Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Strongyloides Türlerinde Mikroenjeksiyon ile Transgenik ve Nakavt Üretimi

2.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63023

⸱

7 Ekim 2021

 , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles

Bu makalede

Özet

Parazitik nematodlar Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti için fonksiyonel genomik araç seti transgenez, CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez ve RNAi'yi içerir. Bu protokol, transgenleri ve CRISPR bileşenlerini S. stercoralis ve S . ratti'ye tanıtmak için intragonadal mikroenjeksiyonun nasıl kullanılacağını gösterecektir.

Özet

Strongyloides cinsi, Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti dahil olmak üzere farklı konakçı aralıklarına sahip çok sayıda cilde nüfuz eden nematod türünden oluşur. S. stercoralis yaklaşık 610 milyon insanı enfekte eden insan-parazitik, cilde nüfuz eden bir nematoddur, sıçan paraziti S. ratti ise S. stercoralis ile yakından ilişkilidir ve genellikle S. stercoralis için bir laboratuvar modeli olarak kullanılır. Hem S. stercoralis hem de S. ratti, intragonadal mikroenjeksiyonun eksojen nükleik asit dağıtım tekniği ile transgenik ve nakavt oluşumuna kolayca uygundur ve bu nedenle, henüz bu tekniğe uygun olmayan diğer parazitik helmintler için model sistemler olarak ortaya çıkmıştır.

Paraziter Strongyloides yetişkinleri, konakçılarının ince bağırsağında yaşar ve dışkı yoluyla çevreye soy salgılarlar. Çevreye girdikten sonra, larvalar dışkıda yaşayan ve yeni bir konakçı bulması ve istila etmesi gereken soy üreten serbest yaşayan yetişkinlere dönüşür. Bu çevresel nesil, Strongyloides türlerine özgüdür ve morfolojide, C. elegans için geliştirilen tekniklerin, intragonadal mikroenjeksiyon da dahil olmak üzere bu parazitik nematodlarla kullanım için uyarlanabileceği serbest yaşayan nematod Caenorhabditis elegans modeline yeterince benzer. İntragonadal mikroenjeksiyon kullanılarak, Strongyloides'e çok çeşitli transgenler sokulabilir. CRISPR / Cas9 bileşenleri ayrıca mutant Strongyloides larvaları oluşturmak için mikroenjekte edilebilir. Burada, serbest yaşayan yetişkinlerin hazırlanması, enjeksiyon prosedürü ve transgenik döl seçimi de dahil olmak üzere Strongyloides'e intragonadal mikroenjeksiyon tekniği açıklanmaktadır. CRISPR / Cas9 mutagenezi kullanılarak oluşturulan transgenik Strongyloides larvalarının görüntüleri dahil edilmiştir. Bu makalenin amacı, diğer araştırmacıların transgenik ve mutant Strongyloides oluşturmak için mikroenjeksiyon kullanmalarını sağlamaktır.

Giriş

Strongyloides stercoralis uzun zamandır daha yaygın olarak tanınan kancalı kurtlara ve yuvarlak kurt Ascaris lumbricoides1'e kıyasla önemli bir insan patojeni olarak göz ardı edilmiştir. Solucan yükü ile ilgili önceki çalışmalar, S. stercoralis 2 için yaygın tanı yöntemlerinin düşük duyarlılığı nedeniyle S. stercoralis prevalansını sıklıkla ciddi şekilde hafife almıştır. Son yıllarda, gelişmiş tanı araçlarına dayanan epidemiyolojik çalışmalar, S. stercoralis enfeksiyonlarının gerçek prevalansının daha önce bildirilenden çok daha yüksek olduğunu, dünya çapında yaklaşık 610 milyon insanın2 olduğunu tahmin etmektedir.

Hem S. stercoralis hem de yakından ilişkili sıçan paraziti ve ortak laboratuvar modeli S. ratti de dahil olmak üzere diğer Strongyloides türleri, deneysel genomik çalışmalar için avantajlı olan alışılmadık bir yaşam döngüsüne sahiptir, çünkü hem parazitik hem de serbest yaşayan (çevresel) nesillerden oluşur3 (Şekil 1). Spesifik olarak, hem S. stercoralis hem de S. ratti, tek bir serbest yaşayan nesil boyunca döngü yapabilir. Serbest yaşayan nesil, serbest yaşayan yetişkin erkek ve dişilere dönüşen parazit sonrası larvalardan oluşur; Serbest yaşayan yetişkinlerin tüm soyları, yaşam döngüsüne devam etmek için bir konağı enfekte etmesi gereken enfektif larvalara dönüşür. Ayrıca, bu çevresel veya serbest yaşayan nesil laboratuvarda deneysel olarak manipüle edilebilir. Serbest yaşayan Strongyloides yetişkinleri ve C. elegans yetişkinleri benzer morfolojiyi paylaştığından, başlangıçta C. elegans için geliştirilen intragonadal mikroenjeksiyon gibi teknikler, serbest yaşayan yetişkin Strongyloides 4,5 ile kullanım için uyarlanabilir. DNA genellikle serbest yaşayan yetişkin kadınlara sokulmuş olsa da, Strongyloides'in hem erkekleri hem de dişileri mikroenjekte edilebilir6. Bu nedenle, Strongyloides'in biyolojisinin birçok yönünü sorgulamak için fonksiyonel genomik araçlar mevcuttur. Diğer paraziter nematodlar serbest yaşayan bir nesilden yoksundur ve sonuç olarak, fonksiyonel genomik tekniklere kolayca uygun değildir3.

