Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Birleştirme Verimliliğini İzlemek için Muhabir Tabanlı Hücresel Test

2.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63014

⸱

15 Eylül 2021

 ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine-Phoenix, University of Arizona

Bu makalede

Özet

Bu protokol, 5'-splice bölgesi mutasyonlarının birleştirme üzerindeki etkisini izlemek için bir minigene muhabiri testini açıklar ve mutasyona bağlı birleştirme inhibisyonunun kurtarılması için bastırıcı U1 snRNA geliştirir. Muhabir ve bastırıcı U1 snRNA yapıları HeLa hücrelerinde ifade edilir ve birleştirme astar uzantısı veya RT-PCR ile analiz edilir.

Özet

Gen ekspresyonu sırasında, mRNA öncesi birleştirmenin hayati adımı, olgun mRNA'nın sitoplazmik ihracatından önce eksonları birleştirmek ve intronları çıkarmak için spliceosomal komplekslerin doğru tanınmasını ve spliceosomal komplekslerin verimli bir şekilde birleştirilmesini içerir. Birleştirme verimliliği, splice bölgelerinde mutasyonların varlığı, trans-etkili birleştirme faktörlerinin etkisi veya terapötiklerin aktivitesi ile değiştirilebilir. Burada, herhangi bir eksonun birleştirme verimliliğini izlemek için uygulanabilecek hücresel bir test protokolünü açıklıyoruz. Tahlil, memeli hücrelerinde geçici transfeksiyon ile ifade edilebilen uyarlanabilir bir plazmid kodlu 3-exon/2-intron minigene reporter kullanır. Transfeksiyon sonrası, toplam hücresel RNA izole edilir ve muhabir mRNA'daki ekson birleştirmenin verimliliği primer uzatma veya yarı nicel ters transkriptaz-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile belirlenir. 5′ splice-site mutasyonları ile ilişkili hastalığın etkisinin muhabirde tanıtılarak nasıl belirlenebileceğini anlatıyoruz; ve bu mutasyonların bastırılmasının U1 küçük nükleer RNA (snRNA) yapısı ile birlikte transfeksiyon ile nasıl sağlanabileceği, mRNA öncesi bölgelerdeki exon-intron kavşaklarında 5′-splice bölgeleri ile temel alan 5′ bölgesinde telafi edici mutasyonlar taşıyan yapı. Böylece, muhabir mutant 5′ splice-sites tanıma geliştirmek için terapötik U1 parçacıklarının tasarımı için kullanılabilir. Artırıcı veya susturucu dizilerini birleştirme gibi CIS etkili düzenleyici sitelerin muhabire eklenmesi, U1 snRNP'nin belirli bir alternatif birleştirme faktörünün aracılık ettiği düzenlemedeki rolünü incelemek için de kullanılabilir. Son olarak, hücreleri ifade eden muhabir, potansiyel terapötiklerin konsitutive pre-mRNA birleştirme veya mutant taşıyan eksonlar üzerindeki etkisini belirlemek için küçük moleküllerle inkübe edilebilir 5′ splice siteleri. Genel olarak, muhabir tahlilleri, temel birleştirme mekanizmalarını ve birleştirme ile ilişkili hastalıkları incelemek için çeşitli koşullarda birleştirme verimliliğini izlemek için uygulanabilir.

Giriş

Pre-mRNA birleştirme, kodlamayan intronları kaldıran ve olgun mRNA oluşturmak için kodlama eksonlarını hassas bir şekilde lige eden önemli bir işlem adımıdır. Ekson-intron kavşaklarında konsensüs dizilerinin tanınması, 5′-splice bölgesi ve 3′-splice bölgesi olarak adlandırılır, birleştirme makinelerinin bileşenleri tarafından birleştirme işlemini başlatır. U1 küçük nükleer ribonükleoprotein (snRNP), U1 snRNA'nın mRNA1 öncesi ile baz eşleşmesi ile 5′-splice bölgesini tanır. 5′-splice bölge dizilerini değiştiren genetik kalıtsal mutasyonlar birçok hastalıkla ilişkilidir2,3. U1 snRNA'nın mutant 5′-splice siteleri ile temellenme kaybının, etkilenen transkriptin çevirisini tehlikeye atabilecek sapkın birleştirmeye neden olduğu öngörülebilir. Birleştirme kusurlarını düzeltmek için potansiyel bir terapötik yaklaşım, 5′-splice bölgesi ile temel alan 5′-bölgesinde telafi edici nükleotid değişiklikleri taşıyan modifiye U1 snRNA tarafından mutasyonların bastırılmasını içerir. Ekson spesifik U1 snRNA'ları olarak da adlandırılan bu tür modifiye U1 snRNA'larının, ekstifleme kusurlarının tersine çevrilmesinde etkili olduğu ve kurtarılan mRNA4,5,6,7,8'den protein ekspresyonunda artışa neden olduğu bulunmuştur.

