Yöntem makalesi

Murine Retina'da AAV Transdüksiyon Verimliliğinin Nicelleştirilmesi için Dijital Damlacık PCR Yöntemi

DOI:

10.3791/63038

⸱

25 Aralık 2021

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Biology, Genetics and Bioengineering Program, Sabanci University, 2Nanotechnology Research and Application Center (SUNUM), Sabanci University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, küçük ölçekli AAV üretimi, intravitreal enjeksiyon, retina görüntüleme ve retina genomik DNA izolasyonu ile birlikte dijital damlacık PCR (dd-PCR) kullanarak fare retinasında AAV transdüksiyon verimliliğinin nasıl ölçüleceğini sunar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birçok retina hücre biyolojisi laboratuvarı artık gen düzenleme ve düzenleyici uygulamalar için rutin olarak Adeno ile ilişkili virüsler (AAV' ler) kullanmaktadır. AAV transdüksiyonunun verimliliği genellikle kritiktir ve bu da genel deneysel sonuçları etkiler. Transdüksiyon verimliliği için ana belirleyicilerden biri AAV vektörün serotipi veya varyantıdır. Şu anda, hücre yüzey reseptörlerini barındırmak için farklı benzeşimlere sahip çeşitli yapay AAV serotipleri ve varyantları mevcuttur. Retina gen tedavisi için bu, farklı retina hücre tipleri için çeşitli derecelerde transdüksiyon verimliliği ile sonuçlanır. Ayrıca enjeksiyon yolu ve AAV üretiminin kalitesi retina AAV transdüksiyon verimliliklerini de etkileyebilir. Bu nedenle, farklı varyantların, partilerin ve metodolojilerin verimliliğini karşılaştırmak önemlidir. Dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemi, nükleik asitleri yüksek hassasiyetle ölçerek belirli bir hedefin herhangi bir standart veya referans olmadan mutlak nicelleştirilmesini sağlar. DD-PCR kullanılarak, enjekte edilen bir retinadaki AAV genom kopya numaralarının mutlak nicelleştirilmesiyle AAV'lerin transdüksiyon verimliliklerini değerlendirmek de mümkündür. Burada, dd-PCR kullanarak retina hücrelerindeki AAV'lerin transdüksiyon oranını ölçmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Küçük değişikliklerle, bu metodoloji, mitokondriyal DNA'nın kopya sayısı nicelliğinin yanı sıra, birkaç retina hastalığı ve gen tedavisi uygulaması için kritik olan baz düzenlemenin verimliliğini değerlendirmenin de temelini oluşturabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adeno ilişkili virüsler (AAV'ler) artık çeşitli retina gen tedavisi çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. AAV'ler, daha az immünojeniklik ve daha az genom entegrasyonu ile güvenli ve verimli bir gen iletim yolu sağlar. Hedef hücreye AAV girişi, hücre yüzeyindeki reseptörlerin ve yardımcı reseptörlerin bağlanmasını gerektiren endositoz yoluylagerçekleşir 1,2. Bu nedenle, farklı hücre tipleri için AAV'lerin transdüksiyon verimliliği esas olarak kapsid ve konak hücre reseptörleri ile etkileşimlerine bağlıdır. AAV'lerin serotipleri vardır ve her serotip farklı hücresel/doku trompilerine ve transdüksiyon verimliliklerine sahip olabilir. Ayrıca virüs kapsid kimyasal modifikasyonu, hibrid kapsid üretimi, peptit ekleme, kapsid karıştırma, yönlendirilmiş evrim ve rasyonel mutajensis3tarafından oluşturulan yapay AAV serotipleri ve varyantları vardır. Amino asit dizisindeki veya kapsid yapısındaki küçük değişiklikler bile konak hücre faktörleri ile etkileşimler üzerinde bir etkiye sahip olabilir ve farklı tromizmlere neden olabilir4. Kapsid varyantlarına ek olarak, enjeksiyon rotası ve AAV üretiminin toplu olarak parçalanması gibi diğer faktörler, AAV'lerin nöronal retinadaki transdüksiyon verimliliğini etkileyebilir. Bu nedenle, farklı varyantlar için transdüksiyon oranlarının karşılaştırılması için güvenilir yöntemler gereklidir.

