaylarını ve ilişkili moleküler kuvvetleri ölçmek için uygun değildir. Burada, P-selectin: PSGL-1 etkileşimlerini moleküler düzeyde yuvarlanma yapışmasında görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testinin en son uygulamasını açıklıyoruz. Bu yöntem, floresan izleri şeklinde moleküler yapışma olaylarının kalıcı bir geçmişini üretmek için geri dönüşü olmayan DNA tabanlı gerilim ölçer tethers kullanır. Bu izler iki şekilde görüntülenebilir: (1) geniş bir görüş alanı oluşturmak için kırınım sınırlı binlerce görüntüyü bir araya getirmek, her yuvarlanan hücrenin binlerce mikron uzunluğundaki yapışma ayak izinin çıkarılmasını sağlamak, (2) floresan izlerinin süper çözünürlüklü görüntülerini küçük bir görüş alanı içinde yeniden oluşturmak için DNA-PAINT gerçekleştirmek. Bu çalışmada, farklı kesme gerilmelerinde yuvarlanan HL-60 hücrelerini incelemek için yapışkan ayak izi tahlili kullanılmıştır. Bunu yaparken, P-selectin: PSGL-1 etkileşiminin mekansal dağılımını görüntüleyebildik ve floresan yoğunluğu ile moleküler güçleri hakkında fikir edindik. Bu nedenle, bu yöntem moleküler düzeyde yuvarlanan yapışmada yer alan çeşitli hücre-yüzey etkileşimlerinin nicel olarak araştırılması için zemin hazırlar.

Giriş

Yuvarlanan yapışma kaskadı, dolaşımdaki hücrelerin kan damarı duvarına nasıl bağlı olduğunu ve yuvarlanmasını açıklar1. Pasif haddeleme öncelikle hücresel yapışma moleküllerinin (CAM)1 ana sınıfı olan selectinler tarafından aracılık edilir. Kanın kesme akışı altında, P-selectin glikoprotein ligand-1'i (PSGL-1) ifade eden lökositler, iltihaplı endotel hücrelerinin yüzeyinde ifade edilebilecek P-selectin ile oldukça geçici bağlar oluşturur. Bu işlem lökositlerin iltihaplanma bölgesine göç etmesi için kritik öneme sahiptir2. Buna ek olarak, PSGL-1 aynı zamanda P-selectin3 ile etkileşimi üzerine yuvarlanan yapışma basamaklamanın sonraki sıkı yapışma aşamasını tetikleyebilen bir mekanosensitive reseptördür.

CAM fonksiyonunu etkileyen genetik mutasyonlar, lökosit yapışma eksikliğinin (LAD) nadir görülen hastalığı gibi bağışıklık sistemini ciddi şekilde etkileyebilir, burada yuvarlanmaya aracılık eden yapışma moleküllerinin arızalanması ciddi şekilde bağışıklık sistemi baskılanmış bireylere yol açar4,5,6. Ek olarak, dolaşımdaki tümör hücrelerinin benzer bir yuvarlanma sürecini takiben göç ettiği ve metastaz7,8'e yol açtığına gösterilmiştir. Bununla birlikte, hücre haddeleme hızlı ve dinamik olduğundan, geleneksel deneysel mekanobiyoloji yöntemleri hücre yuvarlanması sırasında moleküler etkileşimleri incelemek için uygun değildir. Atomik kuvvet mikroskopisi ve optik cımbız gibi tek hücreli ve tek moleküllü manipülasyon yöntemleri, P-selectin'in PSGL-1 ile tek molekül seviyesinde kuvvete bağımlı etkileşimi9 gibi moleküler etkileşimleri inceleyebilebilirken, hücre yuvarlanması sırasında canlı yapışma olaylarını araştırmak için uygun değildir. Ek olarak, in vitro karakterize etkileşim, moleküler yapışma in vivo hakkındaki soruyu doğrudan cevaplayamaz. Örneğin, hücreler kendi ortamlarında çalışırken hangi moleküler gerilim aralığı biyolojik olarak ilgilidir? Yapışkan dinamiği simülasyonu10 veya basit sabit durum modeli11 gibi hesaplama yöntemleri, belirli moleküler ayrıntıları ve yuvarlanma davranışını nasıl etkilediklerini yakalamış, ancak modelleme parametrelerinin ve varsayımlarının doğruluğuna son derece bağlıdır. Çekme kuvveti mikroskopisi gibi diğer teknikler hücre göçü sırasında kuvvetleri tespit edebilir, ancak moleküler gerilim hakkında yeterli mekansal çözünürlük veya nicel bilgi sağlamaz. Bu tekniklerin hiçbiri, kendi ortamlarındaki hücre fonksiyonu ve davranışıyla doğrudan ilişkili olan moleküler kuvvetlerin zamansal dinamikleri, mekansal dağılımı ve büyüklük heterojenliği hakkında doğrudan deneysel gözlemler sağlayamaz.

