Odaklanmış İyon Işını Taramalı Elektron Mikroskobu Verilerini Kullanarak İnce Hücre Altı Nöronal Yapıların 3D Rekonstrüksiyonu ve Analizi

Summary

Kullanıcı dostu açık kaynaklı yazılım paketlerini kullanarak odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu görüntü hacimlerinde ince hücre altı nöronal süreçleri tanımlamak, görselleştirmek ve ölçmek için esnek bir metodolojik boru hattı.

Abstract

Taramalı elektron mikroskobu teknolojilerindeki son gelişmeler artık ultra ince hücre altı süreçlerin hızlı üç boyutlu (3D) analizine izin vermektedir. Burada, diğer nöronların presinaptik butonlara ('spinüller' olarak adlandırılır) çıkıntı yapanlar gibi ince nöronal süreçleri tanımlamak, görselleştirmek ve analiz etmek için metodolojik bir boru hattı sunulmaktadır. Ücretsiz olarak kullanılabilen yazılım paketlerini kullanan bu protokol, odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM) görüntü hacimleri içinde morfolojik kriterleri kullanarak ortak nöronal hücre altı yapıların tanımlanması için bir karar ağacının nasıl kullanılacağını gösterir ve presinaptik butonlara çıkıntı yapan çeşitli spinüllerin tanımlanmasına özellikle dikkat edilir. Özellikle, bu protokol, bu ince hücre altı projeksiyonların, ana nöritlerinin ve postsinaptik ortaklarının 3D rekonstrüksiyonlarını üretmek için nöronal sinapslar içindeki spinüllerin nasıl izleneceğini açıklar. Ek olarak, protokol, FIB-SEM verilerini analiz etmek için ücretsiz olarak kullanılabilen açık kaynaklı yazılım programlarının bir listesini içerir ve görselleştirme ve yayınlama için 3D rekonstrüksiyonları iyileştirmeye yönelik ipuçları (örneğin, yumuşatma, aydınlatma) sunar. Bu uyarlanabilir protokol, FIB-SEM görüntü hacimleri içindeki hücre altı yapıların hızlı nano ölçekli analizine bir giriş noktası sunar.

Introduction

Nanometre inceliğinde hücre altı bileşenlerin yapı-fonksiyon ilişkilerine ilişkin araştırmalar genellikle 3D görselleştirme ve analizden yararlanır¹. Bununla birlikte, seri kesit iletim elektron mikroskobu çalışmaları, yüzlerce ila binlerce ≥40 nm seri ultra ince kesiti kesmek ve hizalamak için bir elmas bıçak kullanma gerekliliği ile zamansal ve mekansal olarak kısıtlanmıştır. Bu kısıtlamalar, ince (<40 nm çapında) hücre altı yapıları örnekleme ve etkili bir şekilde analiz etme yeteneğini sınırlamıştır ve ultra ince seri kesit almada yetkin olma gerekliliği, 3D yapısal analizlerin^{uygulanmasını} engellemiştir ^2,3. Bununla birlikte, odaklanmış iyon demeti taramalı elektron mikroskobundaki (FIB-SEM) son gelişmeler, elde edilebilir görüntü hacimlerinin hızında ve çözünürlüğünde devrim yaratmıştır ve şimdi pürüzsüz endoplazmik retikul^4,5, nöronal sinapslar ^3,6 ve sinaptik veziküller ^7,8 gibi ince hücre altı yapıların kantitatif analizine izin vermektedir ölçekte. Ek olarak, FIB-SEM görüntü hacimlerinin daha geniş kullanımı, bu teknolojinin erişimini genişleten ve şimdi ince hücre altı yapıların yapısı ve işlevine ilişkin araştırmaları mümkün kılan, serbestçe erişilebilen FIB-SEM görüntü hacmi depoları⁹ ve 3D analiz yazılımının (örneğin, Espina¹⁰, IMOD¹¹, Neuromorph¹², Reconstruct¹³, TrakEM¹⁴) geliştirilmesini hızlandırmıştır.

Böyle bir nano ölçekli hücre altı özellik, nöronal sinaptik 'spinül'dür. Spinüller incedir (~ 0.06-0.15 μm genişliğinde, 0.1-1 μm uzunluğunda), bir nörondan yayılan ve başka bir nöronun nöriti (örneğin, presinaptik bouton) tarafından kapsüllenen parmak benzeri çıkıntılar^15,16. Nöronal süreçlere gömülü spinüller, elektron mikroskobu literatüründe yaklaşık 60 yıldır bildirilmiştir¹⁷ ve spinül benzeri çıkıntılar, uyarıcı sinapsların korunmuş 18,19,20 ve her yerde bulunan ^21,22 özelliğidir. Bununla birlikte, sinaptik spinüllerin yaygınlığına rağmen, işlevleri belirsiz kalmaktadır ve bolluklarını ve yapısal korunmalarını açıklamak için gerekli veri eksikliği vardır. Spinüllerin deneysel karakterizasyonunun bu eksikliği, çoğunlukla spinül prevalansını ve boyutlarını kantitatif olarak analiz etmenin zorluğundan kaynaklanmaktadır. Küçük boyutları, daha önce ulaşılamayan bir z (derinlik) çözünürlüğü (yani ≤15 nm) kullanan analizler için en uygun olanıdır.