AAV transdüksiyon verimliliğini belirleme yöntemlerinin çoğu muhabir gen ekspresyonine dayanır. Bunlar floresan görüntüleme, immünohistokimya, batı lekesi veya muhabir gen ürününün histokimyasal analizi5,6,7içerir. Bununla birlikte, AAV'lerin boyut kısıtlaması nedeniyle, transdüksiyon verimliliğini izlemek için muhabir genlerini dahil etmek her zaman mümkün değildir. Hibrid CMV enhancer / tavuk beta-actin veya Woodchuck hepatit transkripsiyonel düzenleyici eleman (WPRE) gibi güçlü promotörleri bir mRNA stabilizatör dizisi olarak kullanmak boyut problemini daha da karmaşık hale gelir8. Bu nedenle, enjekte edilen AAV'lerin transdüksiyon oranını daha doğrudan bir metodoloji ile tanımlamak da faydalı olacaktır.

Dijital damlacık PCR (dd-PCR), hedef DNA'yı dakika miktarda numuneden ölçmek için güçlü bir tekniktir. dd-PCR teknolojisi, hedef DNA ve PCR reaksiyon karışımının yağ damlacıkları ile kapsüllenmesine bağlıdır. Her dd-PCR reaksiyonı binlerce damlacık içerir. Her damlacık bağımsız bir PCR reaksiyon9olarak işlenir ve analiz edilir. Damlacıkların analizi, sadece Poisson algoritmasını kullanarak herhangi bir örnekteki hedef DNA moleküllerinin mutlak kopya sayısının hesaplanmasına olanak tanır. AAV'lerin transdüksiyon verimliliği nöronal retinadaki AAV genomlarının kopya sayısı ile ilişkili olduğundan, AAV genomlarını ölçmek için dd-PCR yöntemini kullandık.

Burada, retinal genomik DNA6,10'danAAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini hesaplamak için bir dd-PCR metodolojisini açıklıyoruz. İlk olarak, tdTomato muhabirini ifade eden AAV'ler küçük ölçekli protokol kullanılarak oluşturulmuş ve dd-PCR yöntemi11ile titrilmiştir. İkincisi, AAV'ler intravitreal olarak nöronal retinaya enjekte edildi. Transdüksiyon verimliliğini göstermek için ilk olarak floresan mikroskopi ve ImageJ yazılımı kullanarak tdTomato ekspresyonını ölçtük. Bunu, DD-PCR kullanılarak enjekte edilen retinalarda AAV genomlarının nicelleştirilmesi için genomik DNA'nın izolasyonu izledi. tdTomato ekspresyon seviyelerinin dd-PCR ile ölçülen transdüklenmiş AAV genomları ile karşılaştırılması, dd-PCR yönteminin AAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini doğru bir şekilde ölçtüğü göstermiştir. Protokollerimiz, AAV transdüksiyon verimliliklerini ölçmek için dd-PCR tabanlı bir metodolojinin ayrıntılı bir açıklamasını göstermiştir. Bu protokolde ayrıca intravitreal enjeksiyonlardan sonra sadece genomik DNA izolasyonu ve dd-PCR sonuçlarından sonra seyreltme faktörü kullanılarak transdüklenen mutlak AAV genom sayısını gösteriyoruz. Genel olarak, bu protokol retinadaki AAV vektörlerinin transdüksiyon verimliliğini ölçmek için muhabir ifadesine alternatif olacak güçlü bir yöntem sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel protokoller Sabancı Üniversitesi etik kurulu tarafından kabul edilmiş ve hayvanların araştırmada kullanımı için 'Vizyon ve Oftalmoloji Araştırma Derneği' açıklamasına uygun deneyler yapılmıştır.

