Farelerde Miyokard Enfarktüsünün İndüksiyonu için Değiştirilmiş Basit Bir Yöntem

Miyokard enfarktüsü (MI) dünya çapında önemli ölüm ve sakatlık nedenlerinden birini temsil eder 1,2,3,4,5. Zamanında reperfüzyona rağmen, şu anda MI sonrası kardiyak yeniden şekillenmeyi tedavi etmek için etkili tedaviler eksikliği vardır. Buna bağlı olarak, MI ^6,7,8 için mekanik keşif ve terapi kullanımı için önemli çabalar sarf edilmiştir. Dikkat çekici bir şekilde, MI modellerinin kurulması bu amaçlara ulaşmak için bir ön koşuldur.

Küçük hayvanlarda MI modellerini indüklemek için çeşitli yöntemler (örneğin, izoproterenol tedavisi, kriyohasar, koroner arter ligasyonu, vb.) önerilmiştir. İzoproterenol tedavisi, MI indüksiyonu için basit bir yöntemdir, ancak hedeflenen alanın enfarktüsünü indükleyemez⁹. Kriyoyaralanma, doğrudan iskemi^10'dan ziyade buz kristallerinin oluşumu ve hücre zarının bozulması yoluyla miyokardiyal nekroza yol açar. Buna karşılık, koroner arter ligasyonu, oklüzyon bölgesinin ve enfarktüs alanının kapsamının hassas kontrolüne izin verir ve enfarktüs sonrası yeniden şekillenme yanıtını aslına uygun olarak özetler^11,12. Koroner arter ligasyonu tipik olarak entübasyon, mekanik ventilasyon ve teknik olarak zor olan torakotomi sonrasında gerçekleştirilir^13,14. Koroner arter ligasyonu için çeşitli modifiye protokoller bildirilmiştir (ör., ventilasyon serbest) ve MI indüksiyonunu güçlendirmiştir, ancak ayrıntılı görsel gösterimler eksiktir^15,16,17. Bu sorunlar, MI modellerini kullanarak araştırma yapmak isteyen gruplar için önemli bir finansal ve teknik engel oluşturmaktadır. Bu rapor, farelerde MI'nın indüksiyonu için bir yaklaşım sunmaktadır. Mevcut yöntem kolaydır, zaman kazandırır ve çoğu laboratuvarda kolayca bulunan cerrahi alet ve ekipmanları kullanır.

Hayvan çalışmalarını içeren deneyler, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi, Renji Hastanesi Laboratuvar Hayvanları Refahı Etik Kurulu'ndan (R52021-0506) gerekli tüm onaylarla gerçekleştirilir. Çalışmada 8-10 hafta arasında değişen dişi ve erkek C57BL/6J fareler kullanıldı.

1. Basitleştirilmiş anestezi ekipmanının hazırlanması (OPSİYONEL)

NOT: Bu, isteğe bağlı bir ameliyat öncesi kurulumdur ve bölüm 2'de belirtildiği gibi titre edilebilir anestezi ile değiştirilebilir. Bu düzen hayvan prosedürlerine uyarlanmadan önce kurumsal hayvan etik kuruluna ve veteriner hekim(ler)e danışılmalıdır.

1. 15 mL'lik bir santrifüj tüpü alın ve açıklıktan yaklaşık 3 cm uzakta tüpün uzun eksenine dik bir kesim yapın.
   NOT: Valfin başarılı bir şekilde yerleştirilebilmesi için kesimin boru lümeninin dairesel çevresinin yarısından büyük olduğundan emin olun.
2. Kesim ve tüp açıklığı arasındaki santrifüj tüpü duvarında delikler (çap, 2 mm) açın.
3. Plastik bir tabakadan valfin uygun boyutta bir parçasını kesin ve valfi boru duvarındaki oyuğa yerleştirin.
   NOT: Valf, yerleştirme derinliğini değiştirerek izofluranın salım hızını kontrol etmek için kullanılabilir.
4. Bir çeker ocak içinde, tüpün altını kesin ve oksijen kaynağına bağlayın. Tüpün alt ucuna yakın bir pamuk top yerleştirin, pamuk topunun üzerine 0.5 mL izofluran (elde edildiği gibi, Malzeme Tablosuna bakın) yükleyin ve valfi kapatın.
5. Fareleri yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmış tüplerle maskeleyerek anestezi etkinliğini test edin. Solunum hızını ve anestezi derinliğini ayak parmağı sıkışma tepkisi ile izleyin.
   NOT: Solunum hızının 10 kez/10 saniyeden az olması aşırı anestezi olduğunu gösterir ve valfin yerleştirme derinliği ayarlanmalıdır. Anestezi içeren tüm işlemler için içi aktif karbon levhalarla dolu bir gaz filtresi kullanılmalı (Şekil 1A-i) ve ameliyat bir başlık içinde yapılmalıdır.