Burada, FIB-SEM'e yeni başlayanlar ve benzer şekilde uzmanlar için bir giriş noktası olarak hizmet edebilecek ince (kesitli ≤40 nm genişliğinde) hücre altı yapıların tanımlanması, görselleştirilmesi ve analiz edilmesi için bir FIB-SEM analiz hattı sunulmaktadır. Bu protokol, bir 3D FIB-SEM görüntü hacmi içindeki nöronal hücre altı yapıları tanımlamak için bir astar görevi görür ve spinüllerin ve sinapsların alt tiplerini tanımak ve sınıflandırmak için belirli kriterlerin nasıl kullanılacağını vurgular. Ek olarak, protokol, görüntü hacimlerinin ücretsiz bir 3D analiz yazılım platformuna (Reconstruct) nasıl aktarılacağını, bu yazılımın uyarıcı nöronal sinapslar içindeki spinülleri izlemek için nasıl kullanılacağını ve bu hücre altı projeksiyonların, ana nöritlerinin ve kapsülleyici presinaptik butonların 3D rekonstrüksiyonlarının nasıl üretileceğini gösterir. Son olarak, protokol, görselleştirme ve potansiyel yayın için 3D rekonstrüksiyonlarda 'cildi' yumuşatmak için ücretsiz, açık kaynaklı 3D rending yazılımının (Blender) nasıl kullanılacağını gösterir ve bu tekniğin avantajlarını ve potansiyel tuzaklarını detaylandırır.

Protocol

1. Görüntü hacmi verileri ve hücre altı nesne boyutu: dikkat edilmesi gerekenler ve kayıt

1. İlgilenilen hücre altı nesneleri içeren ilgi alanının kaliteli bir FIB-SEM görüntü hacmini elde edin.
   NOT: Bu protokol, geç ergen gelincik birincil görsel korteksinden (24.2 x 16.2 x 2.4 μm, 4 nm izotropik vokseller) bir FIB-SEM görüntü hacminin segmentlerini ve yetişkin sıçan CA1 hipokampusundan (10.2 x 7.7 x 5.3 μm; 5 nm izotropik vokseller) serbestçe erişilebilir bir FIB-SEM hacmini kullanır Knott laboratuvarı (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/) tarafından kullanıma sunulmuştur. FIB-SEM görüntüleme koşulları altında ultrastrüktürel detayı koruyan ve yüksek kontrast üreten bir protokol kullanarak FIB-SEM için doku blokları hazırlamak çok önemlidir^23,24. Önemli olarak, doku, elde edilen FIB-SEM görüntü voksel çözünürlüğü, ilgilenilen en küçük hücre altı yapının çapının boyutunun × <0.5 olacak şekilde görüntülenmelidir. Örneğin, presinaptik butonlara spinül çıkıntısı bölgelerinin çapı 30 nm kadar küçük olabileceğinden, bu yapıları Nyquist kriterinin üzerinde örneklemek için <15 nm'lik bir voksel boyutu uygun olacaktır. Ek olarak, tüm x/y/z düzlemlerinde eşit boyutlara sahip ince yapıların görselleştirilmesini ve yeniden yapılandırılmasını sağlamak için dokuyu izotropik (tüm boyutlarda eşit) çözünürlükte (örneğin, 5 x 5 x 5 nm vokseller) görüntülemek yararlıdır.
2. ImageJ^25'in (https://imagej.net/software/fiji/downloads) Fiji dağıtımını indirin ve yükleyin.
3. Görüntü ses düzeyini hizalayın.
   NOT: Modern FIB-SEM sistemleri kabaca hizalanmış görüntü hacimleri üretirken, görüntüden görüntüye kayıt yine de alt piksel kaymasından muzdarip olabilir.
   1. Fiji'de şuraya gidin: Eklentiler | Kaydedin ve Sanal Yığın Dilimlerini Kaydet'i seçin. Yardım için Kullanım Kılavuzuna bakın (https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices). Katı bir kayıtla başlayın ve ardından gerekirse bir Afine tekniği kullanın.
4. Görüntü hacmini ölçeklendirin.
   1. Dosya | İthalat | Görüntü Sırası ve hizalanmış görüntülerin bulunduğu klasöre gitme.
   2. İletişim penceresinde, görüntüler sayısal sırayla adlandırılmışsa Adları sayısal olarak sırala'ya tıklayın. Daha hızlı Fiji performansı için sanal yığını kullan'a tıklayın.
   3. Görüntü açıldıktan sonra, Görüntü | Özellikler ve görüntü hacmi piksellerinin fiziksel boyutunu piksel yüksekliği, genişliği ve derinliği kutularına mikrometre cinsinden ekleyin. En sağdaki kutuların her birine um VEYA μm yazın. Bu hizalanmış görüntü birimini .tiff Dosya | Farklı Kaydet | Öğr.
      NOT: Görüntü ölçeklendirilmişse, görüntünün üst kısmı artık görüntünün boyutunu mikrometre cinsinden göstermelidir (ör. 9,82 x 8,65 μm).