Burada, U1 snRNP tamamlama testini, 5′-ss mutasyonunun bir ekzonun bir eklenmesi üzerindeki etkisinin değerlendirilmesine izin veren ve ayrıca akson dahil etmenin kurtarılmasını sağlamak için değiştirilmiş U1 snRNA'larının geliştirilmesi için de kullanılabilen muhabir tabanlı bir hücresel birleştirme tahlili olarak tanımlıyoruz. Ayrıca, bir aradaki muhabir transkriptlerinin primer uzantısı ve RT-PCR ile izlenmesi ve değiştirilmiş U1 snRNA'ların primer uzantısı ve RT-qPCR ile ifadesinin belirlenmesi için protokoller sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Reaktifler ve tamponlar

NOT: Vakum filtreleri kullanılarak yapılan tüm sterilizasyonlar biyogüvenlik kabininde 0,2 μm polietrülfon (PES) membran ile yapılmalıdır.

  1. 1,0 L deiyonize suya 1,0 mL dietilpirokarbonat (DEPC) ekleyerek RNase içermeyen su hazırlayın, oda sıcaklığında (RT) en az 1 saat karıştırın, iki kez otoklavlayın ve kullanmadan önce RT'ye soğutun.
  2. Bir paket DMEM tozu (13,4 g), 3,7 g sodyum bikarbonat, 100 mL fetal sığır serumu (FBS), penisilin ve streptomisin ile ~800 mL steril deionize suyu karıştırarak Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortasını (DMEM) hazırlayın. DMEM'de penisilin ve streptomisinin son konsantrasyonu sırasıyla 50 U/mL ve 50 μg/mL olmalıdır. pH'ı 7,4'e ayarlayın ve ardından steril deiyonize su ile hacmi 1,0 L'ye ayarlayın. Filtrasyon ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
  3. 25,6 g disodium hidrojen heptahydrat (Na2HPO4· ekleyerek 10x fosfat tamponlu salin (10x PBS) hazırlayın 7H2O), 2 g potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4), 2 g potasyum klorür (KCl) ve 80 g sodyum klorür (NaCl) ila 800 mL deiyonize su. Çözün ve hacmi 1,0 L'ye kadar yapın.
  4. 186,1 g Na2•EDTA•2H2O'yu ~800 mL deiyonize suya eriterek 0,5 M etilen diamin tetra-asetik asit (EDTA) hazırlayın. pH'ı 8.0'a ayarlayın ve ardından steril deiyonize su ile hacmi 1.0 L'ye ayarlayın. Filtrasyon ile sterilize edin ve 4 °C'de saklayın.
  5. 100 mL 10x tripsin (%2,5), 2 mL 0,5 M EDTA karıştırarak 1x tripsin-EDTA çözeltisi hazırlayın ve 1,0 L'ye kadar 1x PBS ekleyin. 1-2 hafta boyunca 4 °C'de saklayın veya uzun süreli kullanım için -20 °C'de dondurun.
  6. 14,4 mL formamid ve 0,6 mL 0,5 M EDTA'yı 15 mL'lik son hacim için karıştırarak 2x formamid DNA/RNA yükleme boyası hazırlayın. Bromofenol mavisi ve ksilen siyanol tozunu% 0.02'lik son konsantrasyona ekleyin ve 4 ° C'de saklayın.
    NOT: Formamid toksik ve aşındırıcıdır. Ek güvenlik önerileri için malzeme güvenliği veri sayfalarını okuyun.
  7. 54,0 g tris tabanı, 27,5 g borik asit ve 20 mL 0,5 M EDTA'yı ~800 mL deiyonize suya karıştırarak 5x Tris/Borat/EDTA (5x TBE) tampon hazırlayın. Deiyonize su ile hacmi 1,0 L'ye kadar çözmek ve yapmak için karıştırın.
  8. 200 mL 5x TBE, 250 mL@ 19:1 bis/akrilamid ve 450,5 g üre karıştırarak üre-poliakrilamid jel elektroforez (üre-PAGE) çözeltisi hazırlayın. Daha sonra 1,0 L'ye kadar deiyonize su ekleyin, malzemeler tamamen çözünene kadar karıştırın, sonra filtrasyonla sterilize edin ve 4 °C'de bir kehribar cam şişede saklayın.
    NOT: Bis/akrilamid toksiktir. Ek güvenlik prosedürleri için malzeme güvenliği veri sayfalarını okuyun.
  9. 10 mL deiyonize suda 1 g APS eriterek % 10 amonyum persülfat (APS) hazırlayın ve 4 °C'de depolayın.