Bu nedenle, selep aracılı etkileşimleri doğru bir şekilde ölçebilen bir moleküler kuvvet sensörü uygulamak, yuvarlanma yapışma anlayışımızı geliştirmek için çok önemlidir. Burada, PSGL-1 kaplamalı boncukların p-selectin fonksiyonelleştirilmiş gerilim ölçer tethers (TGTs)13 sunan bir yüzeye yuvarlandığı yapışkan ayak izi tahlil12 protokolünü açıklıyoruz. Bu TGT'ler, floresan okuma şeklinde kalıcı yırtılma olaylarının geçmişine neden olan geri dönüşü olmayan DNA tabanlı kuvvet sensörleridir. Bu, TGT'nin (dsDNA) yırtılması ve daha sonra yırtılan TGT'nin (ssDNA) floresan etiketli tamamlayıcı iplikçikle etiketlenerek elde edilir. Bu sistemin en büyük avantajlarından biri, hem kırınım sınırlı hem de süper çözünürlüklü görüntüleme ile uyumluluğudur. Floresan etiketli tamamlayıcı iplikçik, kırınım sınırlı görüntüleme için kalıcı olarak (>12 bp) veya DNA PAINT aracılığıyla süper çözünürlüklü görüntüleme için geçici olarak bağlanabilir (7-9 bp). Bu, TGT'ler aktif haddeleme sırasında yırtıldığı için yuvarlanma yapışıklıklarını incelemek için ideal bir sistemdir, ancak floresan okuma yuvarlanma sonrası analiz edilir. İki görüntüleme yöntemi ayrıca kullanıcıya yuvarlanan yapışıklıkları araştırmak için daha fazla özgürlük sağlar. Tipik olarak, kırınım sınırlı görüntüleme floresan yoğunluğu üzerinden moleküler yırtılma kuvveti çıkarmak için yararlıdır13, süper çözünürlüklü görüntüleme ise reseptör yoğunluğunun nicel analizine izin verir. Haddeleme yapışmasının bu özelliklerini araştırma yeteneği ile bu yaklaşım, yuvarlanan hücrelerin kesme akışı altında moleküler yapışması üzerindeki kuvvet düzenleme mekanizmasını anlamak için umut verici bir platform sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Oligonükleotid etiketleme ve hibridizasyon

