Method Article

Farelerde Miyokard Enfarktüsünün İndüksiyonu için Değiştirilmiş Basit Bir Yöntem

DOI:

10.3791/63042

⸱

December 3rd, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College, 2Department of Cardiology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeterli anestezi altında, fare kalbi interkostal boşluktan dışsallaştırıldı ve miyokard enfarktüsü, çoğu laboratuvarda kolayca bulunabilen malzemeler kullanılarak sol ön inen arteri (LAD) bağlayarak başarılı bir şekilde indüklendi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miyokard enfarktüsü (MI) önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. MI modelleri, MI sonrası yeniden şekillenmenin patomekanizmalarını araştırmak ve yeni terapötiklerin değerlendirilmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. MI'yı indüklemek için farklı yöntemler (örneğin, izoproterenol tedavisi, kriyoinjury, koroner arter ligasyonu, vb.) kullanılmıştır. İzoproterenol tedavisi ve kriyoyaralanma ile karşılaştırıldığında, koroner arter ligasyonu, MI sonrası iskemik yanıtı ve kronik yeniden şekillenmeyi daha iyi yansıtabilir. Bununla birlikte, farelerde koroner ligasyon için geleneksel yöntemler teknik olarak zordur. Bu çalışma, farelerde MI'nın indüksiyonu için basit ve verimli bir süreci hazır malzemelerle açıklamaktadır. Fare göğüs derisi stabil anestezi altında kesilerek açıldı. Kalp, pektoralis majör ve pektoralis minör künt olarak ayrıldıktan sonra interkostal boşluktan hemen dışsallaştırıldı. Sol ön inen dal (LAD) orijinden 3 mm kala 6-0 sütür ile bağlandı. LAD ligasyonunu takiben, 2,3,5-Trifeniltetrazolyum klorür (TTC) ile boyama, MI'nın başarılı bir şekilde indüksiyonunu ve MI sonrası skar boyutunun zamansal değişikliklerini gösterdi. Bu arada, sağkalım analizi sonuçları, esas olarak kalp rüptürüne bağlı olarak, MI'dan sonraki 7 gün içinde açık mortalite gösterdi. Ayrıca, MI sonrası ekokardiyografik değerlendirme, kontraktil disfonksiyonun ve ventriküler yeniden şekillenmenin başarılı bir şekilde indüklendiğini gösterdi. Bir kez ustalaştıktan sonra, farelerde 2-3 dakika içinde hazır malzemelerle bir MI modeli oluşturulabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miyokard enfarktüsü (MI) dünya çapında önemli ölüm ve sakatlık nedenlerinden birini temsil eder 1,2,3,4,5. Zamanında reperfüzyona rağmen, şu anda MI sonrası kardiyak yeniden şekillenmeyi tedavi etmek için etkili tedaviler eksikliği vardır. Buna bağlı olarak, MI 6,7,8 için mekanik keşif ve terapi kullanımı için önemli çabalar sarf edilmiştir. Dikkat çekici bir şekilde, MI modellerinin kurulması bu amaçlara ulaşmak için bir ön koşuldur.

Küçük hayvanlarda MI modellerini indüklemek için çeşitli yöntemler (örneğin, izoproterenol tedavisi, kriyohasar, koroner arter ligasyonu, vb.) önerilmiştir. İzoproterenol tedavisi, MI indüksiyonu için basit bir yöntemdir, ancak hedeflenen alanın enfarktüsünü indükleyemez9. Kriyoyaralanma, doğrudan iskemi10'dan ziyade buz kristallerinin oluşumu ve hücre zarının bozulması yoluyla miyokardiyal nekroza yol açar. Buna karşılık, koroner arter ligasyonu, oklüzyon bölgesinin ve enfarktüs alanının kapsamının hassas kontrolüne izin verir ve enfarktüs sonrası yeniden şekillenme yanıtını aslına uygun olarak özetler11,12. Koroner arter ligasyonu tipik olarak entübasyon, mekanik ventilasyon ve teknik olarak zor olan torakotomi sonrasında gerçekleştirilir13,14. Koroner arter ligasyonu için çeşitli modifiye protokoller bildirilmiştir (ör., ventilasyon serbest) ve MI indüksiyonunu güçlendirmiştir, ancak ayrıntılı görsel gösterimler eksiktir15,16,17. Bu sorunlar, MI modellerini kullanarak araştırma yapmak isteyen gruplar için önemli bir finansal ve teknik engel oluşturmaktadır. Bu rapor, farelerde MI'nın indüksiyonu için bir yaklaşım sunmaktadır. Mevcut yöntem kolaydır, zaman kazandırır ve çoğu laboratuvarda kolayca bulunan cerrahi alet ve ekipmanları kullanır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan çalışmalarını içeren deneyler, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi, Renji Hastanesi Laboratuvar Hayvanları Refahı Etik Kurulu'ndan (R52021-0506) gerekli tüm onaylarla gerçekleştirilir. Çalışmada 8-10 hafta arasında değişen dişi ve erkek C57BL/6J fareler kullanıldı.