figure-introduction-1
Resim 1: Strongyloides stercoralis yaşam döngüsü. S. stercoralis parazitik dişileri, memeli konakçılarının (insanlar, insan olmayan primatlar, köpekler) ince bağırsağında yaşar. Paraziter dişiler partenogenez ile çoğalır ve ince bağırsakta yumurta bırakır. Yumurtalar hala konakçının içindeyken parazit sonrası larvalara yumurtadan çıkar ve bunlar daha sonra dışkı ile çevreye geçirilir. Post-paraziter larvalar erkekse, serbest yaşayan yetişkin erkeklere dönüşürler. Post-paraziter larvalar dişi ise, serbest yaşayan yetişkin dişilere (dolaylı gelişim) veya üçüncü aşama enfektif larvalara (iL3'ler; doğrudan gelişim) dönüşebilirler. Serbest yaşayan erkekler ve dişiler, iL3'ler haline gelmek için kısıtlanmış soylar oluşturmak için cinsel olarak çoğalırlar. Belirli koşullar altında, S. stercoralis ayrıca parazit sonrası larvaların bir kısmının dışkıda çevreye geçmek yerine konakçı bağırsağın içinde kaldığı otoenfeksiyona da maruz kalabilir. Bu larvalar, konakçının içinde otoenfektif larvalara (L3a) dönüşebilir, bağırsak duvarından nüfuz edebilir, vücuttan göç edebilir ve sonunda üreme yetişkinleri olmak için bağırsağa geri dönebilir. S. ratti'nin yaşam döngüsü benzerdir, ancak S. ratti sıçanları enfekte eder ve otoenfektif bir döngüye sahip değildir. Çevresel üretim, genetik çalışmalar için Strongyloides türlerini kullanmanın anahtarıdır. Serbest yaşayan yetişkin dişiler (P0) mikroenjekte edilebilir; hepsi iL3'ler haline gelecek olan soyları, potansiyelF1 transgenikleridir. Bu rakam Castelletto ve ark.'dan değiştirilmiştir. 3. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

S. stercoralis biyolojisinin birçok yönünü konakçı istilası ve konakçı immün modülasyonu dahil olmak üzere diğer gastrointestinal insan-paraziter nematodlarla paylaşır. Örneğin, Necator ve Ancylostoma cinslerindeki insan-parazitik kancalı kurtlar da cilt penetrasyonu ile enfekte olur, vücutta benzer şekilde gezinir ve sonuçta ince bağırsakta parazitik yetişkinler olarak bulunur7. Bu nedenle, birçok gastrointestinal nematod muhtemelen ortak duyusal davranışları ve immün kaçınma tekniklerini kullanır. Sonuç olarak, Strongyloides'ten toplanan bilgiler, genetik olarak daha az izlenebilir diğer nematodlardaki bulguları tamamlayacak ve bu karmaşık ve önemli parazitlerin daha eksiksiz bir şekilde anlaşılmasına yol açacaktır.

Bu mikroenjeksiyon protokolü, transgenik ve mutant döl yapmak için DNA'yı Strongyloides serbest yaşayan yetişkin dişilere sokma yöntemini özetlemektedir. Mikroenjeksiyonlar için yetişkin solucanların gelişimsel zamanlaması ve transgenik söllerin toplanması da dahil olmak üzere suş bakım gereksinimleri açıklanmaktadır. Protokoller ve tüm mikroenjeksiyon tekniğinin bir gösterimi, transgenik söllerin kültürlenmesi ve taranması için protokollerle birlikte, gerekli tüm ekipman ve sarf malzemelerinin bir listesi ile birlikte dahil edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Gerbiller S. stercoralis'i geçmek için kullanıldı ve sıçanlar S. ratti'yi geçmek için kullanıldı. Tüm prosedürler, AAALAC standartlarına ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna uyan UCLA Hayvan Araştırma Gözetim Ofisi (Protokol No. 2011-060-21A) tarafından onaylanmıştır. Aşağıdaki görevler mikroenjeksiyondan en az bir gün önce tamamlanmalıdır: solucan kültürleme, mikroenjeksiyon pedleri hazırlama, mikroenjeksiyon karışımı için yapılar oluşturma ve bakterileri (E. coli HB101) 6 cm Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakalarına yayma8. Serbest yaşayan dişiler, mikroenjekte edilmeden önce genç yetişkinlere dönüşmek için 25 ° C'de en az 24 saat dışkı sonrası toplama gerektirir. Mikroenjeksiyon pedleri tamamen kuru olmalıdır. Bakteriyel plakalar kurumalı ve küçük bir çim oluşturmalıdır.

1. Mikroenjeksiyon slaytlarının hazırlanması: enjekte edilmeden en az bir gün önce

NOT: Solucanlar, enjeksiyon için kuru agar pedli mikroenjeksiyon kapaklarına monte edilir.

  1. Bir ısı bloğunu 90 °C'ye ayarlayın.
  2. Bir borosilikat cam tüpe 5 mL ddH2O, daha sonra 100 mg agaroz ekleyin.
  3. Agaroz karışımını, agaroz çözülene kadar tüpteki bir alev üzerinde ısıtın.
  4. Agarozu sıvı halde tutmak için tüpü 90 ° C'ye ayarlanmış bir ısı bloğuna yerleştirin.
  5. Agaroz çözeltisinin ~ 180 μL'sini bir cam Pasteur pipet veya plastik uçlu bir pipet kullanarak bir kapak kapağına bırakın. Agarozu ince bir ped halinde düzleştirmek için hemen üstüne ikinci bir kapak kayması bırakın.
  6. 5-10 sn sonra, ikisini birbirinden kaydırarak üst kapak kaymasını çıkarın. Agar pedinin hangi slaytta olduğunu belirleyin ve yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin.
  7. Kırık bir kapak kapağından küçük bir cam parçası seçin ve forseps kullanarak pedin üst kenarına yakın agara hafifçe bastırın (Ek Şekil S1).
  8. Agaroz çözeltisi ile mikroenjeksiyon pedleri yapmaya devam edin.
  9. Agaroz pedlerini gece boyunca bankta veya fırında kurutun. Coverslip kutusunda saklayın.
    NOT: Agaroz pedleri 2 aya kadar kullanılabilir, ancak yalnızca bir enjeksiyon çalışması için kullanılır.