  1. Protein G disülfid bağlarının azaltılması
    1. 10 mg Protein G'yi (ProtG) 1 mL ultra saf suda çözün.
      NOT: Buradaki Protein G, C-terminusta tek bir sistein kalıntısı ve N-terminus poli-histidin etiketi ile modifiye edilir.
    2. Tampon değişimi ≥20 μL ProtG (10 mg/mL) ile P6 sütunu ile 1x PBS (pH 7.2) içine.
    3. Tampon değişiminden sonra protein konsantrasyonunu ölçün.
      NOT: Tipik konsantrasyon 7-8 mg/mL.
    4. 3 mg TCEP'i 90 μL 1x PBS (pH 7.2) ve ardından 10 μL 0.5 M EDTA'ya eriterek 120 mM Tris (2-karboksit)fosfin (TCEP) hazırlayın.
      NOT: TCEP yeni hazırlanmalıdır.
    5. 20 μL ProtG'ye (4-5 nmol) 4 μL 120 mM TCEP (480 nmol) ekleyin.
      NOT: Proteine ~100:1 TCEP molar oranını hedefleyin.
    6. Reaksiyonun oda sıcaklığında (RT) 30 dakika devam etmesine izin verin.
    7. Bir P6 sütunu ile azaltılmış ProtG'den fazla TCEP çıkarın (tampon 1x PBS, pH 7.2 ile değiştirildi).
    8. Azaltılmış ProtG konsantrasyonunu bir UV/Vis spektrofotometre ile ölçün ve spektrumu kaydedin.
      NOT: Tipik konsantrasyon 3.5-4.5 mg/mL.
  2. Sulfo-SMCC ile amin etiketli ssDNA reaksiyon
    1. Amin etiketli ssDNA'yı (amin-ssDNA) nükleoz içermeyen suda 1 mM konsantrasyonda çözün. Uv/Vis spektrofotometre ile iplikçik konsantrasyonunu doğrulayın.
    2. Karıştırmak için 400 μL ultra saf su ve girdapta 2 mg sülfo-SMCC çözerek 11,5 mM sülfo-SMCC (sulfo-NHS ester ve maleimid ile hetero-bifunctional crosslinker) çözeltisini taze hazırlayın.
    3. 1 mM amin-ssDNA'nın (6 nmol) 6 μL'sini 11,5 mM sülfo-SMCC'nin (60 nmol) 5,2 μL'sine ve 88,8 μL'si 1x PBS'ye (pH 7,2) ekleyin. 5 sn için girdap ve ardından 3 dakika boyunca 8600 x g'da santrifüjleme.
    4. Tepkinin RT'de 30 dakika devam etmesine izin verin.
    5. P6 sütunu (tampon 1x PBS, pH 7.2 ile değiştirilir) ile SMCC konjuge amin-ssDNA'dan (mal-ssDNA) fazla sülfo-SMCC çıkarın.
    6. Mal-ssDNA konsantrasyonunu bir UV/Vis spektrofotometre ile ölçün ve spektrumu kaydedin.
      NOT: Tipik 35-45 μM konsantrasyon.
  3. ProtG-ssDNA konjugasyonu
    1. Mal-ssDNA'ya (~4-5 nmol) 21 μL 4,5 mg/mL azaltılmış ProtG (3 nmol) ekleyin.
      NOT: Buradaki hacimler ve konsantrasyonlar tipik değerlerdir. Bireysel deneysel ölçüme göre ayarlayın. Her zaman ~1,5:1 oranında ProtG üzerinde fazla miktarda mal-ssDNA sağlayın.
    2. 5 sn için girdap ve reaksiyonun RT'de 3 saat boyunca devam etmesine izin verin.
  4. ProtG-ssDNA saflaştırma ve karakterizasyon
    1. Konjuge ProtG-ssDNA'yı manyetik nikel-nitrilotrisetik asit (Ni-NTA) boncukları ile etiket izolasyonu yoluyla arındırın.
    2. P6 sütunu (tampon 1x PBS, pH 7.2 ile değiştirilir) ile üründen fazla imidazol (Ni-NTA elution tampon) çıkarın.
      NOT: Bu adım, imidazol 280 nm'de önemli emilime sahip olduğundan, konjugasyonu ölçmek için gereklidir.
    3. ProtG-ssDNA ürününün spektrumunu ve Ni-NTA elution tamponunu (1x) kaydetmek için bir UV/Vis spektrofotometre kullanın.
      NOT: Tipik ProtG-ssDNA absorbansı 260 nm ve 280 nm sırasıyla 0.8 ve 0.6'dır.
    4. ProtG'nin konjugasyon verimliliğini ve ssDNA'ya oranını belirlemek için, daha önce toplanan üç spektruma (ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA boncuk elüasyon tamponu) dayanarak nihai ürün spektrumunu ayrıştırmak için özel yazılmış MATLAB komut dosyasını (Ek Kodlama Dosyası 1) kullanın.
      NOT: Kısaca, kod 1.4.5-1.4.8 adımlarında açıklandığı gibi çalışır. Tipik konsantrasyon ~ 1:1 molar oranında ProtG ve ssDNA ile 4 μM ProtG-ssDNA'dır (Şekil 2A).
    5. MATLAB komut dosyasına ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA boncuk elution tamponu ve ProtG-ssDNA UV/Vis spektrumu girin
    6. ProtG-ssDNA spektrumunu kaynak spektrumdan (ProtG, SMCC-strand ve Ni-NTA boncuk elüasyon tampon spektrumu) yeniden oluşturmak için çok boyutlu sınırlandırılmamış doğrusal olmayan en aza indirme gerçekleştirin
      NOT: En aza indirme işlevi, her kaynak spektrumu için bir tane olmak üzere üç dönüştürme faktörü çıkışıdır.
    7. ProtG-ssDNA spektrumunu, spektrumu karşılık gelen faktörleriyle çarparak ve dönüştürülmüş kaynak spektrumunu birleştirerek yeniden yapılandırın.
    8. ProtG-ssDNA ürünündeki SMCC-strand ve ProtG konsantrasyonlarını belirlemek için ProtG ve SMCC-strand'ın ilk konsantrasyonlarını karşılık gelen dönüşüm faktörleriyle çarpın.
    9. (İsteğE BAĞLI) Her bileşenin ve adımın beklendiği gibi çalıştığından emin olmak için Şekil 2B'ye göre yerel PAGE'i çalıştırın.
  5. TGT hibridizasyonu
    1. Tam TGT konstrüktörlerini melezlemek için ProtG-ssDNA'yı (üst iplikçik) 1.2:1 molar oranında biyotinillenmiş alt iplikçikle, T50M5 tamponunda (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) sırasıyla 240 nM ve 200 nM konsantrasyonlarında hibridize edin. RT ≥1 h'de melezleme izin verin.