1. Basitleştirilmiş anestezi ekipmanının hazırlanması (OPSİYONEL)

NOT: Bu, isteğe bağlı bir ameliyat öncesi kurulumdur ve bölüm 2'de belirtildiği gibi titre edilebilir anestezi ile değiştirilebilir. Bu düzen hayvan prosedürlerine uyarlanmadan önce kurumsal hayvan etik kuruluna ve veteriner hekim(ler)e danışılmalıdır.

  1. 15 mL'lik bir santrifüj tüpü alın ve açıklıktan yaklaşık 3 cm uzakta tüpün uzun eksenine dik bir kesim yapın.
    NOT: Valfin başarılı bir şekilde yerleştirilebilmesi için kesimin boru lümeninin dairesel çevresinin yarısından büyük olduğundan emin olun.
  2. Kesim ve tüp açıklığı arasındaki santrifüj tüpü duvarında delikler (çap, 2 mm) açın.
  3. Plastik bir tabakadan valfin uygun boyutta bir parçasını kesin ve valfi boru duvarındaki oyuğa yerleştirin.
    NOT: Valf, yerleştirme derinliğini değiştirerek izofluranın salım hızını kontrol etmek için kullanılabilir.
  4. Bir çeker ocak içinde, tüpün altını kesin ve oksijen kaynağına bağlayın. Tüpün alt ucuna yakın bir pamuk top yerleştirin, pamuk topunun üzerine 0.5 mL izofluran (elde edildiği gibi, Malzeme Tablosuna bakın) yükleyin ve valfi kapatın.
  5. Fareleri yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmış tüplerle maskeleyerek anestezi etkinliğini test edin. Solunum hızını ve anestezi derinliğini ayak parmağı sıkışma tepkisi ile izleyin.
    NOT: Solunum hızının 10 kez/10 saniyeden az olması aşırı anestezi olduğunu gösterir ve valfin yerleştirme derinliği ayarlanmalıdır. Anestezi içeren tüm işlemler için içi aktif karbon levhalarla dolu bir gaz filtresi kullanılmalı (Şekil 1A-i) ve ameliyat bir başlık içinde yapılmalıdır.

2. Operatif hazırlık ve anestezi

  1. Bir çift forseps, bir mikro sivrisinek kanama durdurucu, bir çift cerrahi makas, iki çift iğne tutucu, 4-0 ipek cerrahi sütür, 6-0 ipek cerrahi sütür, bir gaz filtresi ve bir ışık kaynağı dahil olmak üzere ameliyat gününde gerekli tüm aletleri hazırlayın ve sterilize edin (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1A).
  2. Cerrahi maske ve steril eldiven giyin.
  3. Tüy dökücü kremi fare göğsüne sürün ve 1 dakika bekleyin. Tüy dökücü kremi ve saçı ıslak gazlı bezle nazikçe silin.
  4. Epilasyondan sonra fareyi baskın elinizle tutun. Buharlaştırılmış izofluranın (% 4) oksijen kaynağı (1L / dak) ile solunması yoluyla anesteziyi indükleyin ve% 2-3 izofluranda tutun.
  5. Ayak parmağı sıkışma tepkisi eksikliği ile yeterli anesteziyi onaylayın.
  6. Kornea kuruluğunu önlemek için her iki göze de steril göz kremi uygulayın.
  7. Fareleri sırtüstü pozisyonda bir ameliyat platformuna sabitleyin. Povidon-iyot bezlerini göğsüne üç kez uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve dezenfekte edilmiş göğsü steril bir örtü ile örtün.