2. Operatif hazırlık ve anestezi

1. Bir çift forseps, bir mikro sivrisinek kanama durdurucu, bir çift cerrahi makas, iki çift iğne tutucu, 4-0 ipek cerrahi sütür, 6-0 ipek cerrahi sütür, bir gaz filtresi ve bir ışık kaynağı dahil olmak üzere ameliyat gününde gerekli tüm aletleri hazırlayın ve sterilize edin (bkz. Malzeme Tablosu) (Şekil 1A).
2. Cerrahi maske ve steril eldiven giyin.
3. Tüy dökücü kremi fare göğsüne sürün ve 1 dakika bekleyin. Tüy dökücü kremi ve saçı ıslak gazlı bezle nazikçe silin.
4. Epilasyondan sonra fareyi baskın elinizle tutun. Buharlaştırılmış izofluranın (% 4) oksijen kaynağı (1L / dak) ile solunması yoluyla anesteziyi indükleyin ve% 2-3 izofluranda tutun.
5. Ayak parmağı sıkışma tepkisi eksikliği ile yeterli anesteziyi onaylayın.
6. Kornea kuruluğunu önlemek için her iki göze de steril göz kremi uygulayın.
7. Fareleri sırtüstü pozisyonda bir ameliyat platformuna sabitleyin. Povidon-iyot bezlerini göğsüne üç kez uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve dezenfekte edilmiş göğsü steril bir örtü ile örtün.

3. Miyokard enfarktüsünün indüksiyonu

1. Steriliteyi sağlamak için kontamine eldivenleri değiştirin.
2. Lidokain ile lokal bloktan sonra ksifoid ve koltuk altını birleştiren çizgi boyunca 0,5 cm'lik bir cilt kesimi yapın.
3. Dördüncü interkostal boşluğu ortaya çıkarmak için forseps ve bir mikro-sivrisinek hemostatı kullanarak pektoral majör ve pektoral minör kasları künt olarak ayırın.
4. Bir mikro sivrisinek hemostatı kullanarak dördüncü interkostal boşluğu açın.
5. Sol elin işaret parmağı ile kalbi dördüncü interkostal boşluğa doğru iterek kalbi dışsallaştırın.
6. Sol el ile kalbi sabitleyin ve sol ön inen dalı orijinden 3 mm uzakta 6-0 dikişle bağlayın.
7. Kalbi hızlı bir şekilde göğüs boşluğuna geri yerleştirin.
   NOT: Kalbi 30 saniyeden daha kısa bir süre için dışsallaştırmak güvenlidir.
8. Göğüs boşluğuna manuel olarak hafifçe bastırarak göğüs boşluğundaki havayı boşaltın.
9. Kaburgaların üzerindeki kas tabakasını 6-0 ipek dikiş ile kapatın.
10. Cildi 4-0 ipek dikiş ile kapatın.
11. İşlemden hemen sonra fareleri bir ped (37 °C) üzerine yerleştirin.
12. Ameliyat sonrası ağrıyı 72 saate kadar azaltmak için her 4-6 saatte bir deri altına buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg) enjekte edin.
13. Tamamen iyileştiğinde ameliyat edilen fareleri kafeslere geri koyun.
    NOT: Fareler ameliyattan sonra 3-5 dakika içinde tamamen iyileşecektir.
14. Fareleri dikkatlice izleyin ve 7 güne kadar ıslak yiyecek sağlayın.

4. Dokuların toplanması

1. Servikal çıkık ile MI kurulduktan sonra fareleri farklı zaman noktalarında feda edin.
2. Kurban edilen fareleri sırtüstü pozisyonda ameliyat platformuna sabitleyin.
3. Üst karın bölgesinde ventral bir kesi (~ 3-4 cm) yapın. Göğüs boşluğunun her iki tarafındaki kaburgaları kesin ve diyaframı çıkarın.
4. İntraventriküler enjeksiyon yoluyla kalbi 10 mL soğuk fosfat tamponlu salin (1x PBS, 4 °C) ile perfüze edin.
5. Aort kökünü keserek kalbi toplayın ve kalbi hemen -80 °C'de saklayın.
   NOT: Yazarların deneyimlerine göre, depolamadan sonraki iki hafta içinde TTC boyama yapmak mümkündür.
6. Kalbi 2,3,5-Trifeniltetrazolyum klorür (TTC) ile boyayın.
   1. Donmuş kalbi jiletle buz üzerinde 1 mm kalınlığında bölümler halinde dilimleyin.
   2. Hazırlanan kalp dilimlerini %1 TTC solüsyonunda (1x PBS'de çözülmüş) 37 °C'de 10-15 dakika inkübe edin.
      NOT: 15 dakikalık inkübasyondan sonra, TTC solüsyonunu atın ve lekeli kalp dilimlerini 1x PBS'ye daldırın.
7. Bir dijital kamera kullanarak dilimlerin fotoğrafını çekin.