2. Yüzey Pegylation

  1. Yüzey temizliği
    1. Her 8 kapak için bir Erlenmeyer şişesi ve iki boyama kavanozu temizleyin. Her kabı 1 M KOH çözeltisi ile doldurun ve RT'de 1 saat boyunca sonicate yapın.
      NOT: Kapağına dokunmak için KOH'u en üste doldurun, böylece onlar da temizlenir.
    2. Her kapak kapağını ultra saf suyla iyice durulayın ve temizlenmiş boyama kavanozlarından birine yerleştirin.
      NOT: Birbirlerine veya boyama kavanozlarının duvarına yapışmadıklarından emin olun.
    3. Duman kaputunda, 250 mL'lik bir kabın içine 90 mL konsantre (%95-%98) sülfürik aside 30 mL hidrojen peroksit (%30) ekleyerek bir piranha çözeltisi hazırlayın.
      DİkKAT: Konsantre sülfürik asit oldukça aşındırıcıdır. Hidrojen peroksiti sülfürik aside çok yavaşça ekleyin ve karıştırmak için dikkatlice döndürün.
    4. Kapakları piranha çözeltisi ile boyama kavanozuna tamamen batırın. Piranha'da kapakları duman kaputunda 30 dakika bekletin.
      DİkKAT: Lekelenme kavanozu çatlamayı önlemek için dökmeden önce piranha çözeltisini en fazla 80 °C'ye soğutun.
    5. Piranha çözeltisini 1000 mL'lik bir kabın içine atın ve cam temizliğinden 1 M KOH ile nötralize edin.
    6. (İsteğE BAĞLI) Piranha temizliğini (adım 2.1.3-2.1.5) taze bir piranha çözeltisi ile tekrarlayın.
    7. Tüm artık piranha çözeltisini çıkarmak için kapakları bol miktarda ultra saf su ile durulayın. Çıkarılmasını kolaylaştırmak için her yükseliş sırasında boyama kavanozu hafifçe sallayın (10 durulama önerilir).
    8. Kapakları metanol ile 3 kez durulayın ve kapak altlarını metanolün içine batırın.
  2. Yüzey silanizasyonu
    1. Temizlenmiş ve kurutulmuş Erlenmeyer şişesinde 94 mL metanol, 1 mL aminosilane ve 5 mL buzul asetik asetik asidi iyice karıştırarak% 1 aminosilane çözelti hazırlayın. İkinci temizlenmiş ve kurutulmuş boyama kavanozuna dökün14.
    2. Metanol çözeltisi altında batırılmış kapakları% 1 aminosilane çözelti içeren boyama kavanozuna aktarın ve kavanozu kapalı tutun.
      NOT: Cam yüzeyinin havaya maruz kalmasını sınırlamak için aminosilane aktarırken kapakların kurumasına izin vermeyin.
    3. Aminosilane kapaklar içeren boyama kavanozunu bir fırında 70 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın15.
    4. Aminosilane çözeltisini ayrı bir atık kabına dikkatlice atın ve aminosilane çözeltisini çıkarmak için kapakları lekeleme kavanozunda metanol ile 5 kez durulayın.
    5. Kapakları boyama kavanozunda ultra saf suyla 5 kez durulayın ve N2 ile kurutun.
    6. Kurutulmuş örtüleri boyama kavanozunda 110 °C'de bir fırında 20 dakika pişirin. Kapakların RT'ye soğumasını bekleyin, ardından PEGylation rafı üzerine yerleştirin.
      NOT: Yüzeydeki belirli ve kimyasal birikimi en aza indirmek için boyama kavanozunu fırın sırasında bir kapakla örtün15.
  3. PEG çözeltisi hazırlama
    1. YAKLAŞıK 30 dakika boyunca RT'ye PEG (Polietilen glikol) ve PEG-biotin çözün.
      NOT: Bu adım, PEG'deki NHS esterini bozabilecek nem yoğuşması en aza indirir.
    2. 10 mL ultra saf suya 84 mg sodyum bikarbonat ekleyerek PEG tamponu yapın. Bu formülasyon pH 8.4'te bir arabellek sağlamalıdır.
    3. Her biri 20:1 PEG:PEG-biotin ile bir PEGylated tarafı olan 8 kapak için: 400 μL PEG tamponu eklemek için 100 mg PEG ve 5 mg PEG-biotin ölçün. Vortex 30 s için çözüm ve maksimum hızda 1 dakika santrifüj (≥18000 x g).
      NOT: SVA NHS-ester hidrolizi hemen başladığı ve pH 8.0'da 34 dk yarı ömrüne sahip olduğu ve pH 8.4'te daha kısa bir yarı ömrü olduğu için bu adım zamana duyarlıdır.
  4. PEG inkübasyon ve kapak muhafazası
    1. Nem odasını kurun ve kapakları içine yerleştirin.
    2. Nem odasındaki bir kapakçığa 90 μL PEG çözeltisi ekleyin ve PEG çözeltisini eşit bir şekilde yaymak için kapak tutma cımbızı kullanarak PEG çözeltisinin üzerine ikinci bir kapak parçası yerleştirin.
    3. Kapak kılıfına bırakılan çözeltide kabarcık olmadığından emin olun. İlk kapak kapağındaki ikinci kapak kapağının bir ucunu indirin ve diğer ucunu yavaşça bırakın, böylece kapaklar arasında kabarcıklar sandviç olmaz.
      NOT: Kabarcıklar belirli alanların kötü bir şekilde PEGylated olmasına neden olur.
    4. Tüm kapaklar PEG olana kadar tekrarlayın (yani, 8 kapak = 4 PEG sandviç). PEG çözümlerini rt'de bir gecede (~12 h) karanlıkta bir nem odasında kuluçkaya yatırın16.
    5. Kapak çiftlerini ayırın ve bir boyama kavanozuna yerleştirin. PEGylated taraflarını not edin.
    6. Kapakları ultra saf suyla iyice durulayın ve N2 ile kurulayın.
      NOT: Kapakları cımbızla tutun ve kirleticilerin yüzeye kurumasını önlemek için N2'yi yüzey boyunca cımbıza doğru üfleyin.
    7. Pegylated olmayan tarafı kalıcı bir işaretleyici veya elmas kalem kullanarak köşedeki bir nokta ile işaretleyin.
    8. Pegylated tarafını kullanmadan önce tanımlamaya yardımcı olmak için pegylated yanları birbirine dönük posta tüplerine 2 PEGylated coverlips yerleştirin.
    9. Tüpü 5 dakika vakumlayın ve N2 ile doldurun. Tüpü parafilm ile kapatın.
    10. PEGylated kapakları -20 °C'de kapalı posta tüplerinde 6 aya kadar saklayın.
      NOT: Talaş montajından önce depolama tüplerini RT'ye ısıtın. Sızdırmazlık sırasında kapaklardaki yoğuşma sızıntıya neden olacaktır.