2. Mikroenjeksiyon için solucanlar elde etmek için Strongyloides'in kültürlenmesi: enjeksiyondan 1 - 2 gün önce

NOT: Ek Materyalde, gerbillerin ve sıçanların nematodlarla nasıl enfekte edileceğine ve enfekte hayvanların dışkılarından nematodların nasıl toplanacağına dair ayrıntılı bir açıklama içeren bir gerinim bakım protokolü bulunabilir.

  1. Enjeksiyon gününden iki gün önce, enfekte olmuş hayvanları 9,10 gece boyunca toplama kafeslerine yerleştirin.
  2. Ertesi sabah, istila edilmiş dışkıları toplayın ve dışkı-kömür plakaları 9,10 yapın.
  3. Serbest yaşayan solucanların genç yetişkinlere dönüşmesine izin vermek için 24 saat boyunca 25 ° C'de bir plaka yerleştirin.
  4. Enjeksiyon gününden önceki gece, enfekte olmamış konakçı hayvanları toplama kafeslerine yerleştirin.
  5. Enjeksiyon gününde, enjeksiyon sonrası ekim için istila edilmemiş dışkı toplayın.

3. Mikroenjeksiyon karışımının yapılması: enjeksiyon gününden önce veya enjeksiyon gününde

NOT: Mikroenjeksiyon karışımı, solucan tamponlu salin (BU) içinde istenen konsantrasyona seyreltilmiş ilgili plazmidlerden oluşur (50 mM Na 2 HPO 4, 22 mM KH2PO4, 70 mM NaCl)11.

  1. Plazmid stoklarının konsantrasyonunu ve mikroenjeksiyon karışımında istenen konsantrasyonu belirleyin (Tablo 1).
Mikroenjeksiyon karışımı: muhabir yapısı
ParçaStok KonsantrasyonuMiktarSon Konsantrasyon
pMLC30 gpa-3::gfp 300 ng/μL1,7 μL50 ng/μL
BUNa8,3 μLNa
toplam10 μL50 ng/μL
Mikroenjeksiyon karışımı: CRISPR / Cas9 mutagenezi
ParçaStok KonsantrasyonuMiktarSon Konsantrasyon
pMLC47 vergi-4 sgRNA300 ng/μL2,7 μL80 ng/μL
pEY11 Ss-vergi-4 HDR plazmid400 ng/μL2,0 μL80 ng/μL
pPV540 strCas9 plazmid350 ng/μL1,1 μL40 ng/μL
BUNa4,2 μLNa
toplam10 μL200 ng/μL
Mikroenjeksiyon karışımı: piggyBac entegrasyonu
ParçaStok KonsantrasyonuMiktarSon Konsantrasyon
pMLC30 gpa3::gfp 300 ng/μL2,0 μL60 ng/μL
pPV402 transpozaz plazmidi450 ng/μL0,9 μL40 ng/μL
BUNa7,1 μLNa
toplam10 μL100 ng/μL

Tablo 1: Mikroenjeksiyon karışımlarına örnekler. Üç örnek mikroenjeksiyon karışımı için plazmidler ve konsantrasyonlar: biri gpa-3::GFP muhabiri yapı 10 için, biri Ss-tax-4 lokus 14,15'in CRISPR / Cas9 aracılı bozulması için ve biri de bir Ss-gpa-3::GFP yapısının piggyBac-aracılı entegrasyonu için 13,17,18. strCas9, Strongyloides kodon için optimize edilmiş Cas9 genini gösterir. Listelenen son konsantrasyonlar Strongyloides mikroenjeksiyon karışımlarında yaygın olarak kullanılır.

  1. BU'daki plazmidleri toplam 10-20 μL hacme kadar seyreltin.
  2. Karışımı 1-2 dakika boyunca 5.000 × g'lık bir filtre sütunundan döndürün.
  3. Mikroenjeksiyon karışımını hemen kullanın veya ileride kullanmak üzere -20 ° C'de saklayın.

4. Mikroenjeksiyon için genç yetişkin Strongyloides toplayın: enjeksiyon gününün sabahı

  1. Baermann aparatını 1 adet genç yetişkin Strongyloides fekal-kömür plakası ile kurun (Şekil 2).
    NOT: Fekal-kömür plakası bazı enfektif larvalar içerebilir. Kişisel koruyucu ekipman laboratuvar önlüğü, eldiven ve göz korumasından oluşur. Eldiven ile laboratuvar önlüğünün kılıfı arasında hiçbir cilt açığa çıkmamalıdır.