2. Nörit ve sinaptik spinül tanımlaması

1. Yığında gezinirken (ok tuşlarını veya fare tekerleğini kullanarak), ilgilenilen nesneleri bulmak ve tanımlamak için nörit tanımlama karar ağacına (Şekil 1) ve bölümlere ayrılmış nörit örneklerine (Şekil 2) bakın.
   1. Sinaptik spinülleri, presinaptik veya postsinaptik nörit içinde tamamen sarılmış bir nöritten zara bağlı çıkıntılar olarak tanımlayın.
      NOT: Pozitif sinaptik spinül tanımlaması, presinaptik veya postsinaptik bir yapının ters çevrilmiş zarına istila eden spinül çıkıntılı nesne zarının görsel kanıtını ve en az bir görüntüde pre- veya postsinaptik yapının zarı tarafından tamamen kapsüllenmiş zara bağlı spinülün varlığını gerektirir.
2. Fiji'de ilgi alanları (ROI'ler) oluşturma
   1. Fiji araç çubuğunda uygun bir araca tıklayın (örneğin, oval araç) ve ardından bir yatırım getirisi oluşturmak için resme tıklayın ve sürükleyin. Bu yatırım getirisini ROI Yöneticisine "T" harfini yazarak kaydedin.
      NOT: ROI Yöneticisi artık varsayılan adı olarak görüntü koordinatlarıyla birlikte görünmelidir.
   2. ROI Yöneticisi'ndeki Yeniden Adlandır düğmesine tıklayarak ve görüntülenen metin kutusuna istediğiniz adı yazarak ROI'yi istediğiniz gibi yeniden adlandırın. ROI'leri kantitatif kriterlere göre yeniden adlandırın (örneğin, analiz edilen ve postsinaptik dikenlerle iki sinapsa sahip olan 12^. presinaptik bouton B12_s,s olarak adlandırılabilir).
      NOT: Her bir ROI'yi tek bir görüntü "dilimi" ile ilişkilendirmek (tüm görüntü yığınında bulunması yerine) ve YG adlarını tek görüntülerde görünür hale getirmek için YG Yöneticisi | Devamı | Seçenekler penceresini açın ve ardından ROI Yöneticisi'nin altındaki Tümünü ve Etiketleri Göster onay kutularını tıklatın. ROI'leri bir görüntü hacmi içinde kaydederken bu adımın çok önemli olduğunu unutmayın, çünkü ROI'leri tek tek görüntüler yerine tüm görüntü hacmiyle ilişkilendirmek, birim içindeki nesnelerin iki kez sayılmasına neden olabilir.
   3. Şu anda ROI yöneticisinde bulunan tüm ROI'leri bir dosya olarak kaydetmek için önce ROI Yöneticisi'ndeki Seçimi Kaldır düğmesine tıklayın, Daha Fazla düğmesine tıklayın ve Kaydet'e gitmek için aşağı kaydırın.
      NOT: Bu kaydedilen .zip dosyası artık tüm bu ROI'leri ROI Manager'a yeniden yüklemek için Fiji'de açılabilir.

3. İlgi alanını belirleyin ve görüntü hacmini 3D analiz yazılımına aktarın

1. Tüm görüntü hacminin 3B yeniden yapılandırma ve analiz yazılımına aktarılmasının istenip istenmediğini veya orijinal yığından daha az sayıda görüntüyü ve/veya ilgilenilen bölgeyi analiz etmek için daha küçük bir alt yığın (bkz. 3.3.2) oluşturulması gerekip gerekmediğini belirleyin.
2. İstatistiksel karşılaştırmalar için istenen gücü elde etmek için etki boyutunu ve ilgilenilen nesne sayısını tahmin etmek için ilgilenilen nesne(ler)i içeren nispeten küçük bir alanda küçük bir 'pilot' çalışma yapın. Bu alt hücre nesneleri görüntü hacmi içinde eşit olmayan bir şekilde dağılmışsa, ilgilenilen nesneleri örneklemek için gereken görüntü hacminin boyutunun muhafazakar bir tahminini kullanın.
3. Görüntü hacminin bir kısmını 3D analiz için kullanmak için, önce Görüntü | Çoğaltın.
   1. Analiz için görüntünün kırpılmış bir bölümünü kullanmak için, Fiji araç çubuğundan dikdörtgen aracını seçin ve istediğiniz ilgi alanını çizin; Bu istenmiyorsa, bir sonraki adıma geçin.
   2. Resme Git | Yığınlar | Araçlar | Alt yığın yapın. Metin kutusuna alt yığına dahil edilecek görüntü aralığını yazın (örneğin, 1 - 500 yazarak 1'den 500'e kadar olan görüntüleri dahil edin).
   3. İlgilenilen nesne(ler)in boyutuna bağlı olarak gerekli z-çözünürlüğünü belirlemek için yukarıdaki örnekleme hususlarına bakın (1.1'den sonraki not). Örneğin, görüntü hacminin voksel derinliği 5 nm ise, Fiji'nin alt yığındaki diğer tüm görüntüleri tutması için ilgilenilen nesneyi z boyutunda 10 nm aralıklarla örneklemek mümkündür. Bunu yapmak için, aralıktan sonra gelen n'inci görüntünün numarasını yazın (örneğin, yalnızca 1 - 500 görüntü aralığındaki diğer tüm görüntüleri dahil etmek için 1 - 500 - 2 yazın).
      NOT: Her 3D analiz yazılım paketinin (bkz. Tablo 1) kendi dosya içe aktarma gereksinimleri olacaktır. Bu protokol, .tiff dosyaları olarak kaydedilen görüntü birimlerini görüntü birimi yazılımı Reconstruct'a aktarmaya odaklanır.