2. HeLa hücrelerinin muhabir ve U1 snRNA plazmidleri ile birlikte aktarılması

NOT: Hela hücrelerinin transfeksiyonu steril koşullarda biyolojik bir güvenlik kabininde yapılmalıdır. Tüm malzemelerin dış yüzeyi biyolojik güvenlik kabinine sokulmadan önce% 70 etanol ile püskürtülmelidir.

  1. Hücrelerin yaklaşık% 80-90 birleştiği her 2-3 günde bir geçerek 37 °C'lik bir inkübatörde Hela hücrelerini% 5 CO2 ile koruyun.
  2. HeLa hücrelerini geçirmek için, harcanan ortamı aspire edin ve daha sonra 3 dakika boyunca 37 °C'de 1 mM EDTA içeren% 0.25 tripsin 3 mL ile hücreleri kuluçkaya yatırın.
  3. Kuluçkadan sonra, 7 mL taze DMEM ekleyin. Hücre süspansiyonu 10 mL'lik bir tüpe aktarın, 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüj.
  4. Hücre peletini 10 mL taze DMEM'de yeniden biriktirin ve ardından hücreleri% 20 izdihamda yeni bir doku kültürü çanakları üzerine plakalayın.
  5. Geçici transeksiyonlar için, Hela hücrelerini temiz bir hemositometre kaydırağı ile sayın ve 2,5 x 105 hücre /mL yoğunluğa sahip bir süspansiyon hazırlayın.
  6. 12 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 2,5 x 105 hücre/mL Hela hücre süspansiyonunun 1,0 mL'lik tohumu ve 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yaslanın.
  7. Ertesi gün, harcanan ortamı epire edin ve serum ile 0,8 mL taze DMEM ekleyin.
  8. Yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne 0,2 μg Dup51 veya Dup51p muhabir plazmidi, 1,8 μg pcDNA, pNS6U1 veya pNS6U1-5a plazmid ve 100 μL transfeksiyon ortamı ekleyerek Çözüm I'i hazırlayın.
  9. Numune başına 100 μL transfeksiyon ortamı ve 4,0 μL transfeksiyon reaktifi ekleyerek tüm numunelerin transfeksiyon için Çözüm II'nin ana karışımını hazırlayın.
  10. Çözelti I içeren her mikrosantrifüj tüpüne 100 μL Çözelti II ekleyerek transfeksiyon karışımını hazırlayın.
  11. Transfection 15 s için karıştırılır, rt'de 10 s için 3.000 x g'da bir masa üstü mikrosantrifüjde santrifüj ve ardından RT'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  12. 200 μL'lik transfeksiyon karışımının tamamını 12 kuyulu HeLa hücre plakasının bir kuyusuna ekleyerek kuyu başına 1,0 mL'lik son bir hacim elde edin ve plakayı 48 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  13. Kuluçkadan sonra, ticari olarak mevcut guanidin tiyosiyanat ve fenol çözeltisi ile transfected HeLa hücrelerinden RNA çıkarın.
    NOT: Bu reaktif fenol içerir ve bu adım bir duman davlumbazında yapılmalıdır. Çıkarılan RNA'nın yeniden sulanması için DEPC arıtılmış su kullanılması önerilir.
    1. Harcanan ortamı epire edin ve her kuyuya 500 μL reaktif ekleyin. RT'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
    2. Yukarı ve aşağı pipetleme ile homojenize edin. Ardından çözeltiyi yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    3. 15 sn için 100 μL kloroform ve girdap ekleyin.
    4. RT'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüj.
    5. RNA içeren 200 μL'lik üst sulu katmanı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    6. Her RNA örneğine 2 μg glikojen ve 200 μL izopropanol ekleyin. Tüpleri ters çevirerek karıştırın.
    7. RNA çökeltisini 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın.
    8. RNA peletini bozmadan üstnatant çıkarın ve atın.
    9. Peletin% 70 etanol 1.0 mL ekleyerek, tüpleri ters çevirerek ve Adım 2.13.7'de açıklandığı gibi santrifüjleyerek iki kez yıkayın.
    10. Hava peleti RT'de ~10-20 dakika kurutun ve RNA'yı 10-20 μL RNase içermeyen suda yeniden boşaltın.
    11. Desjardins ve Conklin9 tarafından tanımlandığı gibi absorbansı 260 nm'de ölçerek RNA konsantrasyonu belirleyin.
  14. Astar uzatmaya devam edin veya RNA örneklerini -20 °C'de saklayın. İzole RNA 6-12 ay boyunca -20 °C'de saklanabilir.