Deneysel protokol ve bazı kritik adımlar Şekil 1'de gösterilmektedir. Basitleştirilmiş anestezi ekipmanı anesteziye neden oldu. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, indüklenen anestezi, düzenli solunum hızlarının yansıttığı gibi stabildi (test edilen farelerde 90-107 nefes / dak arasında değişmiştir). Koroner arter ligasyonunu takiben, TTC boyama analizi, miyokard enfarktüsünün başarılı bir şekilde indüklendiğini ve MI sonrası skar boyutunda zamansal değişiklikleri gösterdi (Şekil 2B). Bu arada, sağkalım analizi sonuçları, erkek ve dişi C57BL / 6J farelerinde MI'dan sonraki 7 gün içinde açık mortalite gösterdi (Şekil 2C, D). Ventriküler rüptür (erkek farelerde V; dişi farelerde @) MI sonrası ölümün yaygın bir nedeniydi. Ayrıca, MI sonrası ekokardiyografik değerlendirme, kontraktil disfonksiyon ve ventriküler yeniden şekillenmenin başarılı bir şekilde indüklendiğini gösterdi (Şekil 2E, F).

Şekil 1: MI indüksiyonu için modifiye edilmiş yöntemlerdeki malzemeler ve kritik adımlar . (A) Bu protokol için gerekli cerrahi aletler ve malzemeler. (a) 4-0 ipek sütür. (b) 6-0 ipek sütür. (c) Forseps. (d) Makas. (e-f) İğne tutucular. (g) Mikro sivrisinek kanama durdurucu. (h) Işık kaynağı. (i) Gaz filtresi. (B) Farelerde MI'yı indüklemek için temel adımları gösteren temsili resimler. (a) Fare anesteziden sonra sabitlendi ve cerrahi bölgeye povidon-iyot uygulandı. (b) Ameliyat bölgesi örtülür. (c) Lidokain ile lokal bloklamadan sonra cerrahi bölgede 0,5 cm'lik bir kesi. (d) Açıkta kalan kaburgalar. Ok kaburgaları gösterir. (e) Dördüncü interkostal boşluğu ortaya çıkarmak için pektoral majör ve pektoral minör kasları diseke etti. (f) Dışsallaştırılmış kalp. (g-h) 6-0 ipek sütür ile bağlanmış LAD. Ok, LAD'yi gösterir. (i) Kalp tekrar göğüs boşluğuna yerleştirilir. (j) Göğüs boşluğundan hava boşaltıldı. (k) Kas tabakası kaburgaların üzerine 6-0 ipek sütür ile kapatıldı ve deri 4-0 ipek sütür ile kapatıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Koroner arter ligasyonu sonrası histolojik ve fonksiyonel değişiklikler. (A) Basitleştirilmiş anestezi ekipmanı ile uyuşturulan farelerde solunum hızları (n = 10). (B ) Kalp dilimlerinin (her kalpten 4 dilim) TTC boyama sonuçları MI sonrası farklı zaman noktalarında toplandı. Beyaz alan enfarktüslü bir alanı gösterdi ve kırmızı alan canlı miyokard ortaya çıkardı. (C) Kaplan-Meier eğrisi, erkek farelerde MI sonrası ölüm oranını gösterir (grup başına n = 20). (D) Kaplan-Meier eğrisi, dişi farelerde MI sonrası ölüm oranını gösterir (grup başına n = 20). (E) MI'dan sonra farklı zaman noktalarında ekokardiyografik analizin temsili görüntüleri (sahte, 3 gün, 7 gün, 21 gün ve MI'dan 28 gün sonra). (F) Belirtilen gruplar arasında sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonu (LVEF), sol ventrikül fraksiyonel kısalması (LVFS), sol ventrikül sonu sistolik çapı (LVsD) ve sol ventrikül diyastol sonu boyutu (LVdD) değerlerinin kantitatif analizi (grup başına n=5). **p<0.01 veya ***p<0.001 vs. sahte; ##p<0.01 veya ###p<0.001 vs. MI'dan 3 gün sonra. İstatistiksel analiz için posthoc Tukey HSD (Honestly Significant Difference) testi ile tek yönlü varyans analizi yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.