3. Akış odası hazırlığı

  1. Talaş montajı
    1. Jiletle çift taraflı bandın her iki tarafına da az miktarda epoksiyi ince bir şekilde yayın.
      NOT: Montaj sırasında kanala çok fazla epoksi yayılabilir.
    2. 4 kanal oluşturmak için epoksi kaplı bandı lazerle kesin. Epoksi bandı 4 delikli bir slayt ve PEG kapak kilip arasına sıkıştırarak akış çipini oluşturun (Şekil 1A).
    3. Pipet ucu kullanarak, iyi bir conta oluşturmak için kanalların uzunluğu boyunca hafif basınç uygulayın. Epoksiyi ≥1 saat boyunca tedavi edin.
      NOT: Epoksiye karşı kaymayı önlemek için camı kesmeyin.
  2. Oda montajı
    1. Çipi, her kanalın açıklığı adaptörün merkezlerine yer olacak şekilde hizalayın (Şekil 1A). Talaşın üzerine iki şeffaf akrilik ara parça yerleştirin, bloğun ortasına sıkı bir basınç uygulayın ve her ara parçanın uçlarına iki adet 4-40 vida vidayı vidalayın.
      NOT: Vidayı zorlamayın veya ara parçalara çok sert basmayın, aksi taktir çatlayabilir.
    2. Braketin diğer tarafında, girişleri dişli deliklere vidaleyin. Sızdırmazlık durumunu şeffaf akrilik blok üzerinden izleyin.
    3. Boru talaşın açıklığıyla temas ettikçe, boruyu saat yönünde hafifçe bükerek bağlantıyı kapatın.
      NOT: Aşırı iyileştirilmiş girişler akış tıkanmasına neden olabilirken, gevşek kontaklar sızıntıya neden olur.

4. Yüzey hazırlığı

NOT: Genel iş akışı için Şekil 1B'ye bakın.

  1. Özel olmayan bağlamayı önlemek için aracıları engelleme
    1. Sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için odaya 200 μL yıkama tamponu (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 ve 2 mM CaCl2, % 0,05 Ara 20) akmak için bir pipet kullanın. Kanalda kabarcıklar oluşursa, kabarcıkları çıkarmak için agresif bir şekilde ek bir 200 μL itin.
      NOT: Bu adımda çıkarılmayan büyük hava kabarcıkları daha sonra yüzey fonksiyonelleştirmeyi yerinden çıkarıp yok edebilir.
    2. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek ve 10 dakika kuluçkaya yatmak için akış odasına 40 μL BSA (%1 w/v) ekleyin.
    3. Her kuluçka döneminde akış odalarını dolduracak ve giriş ve çıkışlarda damlacıklar oluşturacak kadar hacim eklediğinizden emin olun. Kuluçka hacimlerini buna göre ayarlayın ve tüm inkübasyonları bir nem odasında gerçekleştirin.
    4. Akış odasına 40 μL Ara 20 (%5 v/v) ekleyin. Spesifik olmayan bağlamayı daha da azaltmak için 10 dakika kuluçkaya yatır.
    5. (İsteğE BAĞLI) Kanal üzerinden polistiren boncuklar akarak yüzeyde yeterli pasivasyon olup olmadığını kontrol edin. 40 μL ProtG kaplı polistiren boncuk (%0,01 w/v) ve 10x hedefe sahip bir karanlık alan mikroskobu kullanarak görüntü ekleyin. Boncuklar yüzeye yapışmazsa, bir sonraki adıma geçin.
    6. Tüm pasivasyon maddelerini çıkarmak için kanalı 200 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
  2. Oda yüzeyi fonksiyonelleştirme
    1. Akış odasına 40 μL streptavidin (100 μg/mL) ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, 200 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
    2. Akış odasına 40 μL hibrit ProtG-TGT (100 nM) ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, 200 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
    3. Yüzeydeki herhangi bir yibritsiz TGT alt telini tamamlamak için 20 dakika boyunca 40 μL ProtG-TGT üst tel (100 nM) ekleyin. 200 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
    4. Akış odasına 40 μL P-selectin-Fc (10 μg/mL) ekleyin ve 60 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, 200 μL yıkama tamponu ile yıkayın.
      NOT: Kuluçka süresi kritiktir.