3. Oligonükleotidlerin 32P etiketlemesi

NOT: 32P-ATP ve 32P etiketli oligonükleotidlerin kullanımını içeren adımlar, yetkili kurumsal kuruluşlardan onay alan eğitimli bireyler tarafından akrilik bir kalkanın arkasında gerçekleştirilmelidir. Aşağıda açıklanan protokol oligonükleotidlerin, Dup3r ve U17-26-R'nin etiketlenebilmesi için ve üre-PAGE için işaretleyiciler için kullanılabilir. Oligonükleotidlerin ve boyut dışlama boncuklarının yeniden sulanması için DEPC arıtmalı su kullanılması önerilir.

  1. Tablo 1'de açıklandığı gibi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne oligonükleotid, T4 polinükleotid kinaz (T4 PNK), T4 PNK tamponu ve 32P-ATP ekleyin. Karışıma son olarak 32P-ATP ekleyin; Bu çok önemli.
    NOT: Radyoaktif çözümlerin eklenmesi için filtre ipuçlarının kullanılması önerilir.
  2. 37 °C'de bir su banyosunda 30 dakika kuluçkaya yatır.
  3. Etiketleme reaksiyonları inkübasyon yaparken, ~10 s için hafifçe girdaplanarak kesilen 25 kDa moleküler ağırlıkla boyut dışlama boncuklarını yeniden depolayın.
    NOT: Boyut hariç tutma boncukları üreticinin talimatlarına göre hazırlanmalı ve 4 °C'de% 25 etanolde% 50 süspansiyon olarak saklanmalıdır.
  4. Yeniden sulanan boncukların 600 μL'lik kısmını 1,5 mL toplama tüpüne yerleştirilmiş tek kullanımlık bir mini sütuna aktararak ve boncuk stoğunu 4 °C'ye döndürerek sütunları hazırlayın.
  5. RT'de 1 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüj ve akışı atın.
  6. Sütuna 300 μL RNase içermeyen su ekleyerek boncukları yıkayın.
  7. 3.5. adımları yineleyin. ve 3.6. ve mini sütunu yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
  8. Kinaz reaksiyon karışımını, rt'de 1 dakika boyunca 5000 x g'da boyut dışlama boncuk sütununa ve santrifüje ekleyin.
  9. 32P etiketli oligonükleotide sahip akışı toplayın ve kaydedin ve tüm uçları ve tüpleri akrilik bir atık kutusuna atın.
  10. 32P etiketli oligonükleotid'i 2,5 μM'lik son konsantrasyona seyreltmek için 20 μL RNase içermeyen su ekleyin.
    NOT: Etiketli işaretleyicileri üre-PAGE jellerine yükleme için gerektiği şekilde seyreltin.
  11. Etiketli oligonükleotid'i -20 °C'de akrilik bir mikrotüp kutusunda saklayın veya astar uzatma analizine devam edin.

4. Ekli muhabir transkriptlerinin primer uzantıya göre analizi

NOT: Kullanmadan önce yüzeylerin ve ekipmanların RNase inaktive reaktifi ile temizlenmesi önerilir.

  1. Hela hücrelerinden çıkarılan 2,0 μg RNA'yı ayrı 200 μL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin ve hacmi 6,55 μL'ye çıkarmak için RNase içermeyen su ekleyin.
  2. Tablo 2'de gösterildiği gibi seyreltilmiş 32P-Dup3r ve dNTP'lerle Master Mix I hazırlayın ve RNA örnekleri içeren her PCR tüpüne karışımın 0,9 μL'sini ekleyin.
  3. Tüpleri kuluçkaya yatırın, önce 65 °C'de 5 dakika, sonra 1 dakika buzda.
  4. Tablo 2'de gösterildiği gibi 5x First Strand Buffer, dithiothreitol (DTT), RNase inhibitörü ve ters transkriptaz ile Master Mix II hazırlayın.
  5. RNA ve Master Mix 1 içeren her tüpe 2,55 μL karışım ekleyin; reaksiyonun toplam hacmi 10 μL olmalıdır.
  6. Tüpleri kuru bir banyoya veya termal bir çevrime aktarın ve kuluçkaya yatırın, önce 60 dakika 50 °C'de ve sonra 15 dakika boyunca 70 °C'de.
  7. İnkübasyondan sonra, her numuneye 10 μL 2x formamid RNA yükleme boyası ekleyin ve -20 °C'de bir akrilik kutuda saklayın veya 14 cm uzunluğunda bir jel kullanarak parçaların üre-PAGE ile ayrılmasına ve 8.
  8. Bir görüntü analiz yazılımı ile jel görüntünün densitometrik taramasını gerçekleştirin ve aşağıda gösterildiği gibi exon 2 ekleme yüzdesini hesaplamak için dahil edilen ve atlanan ürünlerin bant yoğunluklarını kullanın.
    figure-protocol-1