1. Küçük ölçekli AAV üretimi12

  1. Kültür HEK293T hücreleri kullanarak 15 cm plakalar tam 10 mL DMEM/%10 FBS%70-80 izdiah kadar.
  2. Transfeksiyon karışımını 5 mL DMEM'de 20 μg yardımcı plazmid (pHGT1-Adeno1), 7 μg kapsid plazmid ve 7 μg AAV2-CBA-tdTomato-WPRE vektörü ve 136 μL PEI çözeltisi (1 mg/mL) ile hazırlayın.
  3. 5 mL hazırlanan transfeksiyon karışımını 10 mL kültür ortamı içeren bir hücre kültürü kabına ekleyin ve transfected hücreleri 37 °C'de 48-60 saat kuluçkaya yatırın.
  4. Transfeksiyon sonrası 48-60 saat boyunca medyayı toplayın ve 37 °C'de 30 dakika boyunca 250 U/mL'lik son konsantrasyonda DNase I ile sindirin.
  5. Sindirilen ortamı 4000 x g, 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin ve ardından 0,22 μm şırıng filtresiyle önceden ıslanmış rejenezyon selüloz membranına 100 kDa filtre edin.
  6. Yenilenmiş selüloz membranı 4000 x g, 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin ve ortamı atın.
  7. Rejenerasyona uğramış selüloz membranı PBS ile yıkayın ve santrifüjleyin% 0.001 Pluronic F-68 4000 x g,4 °C'de 30 dakika boyunca üç kez. Her adımda PBS'yi atın.
  8. Daha fazla kullanım için rejenere selüloz zarının ve aliquot'un üst kısmından konsantre AAV'leri toplayın.
  9. Titerleme için 37 °C'de 15 dakika boyunca DNase I (0.2U/μl) ile 5 μL taze yapılmış AAV'yi sindirin. Bunu, hem DNase I'i inaktive etmek hem de viral kapsidleri bozmak için 95 °C'de 10 dakika inkübasyon izler.
  10. %0,05 Pluronic F-68 kullanarak sindirilmiş AAV'lerden 10 kat seri seyreltme hazırlayın. Titrasyon için AAV2-ITR ve WPRE astarlarını kullanın (Tablo 1). Titrler, dd-PCR sonuçlarının seyreltme faktörleri ile çarpılmasıyla hesaplandı. Sonuçlar genom kopyası/mL'ye (GC/mL) dönüştürüldü.
    NOT: Küçük ölçekli AAV üretimi için AAV konsantrasyonlarının 1 x 1012 GC/mL civarında olması beklenmektedir. Bu protokol, AAV'leri AAV213gibi medyaya verimli bir şekilde serbest bırakmayan AAV suşları için geçerli değildir.

2. AAV'nin intravitreal enjeksiyonu

  1. Ekipmanın hazırlanması
    1. Başlamadan önce, 36 G künt iğne ile 10 μL mikrosiiringe hazırlayın. %70 EtOH ile beş kez, ddH2O'da beş kez ve son olarak PBS ile beş kez durulayın.
    2. Her enjeksiyon için uygun miktarda AAV'yi mikrosyringe yükleyin.
    3. Cerrahi iğneyi (dikiş, ipek, 6/0), bant, asa ve makası hazırlayın.
  2. intravitreal enjeksiyon
    1. Göz bebeklerini genişletmek için anesteziden önce göz damlası içeren %0,5 tropitimad ve %2,5 fenilefrin hidroklorür (örneğin Mydfrin) 1 damla uygulayın.
    2. İsoflurane ile fareleri% 5 (1 L / dk) uyuşturun ve işlem sırasında% 1.5 izofluran (1 L / dk) ile devam edin. İlk indüksiyon için küçük bir izofluran odası kullanılır.
    3. Sağ refleks, geri çekilme refleksi ve kuyruk kıstırma yanıtını kaybederek anestezinin derinliğini doğrulayın.
    4. Enjeksiyon işleminden önce her göze %0,3 tobramisin ve %0,1 deksametazon steril oftalmik çözelti uygulayın. Göz damlası uygulaması kuruluğu önler ve antienflamatuar ve anti-bakteriyel etkiler uygular.
    5. Üst göz kapağını stabilize etmek için cerrahi kancayı kullanın. Gözün sırt kısmını açığa çıkarmak için hafifçe geri çekin. Kancayı yerinde tutmak için yedek kulübesine bantla.
    6. Diseksiyon mikroskobu altında gözün sklerasını ortaya çıkarmak için kavisli iris makası ile konjonktivayı(1mm 2'den az) çıkarın. Sklerayı delmek için taze ve steril bir insülin şırınnası (30 G) kullanın.
    7. Mikrosilapsilatörü kullanarak mikrosyringe iğnesini aynı delinme yoluyla yerleştirin. İğnenin ucunu lensin arkasına göz kapağının ortasına yerleştirin.
    8. 1 μL AAV2/BP2 ve AAV2/PHP enjekte edin. 1.63 x 1012 GC/mL ve 1.7 x 1012 GC/mL konsantrasyonlarına sahip S vektörleri yavaşça gözün vitreusuna girer. Enjeksiyon ses kontrolü manuel olarak yapılır. İğneyi 1 dakika yerinde bırakın ve iğneyi yavaşça çekin.
    9. Göz kapağını serbest bırakın ve göz kapağına% 0.3 tobramycin ve% 0.1 deksametazon içeren anti-enflamatuar ve anti-bakteriyel topikal jel tedavisi uygulayın. Fareleri sonraki günlerde görünüm (parlak gözler, bakımlı palto, kamburluk), davranış (aktivite, hareketsizleştirme, kendi kendine sakatlama) ve vücut ağırlığı açısından 0 ila 3 arasında bir ölçekte puan tablosuna göre izleyin ve değerlendirin. Her koşulun puanı 0-3'tür ve toplam puanı 3 veya üzeri bir fesih kriteridir.
    10. Hayvanları iyileştikten sonra kafese yerleştirin.