5. Deney ve görüntüleme

  1. Akış sistemi kurulumu
    1. 5 mL'lik bir cam şırınnayı haddeleme tamponu ile doldurun (2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, % 0,1 BSA ile HBSS). Kabarcıkları yerinden çıkarmak için şırınganın kenarlarına dokunarak ve uğulda doğru yüzerken dışarı iterek şırıngada hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
    2. Steril bir iğne (26 G, 5/8 İnç Uzunluğunda) ~200 mm polietilen boruya (I.D: 0,38 mm) yerleştirin; O.D: 1.09 mm) ve iğneyi cam şırıngaya bağlayın.
      NOT: İğne konnektöründe herhangi bir yere hava sıkışmamasını sağlayın.
    3. Şırınd'ı şırındıcı pompaya sabitleyin ve şırınna pompasını, hava kabarcıklarının kanala girmesini önlemek için piston tarafı yükselecek şekilde eğin. Tüpün ucını akış odası girişine yerleştirin.
      NOT: Damlacıkları girişlere biriktirerek ve şırınna borunun ucunda damlacıklar bulunarak bağlantıyı kurarken sıvı temastan sıvıya emin olun. Şırınna borunun ucunda küçük bir damla oluşmasına izin vererek kanala hava kabarcıklarının girmemesini sağlayın.
    4. Diğer 200 mm polietilen borunun bir ucunu prize, diğer ucunu ise atık bir kabın içine yerleştirin.
  2. Hücre çalışırken ayarlama
    1. HL-60 hücrelerini 25 cm2 havalandırmalı kültür şişelerinde IMDM ortamlarında %20 fetal sığır serumu ve %1 antibiyotik ile 37 °C'de %5 CO2 ile destekleyin. 1 x 105-2 × 106 hücre/mL arasında hücre yoğunluklarını koruyun.
    2. (İsteğE BAĞLI) HL-60 hücrelerini 2 x 105 hücre/mL başlangıç yoğunluğunda %1,25 DMSO içeren eksiksiz bir IMDM ortamında ayırt edin. Hücreleri 5-6 gün boyunca en aktif olacak şekilde kuluçkaya yatır.
    3. Hücreleri peletmek için hücre süspansiyonundan ve santrifüjden (200 x g, 3 dk) bir örnek (1-2 mL) alın.
    4. Ortamı çıkarın ve hücreleri yuvarlanan tamponun 500 μL'sinde hafifçe yeniden biriktirin. Hücresel kalıntıları gidermek için yıkama adımını iki kez tekrarlayın.
    5. Hemositometre ile hücre yoğunluğunu ölçün. Hücre peletlerini haddeleme tamponu ile 2 x 105 hücre/mL yoğunluğa yeniden biriktirin.
    6. Boruyu hücre süspansiyonunun giriş/çıkış ve pipet 40 μL'sinden akış odasına dikkatlice çıkarın. Boruyu daha önce açıklandığı gibi yeniden bağlayın, akış kanalına kabarcık sokulmamasını sağlayın.
    7. Şırınd pompasını istediğiniz akış hızlarında başlatarak hücre haddeleme deneyine başlayın.
      NOT: Floresan izlerin yoğunluğu kesme stresine bağlıdır ve daha düşük hücre hızı kesme stresi / hücre hızı genellikle daha düşük parçalar üretecektir (Şekil 4A). Ayrılabilir tek hücreli izler sağlamak için yüzeydeki yüksek hücre yoğunluğundan veya aşırı yuvarlanma süresinden kaçının (Şekil 4B,C).
    8. Hücre yuvarlanmasının gözlendiğine emin olmak için 10x hedefli bir karanlık alan mikroskobu kullanın.
    9. Deneme tamamlandıktan sonra, yüzey hücresiz olana kadar yuvarlanan arabelleği 100 mL/s'ye infüze ederek hücreleri kanaldan çıkarın.
  3. "Nanoscale Topografyada Görüntüleme için DNA Tabanlı Nokta Birikimi" (DNA-PAINT) ile yerel parçaları görüntüleme