4. 3D Rekonstrüksiyonu ve Rekonstrüksiyonda İnce Hücre Altı Yapıların Analizi

NOT: Reconstruct'ı kullanırken tekerlek ile donatılmış bir fare kullanmak oldukça avantajlıdır. Ayrıca, izlemelerin çoğu veya tümü manuel olarak gerçekleştirilecekse, dokunmatik ekranlı bir bilgisayarda ana hatlar çizmek için ekran kalemi kullanmak iz verimliliğini önemli ölçüde artırabilir.

1. Yerel veya sanal bir ortamda Microsoft Windows çalıştıran bir bilgisayarda kullanmak için Reconstruct'ı (https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) indirin ve yükleyin.
2. Yeniden yapılandırma dosyaları için yeni bir klasör oluşturarak, Seriler | Yeni ve bu yeniden yapılandırmayı (.ser dosyası) yeni oluşturulan klasörde istenen dosya adıyla kaydetme.
3. Kaydedilen .tiff görüntü birimini Yeniden Yapılandır'a aktarın.
   1. Seriye Git | İthalat | Görüntüler, Görüntüleri İçe Aktar penceresinde Seç'i tıklatın ve görüntü birimi dosyasını bulun. Görüntüleri İçe Aktar penceresinde, birimdeki her görüntü için ayrı bir satır olarak görünen görüntü birimi dosyalarını arayın.
   2. Önemli: Görüntü hacminin x/y piksel boyutuna (μm cinsinden) karşılık gelen Piksel Boyutu metin kutusuna doğru piksel boyutunu yazın. Bu yapıldıktan sonra, Görüntüleri İçe Aktar penceresindeki İçe Aktar düğmesine tıklayın.
      NOT: Görüntüler içe aktarıldıktan sonra, Yeniden Yapılandır penceresinin ortasında bir görüntü olmalı ve Görüntüleri İçe Aktar listesi boş olmalıdır.
   3. Reconstruct (Yeniden Yapılandır) penceresinin ortasında bir görüntü varsa ve Import Images (Görüntüleri İçe Aktar) listesi boşsa, Import Images (Görüntüleri İçe Aktar) penceresinde Quit (Çık) düğmesine tıklayın.
   4. Kesit kalınlığını (yani, voksel yüksekliği veya z boyutu) Bölüme tıklayarak ayarlayın | Bölümleri listeleyin, listelenen tüm bölümleri vurgulayın ve ardından Değiştir | Kalınlık Kesit Listesi menüsünde ve kesit kalınlığını (μm cinsinden) metin kutusuna yazma (örneğin, 5 nm kalınlığındaki bir kesit için 0,005).
      NOT: Yalnızca her n'inci bölümü içeren daha büyük bir orijinal görüntü biriminden bir alt yığınla çalışıyorsanız (bkz. adım 3.3.3), toplam bölüm kalınlığında bu 'eksik' bölümleri hesaba katmak gerektiğini unutmayın. Örneğin, orijinal görüntü hacmi kesit kalınlığı (diğer adıyla voksel yüksekliği) 0,005 μm ise ve alt yığın yalnızca her üç bölümü de içeriyorsa (ör. 1-500-3), bu alt yığının kesit kalınlığı 0,015 μm'dir (yani 0,005 μm x 3 bölüm).
4. İlgilenilen nesnelerin izlerini çıkarın.
   1. Seriye Git | Seçenekler | Yeni nesneye bir ad vermek için Adlar/Renkler Sekmesi. Nesnenin izlerinin anahattı ve iç dolgusu için bir renk seçin ve Tamam'ı tıklatın.
      NOT: Yeniden Yapılandırma , aynı ada sahip tüm izlemeleri tek bir nesneyle bağlamaya çalışır. İzleme adlandırma kuralları için Yeniden Yapılandırma kılavuzuna bakın (örneğin, adlarda boşluk eklemeyin). İz renkleri yalnızca izleri görselleştirmek içindir; bu nesnenin 3D rekonstrüksiyonunun rengi daha sonra kolayca değiştirilebilir.
   2. Araç Çubuğu'nda, kurşun kaleme benzeyen Serbest El Çiz aracını seçin. Nesnenin zarını izlemek için farenin sol düğmesini basılı tutun ve fareyi sürükleyin; İzlemeyi otomatik olarak tamamlamak için farenin sol düğmesini bırakın. Görüntü hacmindeki bir sonraki optik bölüme ilerlemek için Page Up / Page Down'a tıklayın veya fare tekerleğini kullanın ve yapı tamamlanana kadar aşamalı olarak izler yapın.
5. Sinaptik spinüllerin izlenmesi
   NOT: Presinaptik butonlar içindeki gömülü spinüller, bazen aktin benzeri elektron-opak malzeme ve/veya iç kısımlarında zar benzeri kıvrımlar ile zara bağlı şeffaf yapılar olarak görünür.