3. Floresan ve fundus görüntüleme

  1. Fareyi süzün ve her göze% 0.5 tropikamid ve% 2.5 fenilefrin hidroklorür damlaları yerleştirerek göz bebeğini genişletin.
  2. Yukarıdaki prosedürle hayvanı izofluran ile uyuşturun. Pençeleri kıstırarak anestezinin derinliğini dikkatlice değerlendirin.
  3. Fareyi görüntüleme aşamasına yerleştirin ve fundus kamerayı kontrol ederek uygun genişlemeyi doğrulayın. Gözleri anestezi altında susuzluktan korumak ve görüntüleme için kavrama jeli olarak kullanmak için gözlerin yüzeyine topikal jel (%0,2 karbomer 980) uygulayın.
  4. Hedefin burun parçasına hizalamak için görüntüleme aşamasını manipüle edin. Fare gözünü ortalamak için sahneyi gerektiği gibi ayarlayın. Göz ortalandıktan sonra, gözle temas edene kadar hedefi yavaşça hareket ettirün.
  5. İntravitreal enjeksiyondan 1 hafta ve 2 hafta sonra tdTomato ekspresyonünü takip etmek için her iki gözde fundus ve floresan görüntüleme gerçekleştirin (Şekil 3B)14. Muhabir ifadesini karşılaştırmak için fundus ve floresan görüntülerini aynı ayarlarda alın.

4. Retina izolasyonu

  1. 2 haftalık zaman noktasında retina koleksiyonu için CO2 inhalasyonu ile fundus ve floresan görüntülemeden sonra hayvanları ötenazi.
  2. 13,5 cm ayırıcı forseps yardımıyla göz küresini öne doğru kaydırın.
  3. Lensi,ps ile hafif basınç uygulayarak arta kalan vitreus ile birlikte çıkarın.
  4. Göz küresinin optik sinire olan bağlantısını hassas kavisli tokalarla kesin ve retinayı aynı kavisli tokalarla hafifçe sıkın.
  5. Parçalanmış retinaları mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  6. Tüpleri sıvı nitrojene yerleştirerek retinayı dondurun.

5. Doku genomik DNA izolasyonu

  1. Genomik DNA'yı ticarileştirilmiş Proteinaz K sindirime dayalı doku genomik DNA kiti ile izole edin.
  2. Retinayı 55 °C'de, 200 x g'da 30 dakika boyunca, kit içinde zaten tedarik edilen Proteinase K ile sindirin.
  3. RNase inkübasyon adımı gerçekleştirin, adımları yıkama tamponu I ve II ile yıkayın ve son olarak üreticinin protokolüne göre elution adımı uygulayın.
  4. Kalan etanol kaldırmak için son yıkamadan sonra ekstra bir spin adımı ekleyin.
  5. Genomik DNA konsantrasyonu ölçün ve örnekleri -20 °C'de saklayın.