figure-protocol-1
Resim 2: Kültürlerden parazitik solucanlar toplamak için kullanılan Baermann aparatı10. Bir dışkı-kömür plakasının içeriği, bir ılık su sütununun üstüne yerleştirilir. Solucanlar suya göç eder ve huninin dibinde toplanır. (A) Baermann aparatını kurmak için, Baermann hunisinin standı bir C-kelepçesi ile tezgaha kelepçelenir. Huni ucuna tutturulmuş bir lastik tüp kıstırma kelepçeleri ile kapatılır ve damlamalar için tüpün altına bir yakalama kovası yerleştirilir. Cam huniye ılık su eklenir. (B) Fekal-kömür karışımı için plastik halka tutucu daha sonra 3 adet laboratuvar dokusu ile kaplanır (solda). Bir dışkı-kömür plakasının içeriğini (sağda) plastik halka tutucuya aktarmak için tahta bir çubuk veya dil depresörü (orta) kullanılır. (C) Fekal-kömür karışımı için plastik halka tutucunun tabanının yakın çekimi, tutucunun tabanını kaplayan çift naylon tül tabakasını gösterir. (D) Fekal-kömür tutucu daha sonra cam hunisinin üstüne yerleştirilir. (E) Laboratuvar dokusu su ile nemlendirilir ve fekal-kömür karışımı üzerine kapatılır. Çoğunlukla dışkı-odun kömürünü suya batırmak için daha fazla ılık su eklenir. (F) Baermann'ın komple kurulumu, fekal-kömür kültürü ılık suya batırılmış. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Bir O-ring kullanarak bir halka standına kauçuk toplama borulu bir cam huni takın ve bir kelepçe ile sabitleyin. Toplama borusunu 2 tutamlı kelepçelerle kapatın (Şekil 2A).
  2. Damlamaları yakalamak için huninin altına bir yakalama kovası yerleştirin.
  3. Huniye jantın 5 cm altına kadar ılık (yaklaşık 40 ° C) su ekleyin. Sistemin sızıntı yapmadığını doğrulayın.
  4. 2 plastik halkadan yapılmış, aralarında 2 kat naylon tül ağ bulunan ve üst üste binen 3 laboratuvar dokusu parçası bulunan Baermann tutucuyu hizalayın. Fekal-kömür karışımını Baermann tutucuya ekleyin (Şekil 2B,C).
  5. Baermann tutucuyu dışkı-kömür karışımı ile huniye yerleştirin. Dokuları fekal-kömür karışımının etrafına katlayın ve fekal-odun kömürünün çoğunu suya batırmak için yeterli su ekleyin. Huni kenarından 2 cm'nin üzerini doldurmayın (Şekil 2D,E).
  6. Kokuyu içermesi için huniyi 15 cm'lik plastik Petri kabı kapağı ile doldurun. Huni gerektiği gibi etiketleyin (Şekil 2F).
  7. Solucanları Baermann cihazından toplamak için 30 dakika ila 1 saat bekleyin.
  8. Huni'nin altındaki kauçuk borunun altında 50 mL'lik bir santrifüj tüpü tutun. 50 mL tüpe solucanlar içeren 30-40 mL su dağıtmak için alttaki kelepçeleri dikkatlice açın.
  9. Solucanları içeren Baermann suyunun 15 mL'sini 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. 15 mL santrifüj tüpünü ~ 750 × g'de (yavaş ) 1 dakika boyunca döndürün. Alternatif olarak, solucanların yerçekiminin 10-15 dakika boyunca yerleşmesine izin verin.
  10. Süpernatantı ~ 2 mL'ye çıkarın ve herhangi bir solucanı öldürmek için süpernatantı iyotlu bir atık sıvı kaba atın.
  11. 15 mL toplama tüpüne daha fazla Baermann suyu ekleyin ve spini tekrarlayın. Süpernatantı ~ 2 mL'ye çıkarın ve adım 4.11'deki gibi atın.
  12. Tüm solucanlar 15 mL santrifüj tüpünde toplanana kadar 4.11 ve 4.12 adımlarını tekrarlayın. Son dönüşten sonra, mümkün olduğunca fazla su çıkarın.
  13. Tüpün dibindeki solucan peletini (40-100 μL) inceleyin. Hiçbir solucan görünmüyorsa, 1-2 saat daha bekleyin ve Baermann cihazından daha fazla solucan toplamayı deneyin.
  14. Solucanları mümkün olduğunca az su içinde, E. coli HB101 çim ile 6 cm2% NGM plakasına aktarın. Bu plakayı mikroenjeksiyon için kaynak plaka olarak kullanın.
  15. Fekal-kömür karışımını, seyreltilmiş iyotla (Lugol'un iyotunun% 50 seyreltilmesi) sulandırarak, damlamaları yakalamak için plastik filme sararak ve biyolojik olarak tehlikeli bir atık kabına yerleştirerek atın.
  16. Yakalama kovasına 10 mL seyreltilmiş iyot ekleyin ve fazla suyu Baermann'dan içine boşaltın.
  17. Yeniden kullanılabilir bileşenleri (huni, yakalama kovası, tüllü plastik tutucu, plastik kapak ve kelepçeler) % 10 ağartıcı ile yıkayın ve iyice durulayın.

5. Mikroenjeksiyon iğnelerinin çekilmesi ve yüklenmesi: enjeksiyondan hemen önce

  1. Bir iğne çektirme makinesi kullanarak cam kılcal tüpleri çekerek mikroenjeksiyon iğneleri hazırlayın.
    NOT: 3 mm platin/iridyum filamenti ile donatılmış ticari bir iğne çektirme makinesi için örnek ayarlar Isı = 810-820, Çekme = 800-820, mikrometre = 2,5'tir.
  2. İpuçlarını diseksiyon mikroskobu altında görüntüleyin. İğneler istenen şekle sahipse (Şekil 3A-F), 4-6 iğne (2-3 kılcal tüp) çekin. Uygun iğne şeklini elde etmek için, ayarları gerektiği gibi değiştirin: Isı veya Çekme ayarlarını 10 ile ayarlayın ve konik ve şaftın şekli daha uygun olana kadar yeni iğneler çekin.

