Kardiyolojide hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için altın standart kardiyomiyositlerdir. Bu makalede, fare kardiyomiyositlerini izole etmek için Langendorff dışı tekniğe yapılan uyarlamalar açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem
Bu makalede
Özet
Özet
Yüksek kaliteli kardiyomiyositler veren tekrarlanabilir ancak teknik olarak basit yöntemlere duyulan ihtiyaç, kalp biyolojisindeki araştırmalar için gereklidir. Kardiyomiyositler üzerinde yapılan hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler (örneğin, kasılma, elektrofizyoloji, kalsiyum döngüsü, vb.) hastalığın mekanizmalarını belirlemek için altın standarttır. Fare, fonksiyonel deneyler için tercih edilen türdür ve açıklanan teknik, özellikle fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu içindir. Langendorff aparatı gerektiren önceki yöntemler, aort kanülasyonu için yüksek düzeyde eğitim ve hassasiyet gerektirir ve sıklıkla iskemi ile sonuçlanır. Alan, basit, tekrarlanabilir ve fizyolojik veri toplama ve kültür için uygulanabilir miyositler veren Langendorff'suz izolasyon yöntemlerine doğru kaymaktadır. Bu yöntemler aort kanülasyonuna kıyasla iskemi süresini büyük ölçüde azaltır ve güvenilir bir şekilde elde edilen kardiyomiyositlerle sonuçlanır. Langendorff'suz yönteme adaptasyonumuz, buz gibi soğuk temizleme çözeltisi ile ilk perfüzyonu, perfüzyon sırasında sabit bir iğne sağlayan stabilize edici bir platformun kullanımını ve fonksiyonel ölçümlerde ve kültürde kullanılmak üzere güvenilir bir şekilde elde edilen kardiyomiyositleri sağlamak için ek sindirim adımlarını içerir. Bu yöntemin uygulanması basit ve hızlıdır ve çok az teknik beceri gerektirir.
Giriş
On yıllar boyunca, kardiyak biyoloji literatüründe önemli bir fikir, moleküler etki mekanizmasıdır. Güvenilir çalışmaların yayınlanması için etki mekanizması kurulmalıdır. Moleküler mekanizmayı belirlemek için iyi kurulmuş bir strateji, güvenilir verilere ulaşmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gerektiren izole kardiyomiyosit çalışmalarıdır. Kardiyomiyositler üzerinde etki mekanizmasını belirlemek için yapılan hücresel ve moleküler deneyler kasılma1, elektrofizyoloji2, kalsiyum (Ca2+) döngüsü3, miyofilamanCa2+ duyarlılığı4, hücre iskeleti
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm prosedürler, Ohio State Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından NIH kurallarına uygun olarak onaylanmıştır.
1. Çözelti hazırlama
NOT: Tampon konsantrasyonları için lütfen Tablo 2'ye bakınız.
- Ön izolasyon (miyosit izolasyonundan 2 hafta öncesine kadar)
- Perfüzyon tampon bazı: 1 L ultra saf 18.2 MΩ · cm H2O. 0.22 μm steril filtrasyondan önce pH 7.4'e ayarlayın. İzolasyon gününe kadar 4 °C'de saklayınız.