6. Viral genomların nicelleştirilmesi için fare retina örneklerinin damlacık dijital PCR analizi

  1. Enjekte edilen retinalardan genomik DNA'ları %0,05 Pluronic F-68 çözeltisinde seyrelterek her örnek için 1 ng/μL'lik son konsantrasyona ulaşın.
  2. Her astar için 125 nM son konsantrasyona sahip hedefe özgü astarları kullanarak WPRE ve 18S için ayrı reaksiyonlar gerçekleştirin.
  3. 1 ng genomik DNA, 125 nM primer ve 2x evagreen supermix dahil olmak üzere 20 μL PCR reaksiyon karışımında damlacık üretimi gerçekleştirin.
  4. Damlacık üretimi için numune karışımını kartuşun orta kısmına yükleyin.
  5. Kartuşa numune yüklemesi yapıldıktan sonra, kartuşun alt sırasına damlacık üretim yağının 70 μL'lik kısmını ekleyin.
  6. Contayı kartuşun üzerine koyun ve damlacık jeneratörüne yerleştirin. Conta ile kartuş arasında boşluk olmadığından emin olun.
  7. Üst kuyuda üretilen yaklaşık 40 μL damlacıkları hafifçe alın. Damlacık solüsyonını yarı etekli 96 kuyulu PCR reaksiyon plakasına ekleyin.
  8. Alüminyum sızdırmazlık folyosu kullanarak PCR plakasını PCR plaka sızdırmazlıklayıcı ile kapatın.
  9. PCR plakayı 96 kuyulu ısı sızdırmaz termal çevrime yerleştirin. PCR protokolünü kullanın; 5 dakika için 95 °C, 30 s için 95 °C 40 döngü, 1 dakika için 60 °C, 5 dakika için 4 °C, 5 dakika için 90 °C ve 4 °C sonsuz tutma. Damlacıkların bisiklet turu sırasında her adım için doğru sıcaklığa ulaştığından emin olmak için her döngüde 2 °C/s rampa hızı uygulayın
  10. DD-PCR yazılımını kullanarak damlacıkları ölçmek için PCR plakasını damlacık okuyucuya yerleştirin. Bir şablon, evagreen için belirli ayarlar kullanılarak ayarlanır.
  11. Floresan yoğunluğu ve damlacık numarası için her örnekle birlikte 1-B çizim grafiği kullanarak verileri analiz edin. Eşik değeri, eşiğin üzerindeki damlacıklar pozitif ve aşağıdakiler negatif olarak atanacak şekilde düzenlenir. Bunu, hedef DNA'nın kopya/μL birimlerindeki başlangıç konsantrasyonunun belirlenmesi için Poisson algoritmasının uygulanması izler. WPRE'nin 18S'ye karşı oranı, AAV transdüksiyon verimliliğini ölçmek için hesaplanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük ölçekli AAV üretimi intravitreal enjeksiyonlar için vektör sağlayan hızlı ve verimli bir yöntemdir (Şekil 1). Küçük ölçekli AAV üretimi genellikle retinadaki muhabir ifadesini tespit etmek için yeterli olan 1 x10 12 GC/ml aralığında titre verir (Şekil 2). DD-PCR kullanılarak AAV'nin titerlenerek tutarlı sonuçlar verir. ITR2 ve WPRE'ye özgü astarlar rutin olarak kullanılır ve her hedef molekülün başlangıç konsantrasyonu Poisson dağılımı olarak mo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde farklı kapsid proteinleri olan iki AAV vektörü oluşturduk ve daha sonra bunları buna göre titrettirdik. Bu protokolün en önemli adımlarından biri, transdüksiyon12,13'densonra algılanabilir muhabir ifadesi verecek yeterli miktarda AAV üretmektir.