    1. Kanala DNA-PAINT tamponunda (%0,05 Ara-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) 40 μL DNA-PAINT görüntüleyicı iplikçik (500 pM) ekleyin.
    2. 100x yağ daldırma TIRF objektif lens kullanarak Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopisi gerçekleştirin. Elektron çarpan yük bağlantılı cihaz (EMCCD) kamera kullanarak 300 elektron çarpma (EM) kazancıyla kare başına 25 ms pozlama süresine sahip 40000' den fazla kare elde edin.
    3. 5.3.4-5.3.5 adımlarını izleyerek süper çözünürlüklü görüntüleri (Şekil 4D) yerelleştirmek ve işlemek için Picasso yazılım paketi17'yi kullanın.
    4. Her karedeki her floroforun yerelleştirilmesini belirlemek için DNA-PAINT filmini Localize programına yükleyin.
      NOT: Yalnızca floroforlar doğru bir şekilde izlenene kadar kutu yan uzunluğunu ve Min. Net Degrade parametrelerini optimize edin. Min. Net Gradyan parametresi, optimum izleme elde etmek için genellikle 100000'in üzerine çıkabilir. Uyum ayarı: MLE, entegre Gauss yöntemi en iyi sonucu üretir. Son olarak, film çok uzunsa, Localize'deki önizleme izlemenin son bir HDF5 dosyasında yeniden birleştirmeden önce düzgün çalışması için 10000 karelik yığınlara bölün.
    5. Ardından, sürüklenme düzeltmesi ve işleme gerçekleştirmek için elde ettiği hdf5 dosyasını Render programına yükleyin.
      NOT: Nihai sonucu iyileştirmek için RCC tarafından Undrift aracılığıyla birden fazla sürüklenme düzeltmesi gerçekleştirin.
  4. Kalıcı etiketleme ile uzun parçaları görüntüleme
    1. Kalıcı görüntüleyicİ telini ekleyin ve T50M5 tamponunda 120 sn kuluçkaya yatırın. Kanalı 200 μL yıkama tamponu aşılayarak yıkayın.
    2. Arka plan kamerası gürültüsü elde etmek için heyecan lazeri kapalıyken bir görüntü kaydedin. TIRF mikroskopisi ile ızgara deseninde geniş bir alanı görüntüleyin.
      NOT: Sonraki dikiş için kare üstü %≥10 çakışma önerilir.
    3. Mikroskobu 400 x 50 görüntü (toplamda 20000 görüntü) alanı üzerinde taramak üzere programla. FIJI programını kullanarak, ham verileri her biri en fazla 10000 görüntü içeren ayrı tiff dosyalarına bölün.
    4. 5.4.5-5.4.7 adımlarını izleyerek aydınlatma profilini (Şekil 3A-C) kullanarak tüm görüntüleri düzleştirin.
    5. Arka plan kamerası gürültüsünü her kareden çıkarın. Arka planda çıkarılan her çerçevenin ortalama yığın projeksiyonunu (aydınlatma profili) elde edin.
    6. Aydınlatma profilini maksimum değerine göre normalleştirin. Arka planda çıkarılan her kareyi normalleştirilmiş aydınlatma profiline bölün.
    7. Düzeltilen kareleri karşılık gelen bit derinliği için uygun aralığa yeniden ölçeklendirin.
    8. Görüntüleri dikmek için MIST18 kullanın (Şekil 3D,E).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıdaki protokol, yapışkan ayak izi testinin deneysel prosedürünü açıklar. Genel deney iş akışı Şekil 1'de, akış odası montajından (Şekil 1A) yüzey fonksiyonelleştirmesine (Şekil 1B) ve deney ve görüntüleme adımlarına (Şekil 1C) kadar gösterilmiştir.