figure-protocol-2
Şekil 3: Mikroenjeksiyon iğneleri ve mikroenjeksiyon için en uygun bölgelere sahip bir Strongyloides stercoralis yetişkin dişi tanımlanmıştır. (A-F) Mikroenjeksiyon iğnelerinin görüntüleri. (A-B) Mikroenjeksiyon için doğru şekillendirilmiş bir iğnenin şaft konikliği (A) ve ucu (B). Uç, kütikülü delecek kadar keskin ve aşırı hasara neden olmayacak kadar dardır. (C-D) Mikroenjeksiyon için yanlış şekillendirilmiş bir mikroenjeksiyon iğnesinin şaft konik (C) ve ucu (D). Ucu çok künt ve geniştir ve solucana aşırı zarar verir. (E-F) Mikroenjeksiyon için çalışmak için çok uzun ve ince olması muhtemel bir iğnenin şaft koniği (E) ve ucu (F). F'deki uç, D'deki uca çok benzer. Bununla birlikte, şaft kütikülü etkili bir şekilde delmek için daha dar ve esnektir. Ek olarak, çok ince iğneler kolayca tıkanır. (G) İğnenin sağdan geldiğini varsayarsak, mikroenjeksiyon için doğru şekilde yerleştirilmiş tüm solucanın görüntüsü. Anterior aşağı ve sola; vulva ok ucu ile gösterilir. Gonad dişinin sağ tarafı boyunca görülebilir. Bu dişinin rahminde sadece bir yumurta vardır (yıldız işareti ile gösterilir). (H, I) Mikroenjeksiyon bölgelerinin büyütülmüş görünümleri. Okun açısı, enjeksiyon iğnesinin açısına yaklaşır. Vulva bir dönüm noktası olarak kullanılabilir; gonadın kollarından solucanın karşı tarafındadır. Gonadın kolları bağırsağın etrafında kıvrılır ve bölünen çekirdeklerin uçları vulvanın karşısındadır. (H) Gomadın arka kolu; (I) ön kol. Bunlardan biri veya her iki kol enjekte edilebilir. H, I için, sözleşmeler G'deki gibidir. Ölçek çubukları = 50 μm (B, D, F, H, I); 100 μm (A, C, E, G). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. İğneleri sabitlemek ve uçlarda toz birikmesini önlemek için çekilen iğneleri 15 cm'lik plastik bir Petri kabında bir parça haddelenmiş bantla saklayın.
  2. Mikroenjeksiyon karışımının 0,7 μL'lik bir damlasını şaftın açık ucuna yerleştirin. Konik şaftı 10 dakika içinde karışımla doldurmak için haddelenmiş bir bant parçası kullanarak iğneyi rafa dik olarak asın. İlkinin işe yaramaması durumunda bir seferde 2 iğne hazırlayın.

6. Mikroskobun hazırlanması ve iğnenin kırılması

NOT: Mikroenjeksiyon, iğnenin hareketini kontrol etmek için bir mikroenjektör kurulumuyla donatılmış 5x ve 40x hedefleri olan ters çevrilmiş bir mikroskop kullanır. Ters çevrilmiş mikroskop, titreşim gürültüsünü azaltmak için ağır bir masaya veya titreşim önleyici hava tablasına yerleştirilmelidir. Mikroenjektör iğne tutucusu, mikroenjeksiyon karışımını iletmek için gereken basıncı uygulayan azot gazına bağlanır. Solucanları aktarmak için yakındaki daha küçük bir diseksiyon mikroskobu kullanılır.

  1. Sıvı akışına bağlı olarak, iğneyi kırmak için gaz tankı basıncını ~ 40-60 psi'ye ve mikroenjeksiyon için ~ 30-50 psi'ye ayarlayın.
  2. Diseksiyon mikroskobunda, mikroenjeksiyon pedi kapağı üzerindeki cam parçasını, standart bir platin solucanı toplama kullanarak halokarbon yağı ile örtün.
  3. Mikroenjeksiyon pedi kapağını mikroenjeksiyon kapsamına yerleştirin ve yağla kaplı cam parçasını bulun. Cam parçasını, iğneyi kırmak için kullanılan yüzey olarak hizmet etmek için bir kenar iğnenin yönüne dik olacak şekilde hizalayın.
  4. Diseksiyon mikroskobunu kullanarak iğnenin konik şaftta kabarcık veya döküntü olmadığını doğrulayın. Ardından, iğneyi basınçlı tutucuya 1-1,5 cm sabitleyin.
  5. İğnenin ucunu mikroskop görüş alanının merkezine gözle yerleştirin. Daha sonra düşük büyütme altında, iğnenin ucunu cam parçasının yanına dik olarak görüş alanına yerleştirin.
  6. Yüksek güce geçin ve iğnenin ucunu camın kenarıyla, yakınına yakın ancak dokunmadan hizalayın.
    NOT: Çekildiğinde, iğneler kapalı olarak kaynaştırılır.
  7. Sıvı akışına izin vermek üzere iğnenin ucunu kırmak için, gazdan sürekli basınç uygularken cam parçasının yan tarafına hafifçe dokunun (Ek Şekil S1). Sıvı akmaya başladığında, ucun şeklini kontrol edin ve kolayca akan sıvı ile keskin olduğundan emin olun.
    NOT: Sıvı çok hızlı akıyorsa veya ucu çok küntse, mikroenjeksiyon sırasında solucanlar zarar görecektir (Video 1 ve Şekil 3A-F).
  8. Sıvı iğneden iyi akarken, mikroenjeksiyon kaydırağını diseksiyon kapsamına taşıyın ve solucanların yerleştirilmesi için agar pedine 1-2 μL halokarbon yağı damlaları yerleştirin.
  9. Fazla yüzey bakterilerini uzaklaştırmak ve mikroenjeksiyon için tek solucanları seçmek için 20-30 genç yetişkin Strongyloides'i bakterisiz %2'lik bir NGM plakasına en az 5 dakika boyunca aktarın. Enjekte ederken gerektiğinde NGM plakasına daha fazla solucan ekleyin.