AAV'lerin titeringi de intravitreal enjeksiyonlar için AAV dozajlarını ayarlamak için önemli bir faktördür. Bu önemli kriterlere ulaşıldıktan sonra, AAV'lerin transdüksiyon ver...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oezkan Keles, Josephine Jüttner ve Prof. Botond Roska'ya, Moleküler ve Klinik Oftalmoloji Enstitüsü Basel, Karmaşık Virüsler Platformu'na AAV üretimine verdikleri yardım ve destek için teşekkür ederiz. Ayrıca AAV8/BP2 suşu için Pennsylvania Üniversitesi Perelman Tıp Fakültesi'nden Prof. Jean Bennett'e teşekkür ederiz. Gebze Teknik Üniversitesi hayvan tesisinde hayvan çalışması yapılmaktadır. Bunun için Leyla Dikmetaş ve Prof. Dr. Uygar Halis Tazebay'a hayvancılığa yönelik teknik yardım ve destekleri için teşekkür ediyoruz. Dr. Fatma Özdemir'e de el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma TübİtAK, 118C226 ve 121N275 hibe numaraları ve Sabancı Üniversitesi Entegrasyon hibesi ile desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 Kuyulu Yarı Etekli ddPCR plakalarıBioRad12001925ddPCR
Amikon, FiltreMilliporeUFC910096AAV
C1000 TOUCH 96 DERIN KUYUBioRad1851197ddPCR
C57BL/6JRj fare suşuJanvierC57BL/6JRj
Fareler DG8 contalarıBioRad1863009ddPCR
DG8 KartuşlarıBioRad1864008ddPCR
DMEMLonzaBE12-604QAAV
DPBSPAN BIOTECHL 1825AAV
Damlacık üretim yağı eva yeşiliBioRad1864006ddPCR
Damlacık okuyucu yağıBioRad1863004ddPCR
FBSPAN BIOTECHp30-3306PX1 için AAV
Folyo contalar PCR Plaka kapatıcıBioRad1814040ddPCR
İnsülin ŞırıngalarıBD Medical320933 İntravitreal enjeksiyon
İzofluranADEKA İLAÇ SANAYİ VE TİCARET N01AB06anestezik
Mikroenjektör MM33Dünya Hassas Aletleri82-42-101-0000İntravitreal enjeksiyon
Mikron IVPhoenix Araştırma LaboratuvarlarıMikron IV3-CCD renkli kamera, çerçeve yakalayıcı ve kullanıma hazır yazılıma dayalı mikroskopi sistemi, araştırmacıların fare retinalarını görüntülemesini sağlar.
Mydfrin (%2.5 fenilefrin hidroklorür)AlconS01FB01pupil genişlemesi
Nanofil Şırınga 10 & mu; lDünya Hassas AletlerNANOFILİntravitreal enjeksiyon
İğnesi RN G36, 25 mm, PST 2Dünya Hassas AletlerNF36BL-2İntravitreal enjeksiyon
PEI-MAXPolyscience24765-1AAV
Penisilin-StreptomisinPAN BIOTECHP06-07100AAV
Plazmid pHGT1-Adeno1Plazmid FabrikasıPF1236AAV
Pluronic F-68Gibco24040032AAV
PX1 PCR Plaka Mühürleyen sistemiBioRad1814000ddPCR
QX200 ddPCR EvaGreenSupermix BioRad1864034ddPCR
QX200 Damlacık Okuyucu/QX200 Damlacık JeneratörüBioRad1864001ddPCR
SPLITTER FORCEP WATCHER
MAKER - UZUNLUK = 13,5 CM		endostall medikalEJN-160-0155Retina izolasyonu
Steril Şırınga FiltresiAISIMOASF33PS22SAAV
Doku Genomik DNA KitiEcoSpinE1070gDNA izolasyonu
Tobradex (%0.3 tobramisin / %0.1 deksametazon)AlconS01CA01anti-inflamatuar / antibiyotik
Tropamid (%0.5 tropikamid)Bilim İlaç Sanayi ve Ticaret A.Ş.S01FA06göz bebeği genişlemesi
TurbonükleazAccelagenN0103LAAV
Viscotears (karbomer 2 mg / g)Bausch + LombS01XA20kayganlaştırıcı göz damlası

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
  2. Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
  3. Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
  4. Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
  5. Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
  6. Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
  7. Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
  8. Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
  9. Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
  10. Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
  11. Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
  12. Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
  13. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  14. Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12(2018).
  15. Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
  16. Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
  17. Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
  18. Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
  19. Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
  20. Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
  21. Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
  22. Cox, D. B. T., et al. RNA editing with CRISPR-Cas13. Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Retinal Gen TedavisiMutlak Niceliklementravitreal EnjeksiyonGenomik DNA zolasyonuFundus Floresan G r nt lemeAAV Genom KopyasK k l ekli AAV retimi

İlgili makaleler