Method Article

Makrofaj-fibroblast Kokültürlerinin Nicelleştirilmesi için Alan Tabanlı Görüntü Analiz Algoritması

DOI:

10.3791/63058

⸱

February 15th, 2022

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre sayımlarını tanımlamak için genelleştirilebilir alan tabanlı görüntü analizi yaklaşımını kullanan bir yöntem sunuyoruz. Farklı hücre popülasyonlarının analizi, uyarlanabilir bir algoritma içinde farklı hücre tipleri arasındaki önemli hücre yüksekliği ve yapı farklılıklarından yararlandı.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerin nicelleştirilmesi, çok çeşitli biyolojik ve biyokimyasal çalışmalar için gereklidir. Hücrelerin geleneksel görüntü analizi, tipik olarak, immünofloresan boyama veya floresan proteinlerle transfeksiyon gibi floresan algılama yaklaşımlarını veya görüntü arka planındaki gürültü ve diğer ideal olmayan şeyler nedeniyle genellikle hataya eğilimli olan kenar algılama tekniklerini kullanır.

Makrofajları ve fibroblastları, doku rejenerasyonu sırasında sıklıkla kolokalize olan farklı fenotiplerin hücrelerini doğru bir şekilde sayabilen ve ayırt edebilen yeni bir algoritma tasarladık. MATLAB, arka plandan yükseklik farklılıklarına dayanarak farklı hücre tiplerini farklılaştıran algoritmayı uygulamak için kullanıldı. Hücre boyutu/yapısı ve yüksek yoğunluklu tohumlama koşullarındaki değişimleri hesaba katmak için alan tabanlı bir yöntem kullanılarak birincil bir algoritma geliştirilmiştir.

Hücre yapılarındaki ideal olmayanlar, belirli bir hücre tipi için deneysel veriler kullanılarak hesaplanan hücre kapsamı gibi dahili parametreleri kullanan ikincil, yinelemeli bir algoritma ile açıklandı. Son olarak, görüntü içindeki göreceli yükseklik farklılıklarının değerlendirilmesine dayanarak çeşitli hücre tiplerinin seçici olarak dışlandığı bir izolasyon algoritması kullanılarak kokültür ortamlarının bir analizi gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşımın, monokültürlü hücreler için% 5'lik bir hata marjı içindeki hücreleri ve kokültürlü hücreler için% 10'luk bir hata marjı içindeki hücreleri doğru bir şekilde saydığı bulunmuştur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazılım, sonuçların doğru, verimli ve tarafsız olmasını sağlamak için görüntü analizi teknikleri sırasında rutin olarak uygulanır. Hücre bazlı tahliller için yaygın bir sorun, hücrelerin yanlış tanımlanmasıdır. Uygun olmayan odak ve kontrast ayarlarına sahip görüntüler, tek tek hücrelerin sınırlarının tanımlanmasının zorlaştığı hücre bulanıklığına neden olabilir1. Gözenekler, kabarcıklar veya diğer istenmeyen nesneler gibi yabancı görüntü özelliklerinin varlığı, sayma işlemini yavaşlatarak ve yanlış tanımlamaya yol açarak sayma prosedürlerini engelleyebilir. Ayrıca, hücre sayımı zahmetli olabilir ve yüzlerce kopyayı saymak son derece zaman alıc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre kültürü ve görüntü alımı

  1. Kültür RAW264.7 Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) 37 ° C'de makrofajlar ve% 5 CO2 ,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin-streptomisin, 1.5 g / L sodyum bikarbonat ve 5 μM β-merkaptoetanol ile desteklenir.
    1. Monokültür görüntüleme için, 1 mL ortama sahip 5 mL'lik bir hücre kültürü şişesinde 25.000 hücre /cm2 yoğunluğunda kültür RAW264.7 hücreleri.
  2. DMEM'de 37 °C'de kültür NIH / 3T3 hücreleri ve% 5 CO2 ,% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin11 ile desteklenir.
  3. Kokültür görüntüleme için....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Soğanlı olmayan RAW264.7 makrofajların analizi, 25.000 hücre/ cm2'de monokültür ortamında gerçekleştirildi. Hücre kültürünün temsili görüntüleri alındı ve ImageJ'de 8-bit tiff'e dönüştürüldükten sonra MATLAB'da işlendi. Süreç boyunca algoritma çıktıları kaydedildi ve temsili görüntü için Şekil 2'de belgelendi. Bu görüntüde, algoritma 226 hücre saydı ve bu görüntü sayısı, 241 hücreyi tanımlayan manuel bir sayımla karşılaştırılarak doğrulandı (% 6.2 hata). RAW264.7 hücre sayımlarını.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreleri hücre yüksekliğine göre doğru ve verimli bir şekilde sayan ve kokültür sistemlerinde bile hücrelerin lekesiz kantitasyonuna izin veren genel bir alan tabanlı prosedür tasarladık. Bu prosedür için kritik adımlar, hücrelerin farklılaştırılabileceği göreceli bir yoğunluk sisteminin uygulanmasını içeriyordu. Göreceli yükseklik analizinin kullanılması iki amaca hizmet etti: verilen hücre tipi ve parametresi için göreceli parametreler sabit olduğundan ve her görüntü için mutlak parlaklık / kontrast seviyelerinin giri.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 AR067247) ve kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Delaware Eyaleti'nden Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü-NIGMS (P20 GM103446) tarafından desteklenen Delaware INBRE programı tarafından finanse edilmiştir. Makalenin içeriği, finansman kuruluşlarının görüşlerini yansıtmak zorunda değildir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Axio Observer 7 Ters MikroskopZeiss1028290770
β-merkaptoetanolYaşam Teknolojileri21985023
Hücre SıyırıcılarCellTreat229310
Dublecco'nun Modifiye Eagle MediumFisher Scientific12430047
Dublecco'nun PBSFisher Scientific14190144
MATLAB YazılımıMathWorks2021A
NIH/3T3 HücreleriATCCATCC CRL - 1658
Penisilin ve ndash; StreptomisinSigma AldrichP4333-20ML
RAW264.7 HücreleriATCCATCC TIB - 71
Sodyum BikarbonatSigma AldrichS6014-25G
T75 Hücre KültürüŞişesi CorningCLS3814-24EA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection. Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).
  2. Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Image Analysis AlgorithmArea Based AnalysisMacrophage Fibroblast CocultureCell QuantificationPercentile Based DetectionCell Coverage AnalysisMonoculture ImagingWatershed TransformationCell Type IdentificationMATLAB Image Processing

Related Articles