5. Birleşmiş muhabir transkriptlerinin floresan RT-PCR ile analizi

NOT: Aşağıda açıklanan RT-PCR analizi, cDNA sentezi için rastgele altıgenler ve ekli ürünlerin PCR amplifikasyonu için etiketsiz Dup8f ve Cy5 etiketli Dup3r oligonükleotidlerin bir kombinasyonunu kullanır.

  1. cDNA sentezi için, transfected Hela hücrelerinden çıkarılan 2,0 μg RNA'yı ayrı 200 μL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin ve hacmi 11,0 μL'ye çıkarmak için RNase içermeyen su ekleyin.
  2. Tablo 3'te gösterildiği gibi rastgele altıgenler ve dNTP içeren Master Mix I'i hazırlayın ve her numuneye 2,0 μL karışım ekleyin. Kuluçkaya yaslanın, önce 65 °C'de 5 dakika sonra 1 dakika buzda.
  3. Tablo 3'te gösterildiği gibi First Strand Buffer, RNase inhibitörü, DTT ve ters transkriptaz içeren Master Mix II'yi hazırlayın ve RNA ve Master Mix I içeren her tüpe karışımın 7,0 μL'sini ekleyin.
  4. Tüpleri 10 dakika RT'de tutun ve ardından 60 dakika 50 °C'de ve 15 dakika boyunca 70 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Tamamlanan cDNA reaksiyonları -20 °C'de saklanabilir.
  5. PCR için, her cDNA örneğinin 1,0 μL'lik (100 ng/μL) kısmını yeni PCR tüplerine aktarın.
  6. Tablo 4'te açıklandığı gibi Dup8f, Cy5-Dup3r, dNTP'ler, Taq tamponu, Taq polimeraz ve sudan oluşan bir ana karışım hazırlayın ve cDNA içeren her tüpe karışımın 11,5 μL'sini ekleyin.
  7. 3 dakika boyunca 94 °C'de ilk denatürasyon adımına sahip bir termal çevrimleyici kullanarak PCR gerçekleştirin; ardından 20 denatürasyon döngüsü (30 s için 94 °C), tavlama (30 s için 65 °C) ve uzatma (15 s için 72 °C) ve 5 dakika boyunca 72 °C'de sonlandırma adımı.
  8. Her tüpe 12,5 μL 2x formamid DNA yükleme boyası ekleyin ve 5 dakika boyunca 95 °C'de ısıtın.
  9. PCR reaksiyonlarını -20 °C'de saklayın veya Adım 8.1-8.4'te açıklandığı gibi üre-PAGE ile devam edin.
  10. Elektroforezden sonra, cam plakaları elektroforezi aparatından çıkarın ve jeli görselleştirmek için bir floresan görüntüleyici kullanarak tarayın.
  11. Jel görüntüsünün densitometrik taramasını gerçekleştirin ve Adım 4.8'de açıklandığı gibi ekson 2 ekleme yüzdesini hesaplamak için dahil edilenlerin ve atlanan ürünlerin bant yoğunluğunu kullanın.

6. Astar uzantısına göre varyant U1 snRNA ifadesinin analizi

  1. Hela hücrelerinden çıkarılan 2,0 μg RNA'yı ayrı 200 μL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin ve hacmi 4,325 μL'ye çıkarmak için RNase içermeyen su ekleyin ve ardından Tablo 5'te gösterildiği gibi dATP ekleyin.
  2. Her tüpe 32P-U17-26-R oligonükleotid 10.000 CPM ekleyin.
    NOT: 32P-U17-26-R 'lik 10.000 cpm/μL çözeltisi hazırlamak için (Adım 3'ten itibaren), etiketli oligonükleotid (1:20 seyreltme) seyreltin, bir scintillation sayacı kullanarak 1.0 μL'de cpm belirleyin, ve yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 10.000 cpm / μL'lik bir çözelti hazırlamak için deiyonize su ile daha da seyreltin.
  3. 65 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatır, sonra 1 dakika buzda.
  4. Tablo 5'te gösterildiği gibi 5x İlk Strand Buffer, RNase inhibitörü, DTT ve ters transkriptaz ile bir ana karışım hazırlayın ve her numuneye 1,8 μL karışım ekleyin.
  5. Kuluçkaya yaslanın, önce 10 dakika RT'de, sonra 10 dakika boyunca 42 °C'de.
  6. İnkübasyondan sonra, her numuneye 10 μL 2x formamid RNA yükleme boyası ekleyin ve -20 °C'de bir akrilik kutuda saklayın veya parçaların 38 cm uzunluğunda bir jel kullanarak üre-PAGE ile ayrılmasına devam edin (bkz. Adım 8).