Şekil 2 , ProtG-ssDNA biyokonjugasyon karakterizasyonu için temsili bir sonuçtur. Nihai üründe...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yapışma ayak izi tahlili, hücre yuvarlama yapışması sırasında PSGL-1 ve P-selectin arasındaki moleküler yapışma olaylarının görselleştirilmesini sağlar. Bu işlem P-selectin aracılı yakalama ve ardından akışkan kesme stresi altında yuvarlanma ile başlatılır. Deney sırasındaki potansiyel sorunlar genellikle hücreler iyi yuvarlandığında bile zayıf hücre yuvarlanmasını veya floresan izlerinin eksik olduğunu içerir. Bu sorunlar genellikle sorun giderme tablosunda listelendiği gibi protokoldeki kritik adımlardaki kalite kontro...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunun.

Teşekkürler

Bu çalışma Kanada İnovasyon Vakfı (CFI 35492), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Sağlık Araştırmaları Vakfı (SCH-2020-0559) ve British Columbia Üniversitesi Saygınlık Fonu tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4 kanallı matkap kılavuzuözel yapım3D baskılı
4 delikli kızakÖzel yapımAlüminyum kelepçe üzerindeki 8-32 dişli deliğin merkezleriyle eşleşen bir düzene sahip 4 kanallı bir matkap kılavuzu üzerinde elmas kaplı matkap uçlarına sahip bir Dremel kullanarak temiz mikroskop kızağı delin.
AsetonVWRBDH1101-4LP
Akrilik ara parçaÖzel yapım40 mm x 30 mm x 2,5 mm boyutlarında iki blok akrilik levha kesin. Her blokta, alüminyum tutucu üzerindeki 3-4 deliklerle tam olarak hizalanmış iki adet 40 mm'lik delik açın.
Alüminyum talaş tutucuÖzel yapımMakine eloksallı alüminyum blok, dış boyutu 640 mm x 500 mm x 65 mm ve açıklık boyutu 400 mm x 380 mm x 65 mm olan C şeklinde bir tutucuya yerleştirilmiştir. Giriş ve çıkışlar 8-32 diş ile vidalanır.
AminosilanAlfaAesarL14043CAS 1760-24-3
Antibiyotik/antimikotik çözeltiCytiva HyCloneSV3007901Kalem/Strep/Fungiezon
Boncuklar, ProtG kaplı polistirenSpherotechPGP-60-5
Sığır serum albüminiVWR332
Tampon, DNA BOYA%0,05 Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Tamponu, T50M510mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Tampon,HBSS < alt >2< / alt >, 2 mM MgCl2< / alt >, 10 mM Hepes,% 0.1 BSA
Tamponu, Yıkama10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 ve 2 mM CaCl2, %0,05 Tween 20
Kalsiyum klorürVWRBDH9224
Hücre kültürü şişeleriVWR10062-868
Konsantre sülfürik asitVWRBDH3072-2.5LG% 95-98
Lamel tutma cımbızTechni-Tool758TW150
Elmas kaplı matkap bitlerAşındırıcı teknolojiC52505100,75 mm elmas matkap
DNA, amin-ssDNA (üst iplikçik)IDT DNAÖzel oligoCCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (alt iplikçik)IDT DNAÖzel oligo/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, DNA-PAINTIDT DNAÖzel oligoGAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, kalıcı etiketleme için görüntüleyici iplikçikIDT DNAÖzel oligoCCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Çift taraflı bantScotch2373/4 inç genişlik, kalıcı çift taraflı bant
EDTAThermofisher155750200,5 M EDTA, pH 8.0
EpoksiGoril420015 dakika kürlenme süresi
Fetal Sığır Serumu (FBS)Avantor97068-085
GelGreenBiotium41005
Buzlu asetik asitVWRBDH3094-2.5LG
Cam, LamellerFisher Scientific12-548-5P
Cam, Mikroskop lamıVWR48300-02675 mm x 25 mm x 1 mm
Cam, Boyama kavanozuVWR74830-150Buğday Boyama Kavanozu (900620)
Hanks'in Dengeli Tuz çözeltisi (HBSS)Lonza04-315Q
HemositometreSigma-AldrichZ359629-1EA
HL-60 hücreleriATCCCCL-240
Nem odası slayt desteğiözel yapım3D baskılı
Hidrojen peroksitVWRBDH7690-1%30
İmidazolSigma-AldrichI2399
Girişler/çıkışlarÖzel yapımKobalt matkap uçları kullanarak sekiz adet 8-32 ayar vidasını delin. 1,5 cm  polietilen boru (Tygon, ID 1/32 "OD 3/32") her içi boş ayar vidasına
Iscove Modifiye Dulbecco Media (IMDM)Lonza12-722F
Magnezyum klorürVWRBDH9244
Manyetik Ni-NTA boncuklarıInvitrogen10103D
Posta tüpleriEMSEMS71406-10
MetanolVWRBDH1135-4LP
Mikro Bio-Spin P-6 Jel SütunlarıBiorad7326200SSC Tamponunda
PEGLaysan BioMPEG-SVA-5000
PEG-biotinLaysan BioBiotin-PEG-SVA-5000
Potasyum hidroksitVWR470302-132
Protein, Protein GAbcamab155724N-terminal His-Tag ve C-terminali sistein
Proteini, P-selektin-FcR& D Sistemi137-PSRekombinant İnsan P-Selectin/CD62P Fc Chimera Proteini, CF
Proteini, StreptavidinSedirCL1005-01-5MG
Pompa ŞırıngasıHarvard Aparatı704801
Sodyum bikarbonatKoğuş ' s Science470302-444
Sodyum klorürVWR97061-274
Sulfo-SMCCThermofisher22322
ŞırıngaHamilton81520PTFE luer kilitli şırıngalar, 5 mL
Şırınga iğneleriBD305115Hassas Kayma 26 G, 5/8 İnç Uzunluk
TCEPSigma-AldrichC4706-2G
TrisVWRBDH4502-500GP
Boru, AdaptörTygonABW00001Formülasyon 3350, ID 1/32"; OD 3/32"
Boru, PolietilenBD Intramedic427406Intramedic (PE20) İç Çap 0.38mm; OD 1.09mm
Ara-20Sigma-Aldrich93773
ABS filament ile 2mM CaCl ile Haddeleme için görüntüleyici iplikçik ABS filament ile

Kaynaklar

  1. McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
  2. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  3. Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
  4. Etzioni, A. Adhesion molecules - Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
  5. van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
  6. Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
  7. Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
  8. Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
  9. Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
  10. Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006(2014).
  11. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
  12. Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502(2017).
  13. Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
  14. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
  15. Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
  16. Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  17. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  18. Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988(2017).
  19. Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  20. Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
  21. Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507(2019).
  22. Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
  23. Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
  24. Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Yuvarlanarak Yap maP Selektin PSGL 1DNA PAINT G r nt lemeGerilim l er Ba lay cAk Odas TertibatToplam Yans maFloresan MikroskopiH cre Yuvarlanma DavranMolek ler Yap ma Kuvveti
Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.