   1. Spinülleri endoplazmik retiküllerden, vakuollerden, endozomlardan, otofagozomlardan ve diğer hücre altı organellerden ayırt etmeye dikkat ederek, görüntü hacmi boyunca ilerleyin ve spinül istilasının presinaptik bouton'a yerleştirildiği bölgeyi bulun.
      NOT: Zara bağlı organellerin aksine, sinaptik spinüllerin her zaman bir nörit/gliadan (yani everted zardan) çıkıntı yaptığından ve bir pre- veya postsinaptik yapı (yani ters çevrilmiş zar) tarafından alındığından emin olun. Spinül invaginasyonunun bu görsel kanıtı ≥2 görüntüde ortaya çıkmalı ve ≥1 görüntüde pre- veya postsinaptik yapı içinde tam kapsüllenmiş membrana bağlı bir spinül bulunmalıdır. Küçük spinüller klatrin kaplı olabilir. Spinül istilası olaylarını klatrin kaplı endositozdan postsinaptik veya postsinaptik nörite ayırt etmek için, klatrin kaplı spinüllerin pozitif olarak tanımlanmasının, aynı görüntü içinde bir pre- veya postsinaptik yapının ters çeviren zarına çıkıntı yapan spinül ana nesnesinden çakışan everting zarının görsel olarak doğrulanmasını gerektirdiğinden emin olun.
   2. Spinül projeksiyonunun/kökeninin ana nörit/gliasından bulunduğu yeri bulmak için görüntü hacminde ilerleyin; Bu ana yapıları tanımlamaya yardımcı olması için Şekil 1 ve Şekil 2'ye bakın.
   3. Alıcı yapıya (örneğin, presinaptik bouton) zar çıkıntısı bölgesinde spinülün izine başlayın ve spinülü, kapsülleyici pre- veya postsinaptik nörit içinde zara bağlı bir yapı olarak göründüğü sürece çizmeye devam edin.
   4. Fare imleci ile omurga zarını izlerken farenin sol düğmesini basılı tutmaya devam edin (veya dokunmatik ekranlı bir bilgisayar kullanıyorsanız bir kalemle omurga zarı boyunca çizmeye devam edin).
   5. İzlemenin başladığı noktaya ulaşıldığında, farenin sol düğmesini bırakın.
      NOT: Farenin sol düğmesini çok erken bırakmak, izlemeyi otomatik olarak tamamlar ve genellikle istenmeyen sonuçlarla sonuçlanır. Böyle bir durumda, bu izleme İzleme Listesi'nde vurgulanırken sil düğmesine basmanız yeterlidir.
   6. Omurganın göründüğü her bölüm için 4.5.2-4.5.5 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Uygun olduğunda, spinülü bouton içinde kapsüllenmiş zara bağlı bir yapı olarak izlemeyi unutmayın. Reconstruct , kapsüllenmiş hücre altı yapıların (örneğin, spinüller, hücre altı organeller) kapsülleyici yapının hacminden otomatik olarak çıkarılmasına izin vermediğinden, bu post-hoc olarak gerçekleştirilebilir (örneğin, presinaptik bouton'un toplam hacminden spinül hacmini çıkararak).
6. Reconstruct'ta nesneleri 3B olarak yeniden yapılandırma
   1. Seriye Git | Seçenekler | 3D sekmesine gidin ve İzler radyo düğmesinin tıklandığından emin olun.
   2. Nesneler | Nesneleri listeleyin.
   3. İzlenen nesne(ler)in adları pencereye yüklendikten sonra, 3B olarak görüntülemek için Nesne Listesi'ndeki nesne(ler)in adına çift tıklayın. 3B Sahne penceresinin görünmesini bekleyin.
   4. İzlemelerin başlangıç, bitiş ve sayılarının her nesne için Nesne Listesi'nde doğru olduğundan emin olun, böylece Sayı = Bitiş - Başlat. Bir nesne için Count ≠ End - Start ise, bu nesneden bir veya daha fazla izleme yanlışlıkla atlanmış olabilir.
   5. Yakınlaştırmak ve uzaklaştırmak için farenin sol düğmesini basılı tutarak ve fareyi hareket ettirerek ve/veya sağ fare düğmesini basılı tutarak ve fareyi ileri ve geri hareket ettirerek nesnelerin 3B izlerini döndürün. Nesnenin izlerinin uygun şekilde hizalandığından ve birbirini izleyen her iz arasında yumuşak bir geçiş varmış gibi göründüğünden emin olun.
   6. Gerekirse, keskin kenarlara ve/veya izler arasında geçişlere yol açan hataları kaldırmak için tek tek izleri yeniden izleyin.
   7. Seri'ye giderek nesnenin üzerine tetrahedral bir ağ kaplaması yerleştirin | Nesne | 3D sekmesine tıklayın ve Boissonnat yüzey radyo düğmesine tıklayın.