7. RT-qPCR ile varyant U1 snRNA ifadesinin analizi

  1. Yukarıda Açıklandığı gibi hazırlanan cDNA stoğunu Adım 5.1 - 5.4'te 0.2 ng/μL konsantrasyonda seyreltin.
  2. Pipet 5.0 μL seyreltilmiş cDNA üç taraflı 96-well qPCR plakanın bireysel kuyularına. Şablonsuz denetim (NTC) için cDNA yerine deiyonize su ekleyin.
  3. U1 ve U2 snRNA'lar için ileri ve ters astarlardan ve Tablo 6'da gösterildiği gibi sudan oluşan iki ayrı astar karışımı hazırlayın.
    NOT: U1 ve U2 snRNA'ya özgü astarlar için sıralar Tablo 7'de verilmiştir.
  4. Numuneye ve NTC kuyularına U1 ve U2 snRNA astar karışımının 5,0 μL'lik kısmını ekleyin.
  5. Her kuyuya 10,0 μL gerçek zamanlı PCR karışımı ekleyin.
  6. Plakaları optik bir filmle kapatın, ardından kuyuların dibine tepkileri toplamak için RT'de 2 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.
  7. QPCR'yi 10 dakika boyunca 95 °C'de ilk denatürasyon adımıyla gerçekleştirin, ardından hedef ampliconların eşik nicelik döngüsü (Cq) değerlerini toplarken denatürasyon (15 s için 95 °C) ve tavlama/uzatma (60 s için 62 °C) içeren 2 adımlı bir protokolün 40 döngüsü.
  8. U1 ve U2 snRNA reaksiyonları için ayrışma eğrisinde tek bir tepe haline gelen tek bir tepeyi kontrol larak qPCR reaksiyonunu tamamlar.
  9. Cq değerlerinden, U1 ve U2 snRNA'ları için delta Cq (ΔCq) değerini pcDNA denetimine kıyasla hesaplayın.
  10. Tüm örnekler için aşağıda gösterildiği gibi ΔΔCq değerini kullanarak U2 ile karşılaştırıldığında U1 varyantı SnRNA ifadesini U1'in göreli miktarı (RQ) olarak belirleyin.
    figure-protocol-2
    figure-protocol-3
    figure-protocol-4

8. Üre-PAGE jellerinin kurulumu ve çalıştırı

NOT: Cam plakaların montajı ve jel çalıştırma aparatı üreticinin talimatlarına göre yapılmalıdır. üre-PAGE jelinin dökümü Summer ve ark.10 tarafından daha önce açıklanan bir protokole göre gerçekleştirilebilir. İşaretçilerin ve örneklerin hazırlanması ve jellerin çalıştırılması ve görselleştirilmesi ile ilgili adımlar aşağıda açıklanmıştır. İsteğe bağlı olarak, jelin cam plakalara yapışmasını önlemek için, iç yüzey yüzeye çözeltinin 1 mL'si eklenerek ve doku ile tüm yüzeye eşit olarak yayılarak silikon çözelti ile kaplanabilir. Kuruduktan sonra, plakalar deiyonize su ile yıkanmalı ve tekrar kurutulmalıdır.

DİkKAT: Eczacılık dışı akrilamid nörotoksiktir ve malzeme güvenliği veri sayfasında önerilen korumalarla ele alınmalıdır.