3. Miyokard enfarktüsünün indüksiyonu

  1. Steriliteyi sağlamak için kontamine eldivenleri değiştirin.
  2. Lidokain ile lokal bloktan sonra ksifoid ve koltuk altını birleştiren çizgi boyunca 0,5 cm'lik bir cilt kesimi yapın.
  3. Dördüncü interkostal boşluğu ortaya çıkarmak için forseps ve bir mikro-sivrisinek hemostatı kullanarak pektoral majör ve pektoral minör kasları künt olarak ayırın.
  4. Bir mikro sivrisinek hemostatı kullanarak dördüncü interkostal boşluğu açın.
  5. Sol elin işaret parmağı ile kalbi dördüncü interkostal boşluğa doğru iterek kalbi dışsallaştırın.
  6. Sol el ile kalbi sabitleyin ve sol ön inen dalı orijinden 3 mm uzakta 6-0 dikişle bağlayın.
  7. Kalbi hızlı bir şekilde göğüs boşluğuna geri yerleştirin.
    NOT: Kalbi 30 saniyeden daha kısa bir süre için dışsallaştırmak güvenlidir.
  8. Göğüs boşluğuna manuel olarak hafifçe bastırarak göğüs boşluğundaki havayı boşaltın.
  9. Kaburgaların üzerindeki kas tabakasını 6-0 ipek dikiş ile kapatın.
  10. Cildi 4-0 ipek dikiş ile kapatın.
  11. İşlemden hemen sonra fareleri bir ped (37 °C) üzerine yerleştirin.
  12. Ameliyat sonrası ağrıyı 72 saate kadar azaltmak için her 4-6 saatte bir deri altına buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg) enjekte edin.
  13. Tamamen iyileştiğinde ameliyat edilen fareleri kafeslere geri koyun.
    NOT: Fareler ameliyattan sonra 3-5 dakika içinde tamamen iyileşecektir.
  14. Fareleri dikkatlice izleyin ve 7 güne kadar ıslak yiyecek sağlayın.

4. Dokuların toplanması

  1. Servikal çıkık ile MI kurulduktan sonra fareleri farklı zaman noktalarında feda edin.
  2. Kurban edilen fareleri sırtüstü pozisyonda ameliyat platformuna sabitleyin.
  3. Üst karın bölgesinde ventral bir kesi (~ 3-4 cm) yapın. Göğüs boşluğunun her iki tarafındaki kaburgaları kesin ve diyaframı çıkarın.
  4. İntraventriküler enjeksiyon yoluyla kalbi 10 mL soğuk fosfat tamponlu salin (1x PBS, 4 °C) ile perfüze edin.
  5. Aort kökünü keserek kalbi toplayın ve kalbi hemen -80 °C'de saklayın.
    NOT: Yazarların deneyimlerine göre, depolamadan sonraki iki hafta içinde TTC boyama yapmak mümkündür.
  6. Kalbi 2,3,5-Trifeniltetrazolyum klorür (TTC) ile boyayın.
    1. Donmuş kalbi jiletle buz üzerinde 1 mm kalınlığında bölümler halinde dilimleyin.
    2. Hazırlanan kalp dilimlerini %1 TTC solüsyonunda (1x PBS'de çözülmüş) 37 °C'de 10-15 dakika inkübe edin.
      NOT: 15 dakikalık inkübasyondan sonra, TTC solüsyonunu atın ve lekeli kalp dilimlerini 1x PBS'ye daldırın.
  7. Bir dijital kamera kullanarak dilimlerin fotoğrafını çekin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel protokol ve bazı kritik adımlar Şekil 1'de gösterilmektedir. Basitleştirilmiş anestezi ekipmanı anesteziye neden oldu. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, indüklenen anestezi, düzenli solunum hızlarının yansıttığı gibi stabildi (test edilen farelerde 90-107 nefes / dak arasında değişmiştir). Koroner arter ligasyonunu takiben, TTC boyama analizi, miyokard enfarktüsünün başarılı bir şekilde indüklendiğini ve MI sonrası skar boyutunda zamansal değişiklikleri gö...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, Gao16 tarafından bildirilen bir yöntemden modifiye edilen, hazır materyallere sahip farelerde MI indüksiyonu için kolay bir protokol göstermiştir. Murine MI modelleri, MI sonrası disfonksiyon ve yeniden şekillenme için mekanik keşif ve ilaç taraması için vazgeçilmezdir12. MI indüksiyonu için mevcut teknikler arasında koroner arter ligasyonu en sık uygulananı temsil eder. Koroner arter ligasyonu, miyokard enfarktüsünün iskemi doğasını sadık bir şekilde özetler ve k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81930007, 81625002, 81800307, 81470389, 81500221, 81770238), Şanghay Üstün Akademik Liderler Programı (18XD1402400), Şanghay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu (201409005200), Şanghay Pujiang Yetenek Programı (2020PJD030) ve Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (2020M671161, BX20190216).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,3,5-Trifeniltetrazolyum klorürSIGMAT8877-25GTTC boyama
4-0 ipek sütürYUANKANG4-0Cerrahi alet
OtoklavHIRAYAMAHVE-50Katı
BuprenorfinQinghai İlaç FABRİKASI Co., Ltd.H10940181ameliyat sonrası ağrıyı azaltır
Santrifüj tüpüBiological Hope1850-K15ML
Tüy dökücü kremZIKER BİYOTEKNOLOJİZK-L2701Laboratuvar hayvanları için epilasyon maddesi
ForcepRWDF12028Cerrahi alet
Gaz filtresiZHAOXINSA-493Operatör koruması
İzofluranRWD20071302Anestezi için kullanılır
Işık kaynağıPekin PDVLG-150BAmeliyat lambası
Mikro sivrisinek hemostatFST13011-12Cerrahi alet
İğnesiBINXIONG 42180104Cerrahi alet
İğne ve 6-0 ipek sütürJIAHESC086Cerrahi alet
İğne tutucuShangHaiJZJ32030Cerrahi alet
İğne tutucuShangHaiJZJ32010Cerrahi alet
Povidon-iyot swablarıSingleLadyGB26368-2010Cilt dezenfeksiyonu
MakasCNSTRONGJYJ1030Cerrahi alet
Steril göz kremiShenyang Xingqi Pharmaceutical Co., Ltd.Korneakuruluğunu önlemek
H10940177 Küçük hayvanlar için ultra yüksek çözünürlüklü ultrason görüntüleme sistemiVisualSonicsVevo 2100Ekokardiyografik analiz
için Sterilizasyon