7. Mikroenjeksiyon Strongyloides

  1. Bakterisiz% 2 NGM plakasından gonadında 1-4 yumurta bulunan bir Strongyloides genç yetişkin dişi seçmek için solucan seçiminde az miktarda halokarbon yağı kullanın.
  2. Solucanı agar pedi üzerinde küçük bir yağ damlasına aktarın. Solucan seçimini kullanarak, solucanı yavaşça sarılacak ve gonad görünür ve erişimi kolay olacak şekilde konumlandırın. Gonadın yönüne dikkat edin (Şekil 3G).
  3. Solucanı mikroenjeksiyon mikroskobu görüş alanına yerleştirin. Gondanın iğne ile aynı tarafta olduğundan ve iğnenin gonadla hafif bir açıyla temas edecek şekilde konumlandırıldığından emin olun (Şekil 3H, I).
  4. İğnenin ucunu aynı odak düzleminde solucanın yanına getirin. Solucanın ortasına yakın gonad kolunu hedefleyin. İğneyi nazikçe gonadın içine sokmak için mikroenjektörü kullanın (Video 2).
  5. Tüm gonad kolunu DNA çözeltisi ile nazikçe doldurmak için derhal iğneye basınç uygulayın. Yeterli sıvının ne zaman enjekte edildiğini gözle belirleyin (Video 2).
    NOT: Gonadın doldurulması 2 sn'ye kadar sürebilir.
  6. İğneyi çıkarın ve yaranın kapandığını belirlemek için kontrol edin.
    NOT: Gonad vücut duvarından çıkıntı yaparsa solucan soy üretmek için çok hasar görür (Ek Video S1).
  7. Görünürse gonadın diğer koluyla tekrarlayın.
  8. Enjeksiyon bittiğinde, iğnenin ucuyla agar pedi üzerine basınç uygulayarak iğnenin tıkanmadığını hızlı bir şekilde doğrulayın. Slaytı enjekte edilen solucanla diseksiyon mikroskobuna aktarın.
  9. Enjekte edilen solucanı kurtarmak için, önce agar pedinden yüzdürmek için solucanın üzerine birkaç damla BU yerleştirin.
  10. Bir solucan yavrusu üzerinde az miktarda HB101 bakterisi toplayın. Solucanı sıvıdan çıkarmak için solucan üzerindeki yapışkan bakterilerle solucana dokunun.
  11. Solucanı nazikçe HB101 çim içeren %2'lik bir NGM plakası olan geri kazanım plakasına aktarın.
    NOT: Solucan birkaç dakika içinde emeklemeye başlamalıdır.
  12. Birkaç dişi enjekte edildikten sonra, kaynak plakadan enjekte edilmemiş bazı erkekler ekleyin.
    NOT: Beş kadın için en az bir erkek iyi bir temeldir; fazla erkek tercih edilir.
  13. Deney için yeterli sayıda kadın enjekte edilene kadar tüm adımları tekrarlayın.
  14. Solucanların iyileşmesine ve çiftleşmesine izin vermek için yetişkinleri enjeksiyondan sonra en az 1 saat boyunca kurtarma plakasında bırakın.

8. Enjekte edilen Strongyloides'in geri kazanılması ve kültürlenmesi

  1. Enfekte hayvanlarla aynı protokolü kullanarak, enfekte olmamış konakçı hayvanlardan bir gecede dışkı toplayın.
  2. İnfüze edilmemiş dışkıyı az miktarda odun kömürü ile karıştırın (bu plakalar için dışkı - kömür oranı yaklaşık 2 ila 1).
  3. Az miktarda dışkı-kömür karışımını, nemli filtre kağıdı ile kaplı 6 cm'lik bir Petri kabına dökün. Karışımın tabağın kapağına temas etmediğinden emin olun.
  4. 3 μL'de ayarlanmış bir pipet kullanarak, solucanları dışkı-kömür plakasındaki dışkıya aktarın. Solucanları odun kömürüne değil, doğrudan dışkıya yerleştirin.
  5. Yetişkinlerin diseksiyon kapsamı kullanarak fekal-kömür plakasında olduğunu doğrulayın.
  6. Solucanları kültürlemek için, plakayı nemlendirilmiş bir odaya, yani nemli kağıt havlularla kaplı sıkı oturan bir kapağı olan plastik bir kutuya yerleştirin.
    NOT: 2 gün sonra, larva aşamalarının bir karışımı olacaktır. 5 gün sonra, larvaların çoğu iL3'lere dönüşmüş olacaktır; birkaç genç larva kalacak. 7 gün sonra, tüm larvalar iL3s olmalıdır.

9. Transgenik / nakavtları kurtarmak için F 1 larvalarının toplanması ve taranması

  1. Bir Baermann kurulumu kullanarak, larvaları enjeksiyon sonrası küçük ölçekli dışkı-kömür kültür plakalarından toplayın. Mümkün olduğunca çok larva elde etmek için, solucanları Baermann cihazından kurtarmadan önce en az 2 saat bekleyin.
  2. Larvaları 4.10-4.14 adımlarında olduğu gibi 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde yoğunlaştırın ve larvaları BU'lu küçük bir saat camına aktarın.
  3. Larvalar davranışsal deneyler için kullanılacaksa, tarama için kalın bir HB101 çimi ile% 2 NGM plakaları kullanın.
    1. 20-30 larvayı HB101 çimlerine aktarın.
      NOT: Bakteriler larvaların hareketini yavaşlatacaktır.
    2. Bir floresan diseksiyon mikroskobu altında, ilgilenilen transgeni ifade eden larvaları tanımlayın. Transgenik larvaları seçmek için bir solucan seçimi kullanın ve onları BÜ'lü küçük bir saat camına taşıyın.
    3. Başka bir küçük larva grubunu taramak için yeni bir HB101 plakası kullanın. Deneysel kullanım için yeterli larva toplandığında, HB101 plakalarını ve fazla solucanları seyreltilmiş iyotla (suda seyreltilmiş Lugol'un iyotunun% 50'si) tedavi edin ve biyolojik tehlike atıkları olarak atın. Alternatif olarak, alkil benzil amonyum klorürler içeren konsantre köpek kulübesi temizleyici kullanarak fazla solucanları öldürün.
    4. Solucanları hemen kullanın veya bir gecede az miktarda BU içinde sığ bir saat camında bırakın.
      NOT: Sıvı çok derinse solucanlar hipoksik hale gelebilir. Larvaları bir gecede BU'da bırakmanın belirli davranışları etkilemesi mümkündür; Bu nedenle, larvaları 6 saat içinde davranışsal deneyler için kullanın.
  4. Larvalar davranışsal tahliller için değil, mikroskopi için kullanılacaksa, solucanları tarama için geri dönüşümlü olarak nikotin felci ile hareketsiz hale getirin.
    1. Bir tıraş bıçağı kullanarak, solucanların plaka üzerindeki yerini takip etmeyi kolaylaştırmak için 10 cm'lik bir kemotaksis plakası12'nin plastik tabanına bir ızgara sürün.
    2. BÜ'deki ~ 3 μL larvayı ızgaradaki bir kareye bırakın. Gerektiği kadar kare doldurun. Larvalar plakanın kenarlarına kadar sürünebileceğinden, plakanın kenarlarına yakın olanları kullanmayın.
    3. Solucan damlalarına suya 15-20 μL damla% 1 nikotin ekleyin.
      NOT: 4 dakika sonra solucanlar felç olacaktır.
    4. Bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanarak solucanları tarayın.
    5. Transgenik larvaları 1-2 mL BÜ'lü küçük bir saat camına aktarmak için bir solucan seçimi kullanın.
      NOT: Larvalar birkaç saat boyunca felç olur ve mikroskopi için mikroskop slaytlarına kolayca monte edilebilir. BU'da bir gecede bırakılırsa, iL3'ler iyileşir ve bazı tahliller veya memeli konakçı enfeksiyonu için kullanılabilir. Bununla birlikte, nikotin felci ve BÜ'de bir gecede inkübasyon bazı davranışları etkileyebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Deney başarılı olursa,F1 larvaları ilgilenilen transgen ve / veya mutant fenotipini ifade edecektir (Şekil 4). Bununla birlikte, dönüşüm oranları oldukça değişkendir ve yapılara, solucanların sağlığına, enjeksiyon sonrası kültürleme koşullarına ve deneycinin becerisine bağlıdır. Genel olarak, başarılı bir deney, enjekte edilen dişi başına >15 F1 larva ve floresan belirteçler için% >3'lük bir dönüşüm oranı verecektir. Toplam canlı döl sayısı ortalama 10 larva / diş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu mikroenjeksiyon protokolü, transgenez ve CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez için yapıları S. stercoralis ve S. ratti'ye tanıtma yöntemlerini detaylandırır. Hem S. stercoralis hem de S. ratti için, enjeksiyon sonrası sağkalım ve transgenez veya mutajenez oranı, ince ayar yapılabilen çeşitli değişkenlere tabidir.