  1. Astar uzatma numunelerini ve işaretleyicilerini 95 °C'de 5 dakika ısıtıp ardından RT'de 5 sn için 3.000 x g'da bir masa üstü mikrosantrifüjde santrifüjle hazırlayarak hazırlayın.
  2. İşaretleyicileri ve numuneleri yüklemeden önce, yerleşik üreyi çıkarmak için kuyuları 1x TBE tamponu ile boşaltın.
  3. 10 μL / numune / kuyu yükleyin ve jeli 300-500V'da 2-3 saat boyunca veya ksilen siyanol dibe ulaşana kadar çalıştırın.
    NOT: 32P etiketli işaretleyicinin yaklaşık 1.000 cpm'si yüklenebilir.
  4. Elektroforezden sonra cam plakaları elektroforezi aparatından çıkarın.
  5. İki plakayı dikkatlice ayırın, böylece jel her iki cam yüzeye de düz bir şekilde uzanır ve jeli bir filtre kağıdına aktarın ve plastik sargı ile örtün.
  6. Jel kurutma makinesi kullanarak jeli filtre kağıdında 80 °C'de 30 dakika vakumla kurutun.
  7. Kurutulmuş jeli fosfor görüntüleme kasetine yerleştirin ve gece boyunca RT'de tutun.
    NOT: Fosfor ekranı kullanılmadan önce bir ışık kutusu kullanılarak silinmelidir.
  8. Jel görüntüsünü görselleştirmek için ekranı çıkarın ve fosfor görüntüleyiçi kullanarak tarayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Üç ekson-iki intron minigene olan birleştirme muhabiri Dup51, insan β-globin geninden türetilmiştir ve daha önce tanımlanmıştır (Şekil 1A)11,12 . Protocadherin 15 (PCDH15) geni13'ün ekson 3'lüğünde meydana gelen Usher sendromu ilişkili 5'-splice bölgesi mutasyonlarını tanıtarak dup51p adlı bir mutant muhabir oluşturduk. Ekson 2-intron 2 kavşağında 5'-splice site dizisi CAG/GUUGGUAUC'tan AUG/GUGUGUAUC'...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Test, HeLa dışındaki hücre hatlarında birleştirme analizi için uyarlanabilir, ancak hücre konflüensi ve DNA miktarı gibi transeksiyon verimliliğini etkileyen faktörlerin optimize edilmesi gerekebilir. Muhabirden U1 yapı oranına, diğer hücre türlerinde gözlenen ifade düzeylerine bağlı olarak belirlenmesi gerekebilecek başka bir kritik parametredir. Çıkarılan RNA'nın kalitesi birleştirme analizi için kritik öneme sahiptir; bu nedenle, RNaz içermeyen su kullanımı ve RNase inaktivasyon ajanları ile yüzeylerin dekontaminasyon...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21CA170786 ve R01GM127464) ve Amerikan Kanser Derneği'nden (Kurumsal Araştırma Hibesi 74-001-34-IRG) ve Vadi Araştırma Ortaklığı Programı'ndan (P1-4009 ve VRP77) S.S. ve W.M.'ye fonlarla desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Sınıfı Deiyonize SuThermoFisher Scientific23-751628
Dietil pirokarbonat (DEPC)Sigma-AldrichD5758-25ML
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) toz paketiGibco12100-046
Sodyum BikarbonatThermoFisher ScientificS233-500
Fetal Sığır Serumu (FBS), Avustralya kaynağı, Isı ile İnaktive OmegaScientificFB-22
Penisilin-Streptomisin (P / S)Sigma-AldrichP4458-100ML
Sodyum Hidroksit, Standart Çözelti 1.0NSigma-AldrichS2567-16A
Hidroklorik Asit, Sertifikalı ACS Plus, %36,5 ila %38,0ThermoFisher ScientificA144-500
Tek Kullanımlık PES Şişe Üstü FiltrelerThermoFisher ScientificFB12566510
EDTA Disodyum Tuzu DihidratAmresco0105-2.5KG
%2.5 Tripsin (10x), fenol kırmızısı yokThermoFisher Scientific15090046
Sodyum KlorürFisher BiyoreaktifBP358-212
Potasyum KlorürFisher BiyoreaktifBP366-1
Disodyum Hidrojen Fosfat HeptahidratFisher BiyoreaktifBP332-1
Potasyum Dihidrojen FosfatFisher BiyoreaktifBP362-1
Transfeksiyon ortamı - Opti-MEM ve ticaret; I Azaltılmış Serum Ortamı, fenol kırmızısı yokThermoFisher Scientific11058021
Transfeksiyon Reaktifi - Lipofektamin ve ticaret; 2000ThermoFisher Scientific13778150
TRIzol ve ticaret; ReaktifThermoFisher Scientific15596018
Kloroform (Koruyucu Olarak Yaklaşık% 0,75 Etanol / Moleküler Biyoloji)ThermoFisher ScientificBP1145-1
Etanol, Mutlak (200 Kanıt), Moleküler Biyoloji Sınıfı, Fisher BioReagentsThermoFisher ScientificBP2818-4
İzopropanol, Moleküler Biyoloji Sınıfı, Fisher BioReagentsThermoFisher ScientificBP2618-212
Glikojen (5 mg / ml)ThermoFisher ScientificAM9510
Direct-zol RNA Miniprep KitiZymo ResearchR2052
ATP, [γ-32P]- 6000Ci / mmol 150mCi / ml Kurşun, 1 mCiPerkinElmerNEG035C001MC