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y., et al. A simple and efficient method for in vivo cardiac-specific gene manipulation by intramyocardial injection in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57074(2018).
  2. Pell, S., Fayerweather, W. E. Trends in the incidence of myocardial infarction and in associated mortality and morbidity in a large employed population. The New England Journal of Medicine. 312 (16), 1005-1011 (1985).
  3. Ramunddal, T., Gizurarson, S., Lorentzon, M., Omerovic, E. Antiarrhythmic effects of growth hormone--in vivo evidence from small-animal models of acute myocardial infarction and invasive electrophysiology. Journal of Electrocardiology. 41 (2), 144-151 (2008).
  4. Tabrizchi, R. β-blocker therapy after acute myocardial infarction. Expert Review of Cardiovascular Therapy. 11 (3), 293-296 (2013).
  5. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
  6. Cahill, T. J., Choudhury, R. P., Riley, P. R. Heart regeneration and repair after myocardial infarction: Translational opportunities for novel therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 699-717 (2017).
  7. Froese, N., et al. Anti-androgenic therapy with finasteride improves cardiac function, attenuates remodeling and reverts pathologic gene-expression after myocardial infarction in mice. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 122, 114-124 (2018).
  8. Wang, W., et al. Defective branched chain amino acid catabolism contributes to cardiac dysfunction and remodeling following myocardial infarction. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (5), 1160-1169 (2016).
  9. Acikel, M., et al. Protective effects of dantrolene against myocardial injury induced by isoproterenol in rats: Biochemical and histological findings. International Journal of Cardiology. 98 (3), 389-394 (2005).
  10. vanden Bos, E. J., Mees, B. M. E., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: A comparison with coronary artery ligation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 289 (3), 1291-1300 (2005).
  11. Guo, Y., et al. Demonstration of an early and a late phase of ischemic preconditioning in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 275 (4), 1375-1387 (1998).
  12. Kumar, M., et al. Animal models of myocardial infarction: Mainstay in clinical translation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 76, 221-230 (2016).
  13. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
  14. Johns, T. N., Olson, B. J. Experimental myocardial infarction. I. A method of coronary occlusion in small animals. Annals of Surgery. 140 (5), 675-682 (1954).
  15. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  16. Gao, E., Koch, W. J. A novel and efficient model of coronary artery ligation in the mouse. Methods in Molecular Biology. 1037, 299-311 (2013).
  17. Most, P., et al. Cardiac S100A1 protein levels determine contractile performance and propensity toward heart failure after myocardial infarction. Circulation. 114 (12), 1258-1268 (2006).
  18. Christia, P., et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 61 (8), 555-570 (2013).
  19. Frantz, S., Bauersachs, J., Ertl, G. Post-infarct remodelling: Contribution of wound healing and inflammation. Cardiovascular Research. 81 (3), 474-481 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Myocardial InfarctionCoronary Artery LigationMouse MI ModelVentricular RemodelingTTC StainingPost MI RemodelingContractile DysfunctionEchocardiographic AssessmentCardiac RuptureIntramyocardial Injection

Related Articles