   8. 3B Sahne penceresinde, Sahne | Temizleyin, ardından Nesne Listesi'nde istediğiniz nesne adına çift tıklayın.
   9. İzler arasında yumuşak geçişler sağlamak için nesneleri döndürün ve gerekirse izleri yeniden çizin.
   10. Nesne renklerini ve saydamlığını değiştirmek için, Nesne Listesi'nde nesnenin adına tıklayın ve ardından Sahne | Renk/şeffaflık... Nesne Listesi menüsünde. Bu değişikliği 3B Sahne penceresinde görüntülemek için Nesne Listesi'ndeki nesne adına çift tıklayın.
       NOT: Nesne rengi, saydamlık ve yumuşatma, Blender kullanılarak daha yüksek derecede kontrol ve özgüllükle değiştirilebilir (bkz. 5.4-5.6).
7. 3D nesnelerin kantitatif analizi
   1. Seriye Git | Seçenekler | Listeler sekmesine tıklayın ve bu pencerenin Nesne Listesi ve İzleme Listesi bölümlerinde istenen tüm ölçümlere tıklayın.
   2. Nesne Listesi'ni açarak nesne ölçümlerini dışa aktarın (Nesne | Nesneleri listeleme...) ve ardından Liste | Kaydet'i tıklayın.
   3. Nesne ölçümlerini, Nesne Listesi'nde görüntülendiği gibi virgülle ayrılmış bir dosya (.csv) olarak kaydedin.
   4. .csv dosyasını tercih ettiğiniz veri analizi yazılımına aktarın. Bir elektronik tabloya (örneğin, Microsoft Excel) aktarmak için dosyayı çift tıklamanız veya yeni bir boş çalışma kitabı açmanız yeterlidir, Dosya | İthalat | CSV dosyası seçeneğini seçin ve talimatları izleyin.
   5. 3B nesneler arasındaki mesafeleri ölçmek için (örneğin, presinaptik bir bouton içindeki sinaptik bir spinülün projeksiyon mesafesini ölçmek için), Yeniden Yapılandır'da Z-izleme işlevini kullanın.
   6. İlk olarak, Seri | Seçenekler | Adlar/Renkler sekmesine gidin ve Z-trace için bir ad yazın.
   7. Ardından, araç çubuğundaki Z-trace aracına tıklayın.
   8. Sinaptik bir spinülün projeksiyon mesafesinin Z-izini çizmek için, farenin sol tuşuna tıklayarak sinaptik spinülün başlangıcına tıklayın ve ardından her bölümdeki sinaptik spinülün zarı boyunca ardışık noktalara tıklarken görüntü hacminde ilerlemek için Page Up veya Page Down düğmelerine basın.
   9. Farenin sağ tuşuna tıklayarak bu Z-izini tamamlayın.
   10. İzle'ye tıklayarak Z-trace ölçümlerini dışa aktarın | Liste izleri... İzleme Listesini açmak için ve ardından Liste | İzleme listesi ölçümlerini .csv dosyası olarak kaydetmek için Kaydet'i seçin.
8. Ölçek küpü ekleme
   1. Yığındaki ilk veya son görüntülerden birine gitme
   2. Seriye Git | Seçenekler | Adlar/Renkler sekmesine gidin ve ölçek küpü için bir ad yazın.
   3. Araç çubuğunda, Dikdörtgen Çiz aracını seçin ve nesnelerin yanına küçük bir kare (boyutu önemsiz) çizin, ancak onları gizlemeyin. Seriye Git | Seçenekler | 3B sekmesinde, Oluştur alanındaki Kutu radyo düğmesi seçeneğine tıklayın ve Boyut alanındaki A:, B:, C: kutularına boyutlarını yazarak ölçek küpünün boyutunu (μm cinsinden) belirtin (örneğin, 0,5 μm/yan ölçek küpü oluşturmak için A, B ve C için 0,5 yazın).
      NOT: Ölçek küpünü 3B olarak yeniden oluşturmaya çalışmadan önce, istenen 3B nesnelerin İzler veya Boissonnat yüzey seçeneğini kullanarak 3B Sahne'de yeniden oluşturulduğundan emin olun. Ölçek küpünü yeniden oluşturduktan sonra (yani, adım 4.8.5'ten sonra) Oluştur seçeneğini tekrar Boissonnat yüzeyine ve A, B ve C'nin boyutlarını tekrar -1'e değiştirmeyi unutmayın.
   4. Nesne Listesini açın ve ölçek küpünün adına çift tıklayın; ölçek küpünün 3B sahne penceresinde görünmesini bekleyin.
   5. Ölçek küpünü diğer nesnelere göre taşımak için Seri | Seçenekler | 3B sekmesine gidin ve ölçek küpünü X, Y ve/veya Z kutularına taşımak için istediğiniz μm sayısını yazın. Pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın ve ardından Nesne Listesi'ndeki ölçek küpünün adını çift tıklatın.
      NOT: Alternatif olarak, bu Blender kullanılarak yapılabilir (aşağıya bakın).