T4 Polinükleotid KinazNew England BiolabsM0201L
Boyut dışlama beands - Sephadex® G-25Sigma-AldrichG2580-10G
Boyut dışlama mini sütunlarıUSA Scientific1415-0600
pBR322 DNA-MspI DigestNew England BiolabsN3032S
Düşük Moleküler Ağırlık İşaretleyicisi, 10-100 ntAffymetrix76410 100 UL
Rnase inaktive edici reaktifler - RNaseZAP ve ticaret;Sigma-AldrichR2020-250ML
dNTP Karışımı (10 mM ea)ThermoFisher Scientific18427013
RNaseOUT & trade; Rekombinant Ribonükleaz İnhibitörüThermoFisher Scientific10777019
Ters Transkriptaz - M-MLV Ters TranskriptazThermoFisher Scientific28025013primer uzatma için kullanılır
Taq DNAPolimeraz ThermoFisher Scientific10342020
Rastgele Heksamerler (50 & mikro; M)ThermoFisher ScientificN8080127
Gerçek zamanlı PCR karışımı - SYBR & trade; Master Mix,ThermoFisher Scientific4472903
SuperScript&trade'i seçin; III. Ters TranskriptazThermoFisher Scientific18080093cDNA hazırlığı için kullanılır
Dithiothreitol (DTT)ThermoFisher Scientific18080093
5X Birinci İplikli TamponThermoFisher Scientific18080093
Formamid (≥ %99,5)ThermoFisher ScientificBP228-100İnceleme Malzeme Güvenlik Bilgi Formları
Bromofenol Mavi sodyum tuzuSigma-Aldrich114405-5G
Ksilen Siyanol FFSigma-Aldrich2650-17-1
Tris Baz (Beyaz Kristaller veya Kristal Toz/Moleküler Biyoloji)ThermoFisher ScientificBP152-5
Borik Asit (Kristal/ Elektroforez)ThermoFisher ScientificBP168-500
Akrilamid: Bis-Akrilamid 19:1 (%40 Çözelti/Elektroforez)ThermoFisher ScientificBP1406-1İnceleme Malzeme Güvenlik Bilgi Formları
Üre (renksiz-beyaz kristaller veya kristal toz/mol. Biol.)ThermoFisher ScientificBP169-212
Amonyum peroksodisülfat (APS) & ge; %98, Pro-Pure, Proteomik SınıfVWRM133-25G
SigmacoteSigma-AldrichSL2-100ML
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamin (TEMED) &; %99, UltrapureVWR0761-25MLİnceleme Malzeme Güvenlik Bilgi
Formları Ayarlanabilir Döşeme Jel Sistemleri, expedeonVWRASG-400
Dikey Jel Sarma ve ticaret; Cam Tabak Setleri, 16,5 x 14,5 cmVWRNGP-125NR
Dikey Jel Wrap ™ Cam Tabak Setleri, 16.5 x 22.0cmVWRNGP-200NR
Dikey Jel Wrap & trade; Cam Tabak Setleri, 16,5 x 38,7 cmVWRNGP-400NR
GE Depolama Fosfor EkranlarıSigma-AldrichGE28-9564
Typhoon & FLA 7000 Biyomoleküler GörüntüleyiciGE Healthcare28-9610-73 AB
Beckman Coulter LS6500 Sıvı Sintilasyon SayacıGMI8043-30-1194
C1000 Dokunmatik Termal DöngüleyiciThermoFisher Scientific
QuantStudio 6 Flex Gerçek Zamanlı PCR SistemleriThermoFisher Scientific

Kaynaklar

  1. Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
  2. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
  3. Ward, A. J., Cooper, T. A. The pathobiology of splicing. Journal of Pathology. 220 (2), 152-163 (2010).
  4. Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
  5. Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
  6. Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937(2018).
  7. Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130(2019).
  8. Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
  9. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565(2010).
  10. Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485(2009).
  11. Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
  12. Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
  13. Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
  14. Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
  15. Steitz, J. A., et al. Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).
  16. Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
  17. Roca, X., et al. Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
  18. Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
  19. Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
  20. Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
  21. Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Minigen Raporlay cPre mRNA EklemeEklem B lgesi MutasyonuU1 snRNAGe ici TransfeksiyonPrimer UzatmaRT PCRHeLa H creleri
Birleştirme Verimliliğini İzlemek için Muhabir Tabanlı Hücresel Test
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.