Başarılı transgenez için ilk kritik düşünce, plazmid transgenlerinin nasıl oluşturulduğudur. Önceki çalışmalar, Strongyloides'teki eksojen transgenl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

pPV540 ve pPV402, Pennsylvania Üniversitesi'nden Dr. James Lok'un nazik hediyeleriydi. Astra Bryant'a makale hakkındaki yararlı yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Hastalığın Patogenezinde Burroughs-Wellcome Fonu Araştırmacıları Ödülü, Howard Hughes Tıp Enstitüsü Fakülte Bursiyeri Ödülü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 DC017959 (E.A.H.) tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(&eksi;)-Nikotin, ≥ %99 (GC), sıvıKurtları felç etmek içinSigma-AldrichN3876-5ML
3" demir C-kelepçe, 3" x 2" (kapasite x derinlik)VWR470121-790Tezgah üstü kurulumu sabitlemek için C-kelepçe
Slaytlar için Agarose LEPhoenixRBA-500agaroz
Kemik kömürü, 4 lb kova, 10 x 28 ağDışkı-odunEbonexyok
Kemik kömürü, granüller, 10 x 28 ağReadebonechar10x28odun kömürü (yukarıdakilere alternatif)
Kaba mikromanipülatörNarishigeMMN-1kaba mikromanipülatör
Corning Costar Spin-X santrifüj tüpü filtreleriFisher07-200-385mikrofiltre sütunu
Kapak camı, 48 x 60 mm, No. 1 kalınlıkBeyin Araştırma Laboratuvarı4860-1lameller (48 x 60 mm)
Derin Petri kapları, 6 havalandırma deliği, 100 mm çaplı ağır versiyonVWR82050-91810 cm Petri kapları (dışkı-kömür kültürleri için)
Eisco imbik tabanı, çubukluFisher12-000-101Baermann cihazı için stand
Eppendorf FemtoJet mikro enjektör mikro yükleyici uçlarıVWR89009-310mikroenjeksiyon iğnelerini doldurmak için
Fisherbrand emici alt pedler Fisher14-206-62tezgah kağıdı (hazırlamak için)
Fisherbrand Dökme Demir HalkalarFisher14-050CQBaermann o-ring
Fisherbrand üç köşeli polipropilen beherler Fisher14-955-111FPlastik beher (karıştırma için)
Fisherbrand üç köşeli polipropilen beherlerFisher14-955-111FPlastik beher (yakalama kovası/su kovası için)
Fisherbrand üç köşeli polipropilen beherlerFisher14-955-111FPlastik beher (x2) (tutucu yapmak için)
Şırıngada Gorilla epoxieMcMaster-Carr7541A51tutkal (boru takmak için)
Halokarbon yağı 700Sigma-AldrichH8898-50MLhalokarbon yağı
Yiyecek ve içecek için yüksek sıcaklıkta silikon kauçuk boru, 1/2 "ID, 5/8" ODMcMaster-Carr3038K24boru (huni için)
KIMAX hunileri, uzun sap, 60 derece; Açı, Kimble ChaseVWR89001-414Baermann hunisi
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science tezgah üstü koruyucularFisher15-235-101tezgah kağıdı (hazırlamak için)
Floresan özellikli Leica stereomikroskopTransgenik solucanları tanımlamak ve sıralamak içinLeicaM165 FC
microINJECTOR pirinç düz kol iğne tutucuTritechMINJ-4mikroenjeksiyon iğne tutucu
microINJECTOR sistemiTritechMINJ-1mikroenjeksiyon sistemi
Moğol GerbilleriCharles Nehri Laboratuvarları213-S. stercoralis'in bakımı için Moğol Gerbil gerbilleri, erkek 4-6 hafta
Nasco Whirl-Pak kolay kapatılabilir çantalar, 18 ozVWR11216-776Whirl-Pak numune torbaları
Naylon tül (ağ)Jo-Ann Kumaşlarzprd_14061949aBaermann tutucu için naylon örgü
Platin tel, 36 Gauge, inç başınaThomas Scientific1233S72solucan penaları için platin/iridyum tel
Püriten dil bastırıcılar, 152 mm (U) x 17,5 mm (G)VWR62505-007ahşap çubuklar (numuneleri karıştırmak için)
QIAprep Spin Miniprep Kiti (250)QIAGEN27106QIAGEN mini hazırlık kiti
Sıçanlar-Uzun EvansEnvigo140 HsdBlu:LES. ratti'nin bakımı için uzun Evans sıçanları, dişi 4-6 hafta
Sıçanlar-Sprague DawleyEnvigo002 Hsd: Sprague Dawley S. ratti'nin bakımı için SD sıçanlar, dişi 4-6 hafta
Gerçekten Kullanışlı Kutular kapaklı yarı saydam saklama kutuları, 1,6 L kapasiteli, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16"Ofis Deposu452369nemlendirilmiş oda
için plastik kutularÇoban teknoloji panosu, 8 x 16,5 inçNewco999589teknoloji panosu
Paslanmaz çelik yükseltilmiş tel zeminAncareR20SSRWFtel kafes altları
StalkMarket kompostlanabilir çatal bıçak takımı kaşıkları, 6", beyaz, 1.000'lik paketOfis Deposu9587303kaşık
Stender kabı, istifleme tipi, 37 x 25 mmCarolina (Bilim)741012saat gözlükleri (küçük, yuvarlak)
StereomikroskopMoticK-400 LEDdiseksiyon hazırlık kapsamı
Depolama çantası, renk açık/beyaz, dış yükseklik 4-7/8 inç, dış uzunluk 13-5/8 inç, SterilitGrainger53GN16nemlendirilmiş hazne için plastik kutular
Sutter P-30 mikropipet çektirmePlatin/iridyum filamentli SutterP-30/P
Syracuse saat gözlükleriFisherS34826saat gözlükleri (büyük, yuvarlak)
Thermo Scientific Castaloy sabit açılı kelepçelerFisher05-769-2Qhuni kelepçeleri (2x)
Üç eksenli asılı joystick yağ hidrolik mikromanipülatörNarishigeMM0-4ince mikromanipülatör
Birleşik Mohr pinchcock kelepçeleriFisherS99422Sıkıştırma kelepçeleri (2x)
Havalandırmalı, keskin kenarlı Petri kapları (60 mm çap)Tritech AraştırmaT3308P6 cm Petri kapları (küçük ölçekli dışkı-kömür kültürleri için)
VWR hafif hizmet tipi doku silecekleriVWR82003-820Baermann tutucu
saat camı için astar, kare, Carolina'da 1-5/8(Bilim)742300saat camı (küçük, kare)
Whatman kalitatif sınıf düz daireler, derece 1, 5,5 cm çapFisher09-805Bfiltre kağıdı (6 cm Petri için tabaklar)
Whatman kalitatif sınıf düz daireler, sınıf 1, 9 cm çapFisher09-805Dfiltre kağıdı (10 cm Petri kapları için)
World Precision Instrument borosilikat cam kılcal, 1,2 mm x 4 inçFisher50-821-813mikroenjeksiyon iğneleri için cam kılcal damarlar
X-Acto Bıçakları, 11 No'lu Bıçaklı 1 No'lu BıçakOfis Deposu238816Solucan kazmalarını tutmak için bıçaksız X-Acto bıçakları
Zeiss AxioObserver A1Zeissn/aters mikroskop
nikotin kömürü kültürleri için kömürü Dışkı kültürleri için , , GFP stereomikroskop iğne çektirmesi