5. Blender'da 3B rekonstrüksiyonlara içe aktarma, yeniden renklendirme, yumuşatma ve saydamlık ekleme

NOT: Blender'ı kullanmayla ilgili ayrıntılı yardım için lütfen Blender kılavuzuna ve/veya her bir Blender işlevinin kullanımıyla ilgili sayısız "nasıl yapılır" videosuna bakın ( Blender VE İstenen İşlev için bir web araması yapmanız yeterlidir). Aşağıda, 3B rekonstrüksiyonların nasıl yeniden renklendirileceği, pürüzsüzleştirileceği ve bunlara şeffaflık ekleneceği hakkında kısa bir başlangıç yer almaktadır.

1. Ücretsiz, açık kaynaklı 3D yazılım paketi (www.blender.org) olan Blender'ın en son sürümünü indirin ve yükleyin.
2. Yeniden Yapılandır'da, 3B sahne penceresinde istenen nesneleri getirerek ve ardından Sahne | Farklı Dışa Aktar | VRML 2.0 olarak adlandırılır.
3. Blender'da Dosya | İthalat | X3D Genişletilebilir 3D (.x3d/.wrl). Reconstruct'tan kaydedilen VRML 2.0 dosyasına tıklayın ve ardından Import X3D/VRML2 düğmesine tıklayın.
4. Rekonstrüksiyonları yeniden renklendirin.
   1. Sahne Koleksiyonu penceresinde, sağ üst köşede, varsayılan Küp nesnesinin göz simgesinin seçimini kaldırmak/işaretini kaldırmak için tıklayın ve sahnedeki her bir nesneyi vurgulamak için tek tek nesnelerin adlarına tıklayın. Bu nesneleri uygun şekilde yeniden adlandırın.
   2. Sahne Koleksiyonu penceresinde yeniden renklendirilecek ilk nesnenin adına tıklayın.
   3. Dairesel Bağlama tıklayın. Sağ simge şeridinin altındaki Malzeme simgesini tıklatın ve ardından Malzeme Ekle'yi tıklatın. Aşağıda bir seçenekler listesi görünmelidir. Ardından, Temel Renk seçeneğinin yanındaki çubuğa tıklayın ve nesne için istediğiniz parlaklığı ve tonu seçin.
   4. Nesnenin metalik görünümünü, parlaklığını ve yansıtıcı niteliklerini değiştirmek için, istenen efekti elde etmek için Metalik, Aynasal, Pürüzlülük ve Parlaklık seçeneklerini ayarlayın.
      NOT: Sahnede belirli seçeneklerin görünmesi için (ör. saydamlık, parlaklık), Görüntü Alanı Gölgelendirmesi: Dev Görünümü veya Görüntü Alanı Gölgelendirmesi: Görüntü Alanı Gölgelendirmesi: Görüntü Alanı Oluşturuldu ayarında olmak gerekebilir. Her iki görünüm alanı ayarına geçmek için, sağ üstteki küre simgelerinin üzerine gelin ve istediğiniz görüntü alanı ayarına tıklayın.
   5. Aydınlatma açısını değiştirmek için, Sahne Koleksiyonu penceresindeki Işık nesnesine tıklayın, sağ üstteki Gizmo'yu Göster simgesine tıklayın ve ardından istenen aydınlatma efektini elde etmek için ışığı sahnenin etrafına sürükleyin. Light nesnesi seçiliyken Sahne Koleksiyonu penceresinin altında görünen Object Data (Nesne Verileri) penceresindeki ışık yoğunluğunu değiştirin.
   6. Nesneleri seçilen eksenlerde ayrı ayrı döndürmek için, Sahne Koleksiyonu penceresindeki nesnelerin adlarına tıklayın, R tuşuna basın, ardından dönme ekseninin harfine (x, y veya z tuşu) tıklayın ve istenen dönüşü elde etmek için fareyi hareket ettirin. Nesneleri tutmak ve taşımak için, Sahne Koleksiyonu penceresinde seçin, G tuşuna basın ve ardından nesneleri sahnede hareket ettirmek için fareyi kullanın.
5. Rekonstrüksiyonları yeniden mesh edin (yani pürüzsüzleştirin).
   1. Sahne Koleksiyonu penceresinden ilgilendiğiniz nesnenin adına tıklayın ve ardından nesneyi ortalamak ve yakınlaştırmak için gimball ve fare tekerleğini kullanın.