- Temizleme tamponu: 1 L ultra saf 18,2 MΩ·cm H2 O'da ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bir izolasyonun başarısını belirlerken incelenmesi gereken birkaç unsur vardır. İlk olarak, kardiyomiyositler, Şekil 1'de izole edilen hücreler gibi membran lekeleri olmadan çubuk şeklinde olmalıdır. Tipik bir izolasyon, çubuk şeklindeki miyositlerin ~% 80'ini verecektir. İzolasyon% 50'den daha az çubuk şeklindeki hücreler verirse, başarısız bir izolasyon olarak kabul edilir ve kardiyomiyositler kullanılmaz. Son olarak, kardiyomiyositler sessiz olmalıdır. Spontan kontraksiyon miyositleri Ca2.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Langendorff içermeyen kardiyomiyosit izolasyon tekniğimizin temel avantajı, Langendorff cihazına kanülasyon gerektirmeyerek hipoksi ve iskemik zamanı sınırlamasıdır. Kalbin çıkarılması, temizlenmesi ve asılması birkaç dakika süren ve genellikle miyositte iskemik hasara neden olan klasik Langendorff tekniklerine alternatif olarak, yöntemimiz buz gibi soğuk bir temizleme çözeltisi ile kanın in vivo temizlenmesini içerir. Buz gibi soğuk temizleme tamponu, etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içerir, kalsiyu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
İfşa edilecek çıkar çatışması yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) ve T32 HL134616 (Sturgill ve Salyer) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10 cc Bd Luer-Lok Şırınga | Fisher Sci | 14-827-52 | |
| 10 mL Pyrex Düşük Formlu Beher | Cole-Palmer | UX-34502-01 | |
| 100 mL polipropilen kapaklı cam medya saklama şişesi | DWK Yaşam Bilimleri | UX-34523-00 | |
| 14 mL Kapaklı Yuvarlak Tabanlı Polipropilen Test Tüpleri | Fisher Sci | 14-959-11B | |
| 2,3-Bütandion Monoksim | Sigma | B0753 | >98% |
| 3 cc BD Luer-Lok Şırınga | Fisher Sci | 14-823-435 | |
| 35 mm cam alt tabaklar | MatTek Corporation | P35G-1.0-20-C | |
| 50 mL BD İğnesiz Şırınga | Fisher Sci | 13-689-8 | |
| 50 mL Konik Santrifüj Tüpleri | Cole-Palmer | EW-22999-84 | |
| %95 O2 %5 CO2 | |||
| AIMS Uzay Jeli Isıtma Yastığı | Fisher Sci | 14-370-223 | |
| BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hipodermik İğneler | Becton Dickinson | 305109 | |
| Sığır Serumu Albümini | Sigma | A3803 | Isı şoku fraksiyonu, liyofilize toz, esasen yağ asidi içermez, %>98 |
| Kalsiyum Klorür dihidrat | Sigma | C7902 | >99% |
| D - (+) - Glikoz | Sigma | G7021 | Hücre kültürü için uygun,% >99,5 |
| DMEM | Fisher Sci | 11965092 | |
| EDTA | Fisher Sci | AAA1071336 | |
| Falcon 100 mm TC ile işlenmiş Hücre Kültürü Kabı | Corning | 353003 | |
| FBS | R& D Sistemleri (Biyo-teknik) | S11195 | |
| Fisherbrand Isotemp Isıtmalı Daldırma Sirkülatörleri | Fisher Sci | 13-874-432 | |
| Hartman Sivrisinek Hemostatik Forseps | Dünyası Hassas Aletler | 15921 | |
| Hausser Scientific Hy-Lite Sayma Odası Seti | Fisher Sci | 02-671-11 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | >99.5% |
| Etiketleme Bandı | Fisher Sci | 15-901-10R | |
| Legato 100 Şırınga Pompası | kdScientific | 788100 | |
| L-glutatyon | Fisher Sci | ICN19467980 | |
| Liberaz TH Araştırma Sınıfı | Sigma | 5401135001 | Yüksek termoliz konsantrasyonu |
| M199 | Fisher Sci | MT10060CV | |
| Magnezyum Klorür | Invitrogen | AM9530G | |
| Fare Laminin | Corning | 354232 | |
| Kalem / Strep | Fisher Sci | ||
| Potasyum Klorür | Sigma | P5405 | >99 |
| Hassas Dijital Pistonlu Su Banyosu | ThermoFisher Scientific | TSCIR19 | |
| Sodyum Bikarbonat | Sigma | S5761 | Hücre için uygun kültür |
| Sodyum Klorür | Sigma | S5886 | >99% |
| Sodyum fosfat monobazik | Sigma | S5011 | >99% |
| Steril Hücre Süzgeci 70 ve mikro; m | Fisher Sci | 22-363-548 | |
| Öğrenci İnce Makas | Güzel Bilim Araçları | 91460-11 | |
| VWR Emici Alt Pedler | Fisher Sci NC9481815 |
Kaynaklar
- Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).
- Ziolo, M. T., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