Kaynaklar

  1. Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165(2013).
  2. Buonfrate, D., et al. The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection. Pathogens. 9 (6), 468(2020).
  3. Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals. Journal of Experimental Biology. 223, Pt Suppl 1 206482(2020).
  4. Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2006).
  5. Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. WormBook. , ed. The C. elegans Research Communnity (2013).
  6. Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline. International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).
  7. Schafer, T. W., Skopic, A. Parasites of the small intestine. Current Gastroenterology Reports. 8 (4), 312-320 (2006).
  8. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).
  9. Gang, S. S., et al. Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode. PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675(2017).
  10. Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. The C. elegans Research Community, WormBook. , (2007).
  11. Hawdon, J. M., Schad, G. A. Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals. Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).
  12. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  13. Junio, A. B., et al. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR. Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).
  14. Gang, S. S., et al. Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).
  15. Bryant, A. S., et al. A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes. Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).
  16. Lok, J. B. Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes. Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).
  17. Shao, H., et al. Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines. PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871(2012).
  18. Lok, J. piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes. Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417(2013).
  19. Li, X., et al. Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements. International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).
  20. Bryant, A. S., Hallem, E. A. The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes. G3. 3 (7), (2021).
  21. Crane, M., et al. In vivo measurements reveal a single 5'-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 9192(2019).
  22. Han, Z., et al. Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes. Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).
  23. Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems. Scientific Reports. 9 (1), 483(2019).
  24. Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti. Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).
  25. Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).
  26. Kim, A., Pyykko, I. Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool. Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).
  27. Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing. Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).
  28. Farboud, B., Meyer, B. J. Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design. Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).
  29. Cheong, M. C., et al. Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118(2021).
  30. Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).
  31. Li, X., et al. Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti. Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).
  32. Viney, M. E. Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti. Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).
  33. Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode. PLoS ONE. 7 (6), 38587(2012).
  34. Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1. PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370(2009).
  35. Douglas, B., et al. Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations. PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Strongyloides TransgenikleriStrongyloides Nakavtlarntragonal MikroenjeksiyonCRISPR Cas9 MutajeneziParazit NematodlarDNA MikroenjeksiyonuTransgenik Larva Se imiKonak Parazit Etkile imiGen Fonksiyon AnaliziNematod B y me Besiyeri
Strongyloides Türlerinde Mikroenjeksiyon ile Transgenik ve Nakavt Üretimi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.