   2. Sağ simge şeridindeki Context.Modifiers İngiliz anahtarı simgesine tıklayın, Değiştirici Ekle'ye ve ardından Yeniden Mesh'e ( Oluştur başlığı altında) tıklayın. Pürüzsüz'ü seçmek için açılır menüyü kullanın, Pürüzsüz Gölgelendirme düğmesine tıklayın ve istenen pürüzsüzlüğü elde etmek için Octree Derinliği ve Ölçeğini değiştirin.
      NOT: Sonuçları doğrudan görüntülemek için yeniden ağ oluştururken Görüntü Alanı Gölgelendirme: Tel kafes penceresinde (sağ üstteki küre simgesi seçeneği) olmak yararlıdır. Yeniden ağ oluşturma, nesne üzerinde farklı boyutlarda tetrahedral ağlar oluşturacaktır. Kesit veya izleme kusurlarını kaldırmak için nesneyi düzgünleştirirken, orijinal şeklini ve konturlarını korumaya dikkat edin. Octree Derinliği = 7 ve Ölçek = 0.95 ile başlayın ve gerekirse bu sayıları yavaşça azaltın. Spinüller ve postsinaptik yoğunluklar gibi küçük, ince nesnelere özellikle dikkat edin, çünkü bu nesnelerin küçük hacmi, orijinal şekillerini değiştirmeden yapılabilecek yumuşatma aralığını azaltır.
6. Nesnelere saydamlık ekleyin.
   NOT: Nesneleri saydam yapmak, başka bir nesnenin (örneğin, presinaptik bouton) içinde bulunan bir nesnenin (örneğin, spinüller, presinaptik veziküller, mitokondri, endozomlar) 3B ilişkisinin gösterilmesi istendiğinde önemlidir.
   1. Sahne Koleksiyonu penceresinde istediğiniz nesne adına tıklayın. Bağlamın en altına kaydırın. Malzeme penceresi (sağdaki listede sağ alttaki simge), Ayarlar bölümünü açın ve Karışım Modunu Alfa Karışımı olarak değiştirmek için açılır menüyü kullanın. Ardından, Yüzey bölümünü açın, Alfa'ya kaydırın ve sayıyı birden küçük bir değere değiştirin (1 = tamamen opak, 0 = tamamen şeffaf).
7. 3B rekonstrüksiyonların anlık görüntülerini dışa aktarın.
   1. 3D rekonstrüksiyonlar için en uygun renklendirme, yumuşatma ve ışıklandırma elde edildikten sonra, Pencere menü başlığına tıklayarak ve Ekran Görüntüsünü Kaydet'i seçerek görüntüyü sahneye kaydedin.
   2. Sol alttaki Ekran Görüntüsünü Kaydet seçeneklerinde, istediğiniz dosya türünü, renk biçimini ve sıkıştırmayı seçin.
   3. Yukarıdaki dosya adı metin kutusuna yeni ekran görüntüsünün adını yazın ve ardından ekran görüntüsünü istediğiniz konuma kaydedin.

Results

Gelincik primer görsel korteksindeki uyarıcı presinaptik bouton popülasyonu içindeki sinaptik spinüllerin yüzdesinin ölçülmesi
Nöritlerden uyarıcı presinaptik butonlara spinul benzeri çıkıntılar onlarca yıldır gözlenmesine rağmen^19,26, sinaptik fonksiyon için potansiyel önemleri belirsizliğini korumuştur. Bu deneyler, gelişimsel kilometre taşlarıyla ilişkili olarak spinüllerin sinaptik fonksiyon için potansiyel önemini belirlemek için gelincik...

Discussion

Bu FIB-SEM görüntü hacmi analiz hattı, güvenilir 3D rekonstrüksiyonlar ve ince hücre altı yapıların kantitatif ölçümlerini üretebilir. Derin sinir ağı ve segmentasyon algoritmalarını kullanan mevcut yarı otomatik teknikler, büyük görüntü hacimlerinde^nispeten yüksek zar kontrastına sahip hücresel yapıların yeniden yapılandırılmasında hızı ve verimliliği artırabilirken3, birçok alt hücre yapısının (örneğin, spinüller, düz endoplazmik retiküller, endozomlar) alt zar ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiji (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Blender Blender	Vakfı'nı