Makrofaj-fibroblast Kokültürlerinin Nicelleştirilmesi için Alan Tabanlı Görüntü Analiz Algoritması

Özet

Hücre sayımlarını tanımlamak için genelleştirilebilir alan tabanlı görüntü analizi yaklaşımını kullanan bir yöntem sunuyoruz. Farklı hücre popülasyonlarının analizi, uyarlanabilir bir algoritma içinde farklı hücre tipleri arasındaki önemli hücre yüksekliği ve yapı farklılıklarından yararlandı.

Özet

Hücrelerin nicelleştirilmesi, çok çeşitli biyolojik ve biyokimyasal çalışmalar için gereklidir. Hücrelerin geleneksel görüntü analizi, tipik olarak, immünofloresan boyama veya floresan proteinlerle transfeksiyon gibi floresan algılama yaklaşımlarını veya görüntü arka planındaki gürültü ve diğer ideal olmayan şeyler nedeniyle genellikle hataya eğilimli olan kenar algılama tekniklerini kullanır.

Makrofajları ve fibroblastları, doku rejenerasyonu sırasında sıklıkla kolokalize olan farklı fenotiplerin hücrelerini doğru bir şekilde sayabilen ve ayırt edebilen yeni bir algoritma tasarladık. MATLAB, arka plandan yükseklik farklılıklarına dayanarak farklı hücre tiplerini farklılaştıran algoritmayı uygulamak için kullanıldı. Hücre boyutu/yapısı ve yüksek yoğunluklu tohumlama koşullarındaki değişimleri hesaba katmak için alan tabanlı bir yöntem kullanılarak birincil bir algoritma geliştirilmiştir.

Hücre yapılarındaki ideal olmayanlar, belirli bir hücre tipi için deneysel veriler kullanılarak hesaplanan hücre kapsamı gibi dahili parametreleri kullanan ikincil, yinelemeli bir algoritma ile açıklandı. Son olarak, görüntü içindeki göreceli yükseklik farklılıklarının değerlendirilmesine dayanarak çeşitli hücre tiplerinin seçici olarak dışlandığı bir izolasyon algoritması kullanılarak kokültür ortamlarının bir analizi gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşımın, monokültürlü hücreler için% 5'lik bir hata marjı içindeki hücreleri ve kokültürlü hücreler için% 10'luk bir hata marjı içindeki hücreleri doğru bir şekilde saydığı bulunmuştur.

Giriş

Yazılım, sonuçların doğru, verimli ve tarafsız olmasını sağlamak için görüntü analizi teknikleri sırasında rutin olarak uygulanır. Hücre bazlı tahliller için yaygın bir sorun, hücrelerin yanlış tanımlanmasıdır. Uygun olmayan odak ve kontrast ayarlarına sahip görüntüler, tek tek hücrelerin sınırlarının tanımlanmasının zorlaştığı hücre bulanıklığına neden olabilir¹. Gözenekler, kabarcıklar veya diğer istenmeyen nesneler gibi yabancı görüntü özelliklerinin varlığı, sayma işlemini yavaşlatarak ve yanlış tanımlamaya yol açarak sayma prosedürlerini engelleyebilir. Ayrıca, hücre sayımı zahmetli olabilir ve yüzlerce kopyayı saymak son derece zaman alıcı olabilir. Dahası, manuel sayım sırasında doğal bir öznel önyargı vardır ve bu nedenle hücre tanımlaması ile ilgili karar verme genellikle yanlıştır². Otomatik yazılım, araştırmacı önyargısının etkisini azaltan iyi tanımlanmış tanımlama kriterlerine dayanarak, hücreleri hassas algılama için insan kapasitesinin çok ötesindeki nesneler de dahil olmak üzere yabancı nesnelerden hızlı ve hassas bir şekilde ayırt ederek tüm bu sorunları atlamak için heyecan verici bir potansiyel sunar. Otomatik yazılım kullanarak hücreleri tanımlamak için yaygın teknikler iki ana yöntemi içerir: segmentasyon ve eşik³. Burada, yaygın olarak erişilebilir bir yazılım çerçevesinde hızlı, doğru ve ucuz hücre sayımını sağlayan genelleştirilebilir alan tabanlı bir protokol sunuyoruz.

Kenar algılama gibi segmentasyon teknikleri, bir görüntüdeki yoğunluk farklılıklarını kullanarak tek tek hücreleri izole etmeyi amaçlar. Bir hücreyi görüntünün geri kalanından ayıran yoğunluk değişiklikleri çoğunlukla parlaklıktaki keskin değişikliklerden oluşur⁴. Kenar algılama, düzenli bir filtreleme adımını ve ardından yoğunluk değişikliklerinin algılandığı bir farklılaştırma adımını içerir. Farklılaşma süreci, yüksek yoğunluklu değişikliklerin görüntüsündeki kenarları ve konturları tanımlar ve bu kenarlar ve konturlar hücre varlığı ile ilişkilidir. Gürültülü görüntüler gürültü giderme algoritmaları⁴ aracılığıyla çalıştırılabilse de, kenar algılama teknikleri düşük arka plan gürültüsüne sahip görüntüleri analiz etmek için idealdir. İşlem, hücre sınırları açıkça ve kolayca ayırt edilebildiğinde ve hücre varlığı, hücre bulanıklığı, yabancı nesneler veya tanımlanmış iç hücre yapıları ile ilgisi olmayan parlaklık konturları tarafından engellenmediğinde en iyi şekilde çalışır ^1,2. Bir görüntü özellikle gürültülüyse, hücreler floresan boyama veya floresan proteinleri ile transfeksiyon yoluyla daha da ayırt edilebilir ^2,5. Bu, segmentasyon tekniklerinin doğruluğunu önemli ölçüde artırsa da, hücre kültürlerini görüntülemeye hazırlamak için ek maliyetler ve ek zaman yatırımları gerektirir.

Eşik teknikleri, bir görüntünün iki kategoriye ayrılmasını içerir: ön plan ve arka plan, ön plana atanmış hücreler³. Bu teknikler, bir nesnenin görünür yüksekliğini tanımlamak için renk / kontrast değişikliklerini kullanır; arka plandan rutin olarak 'daha uzun' olan nesneler kolayca hücre olarak tanımlanabilir. Havza-dönüşüm, yüzeyleri ön plan olarak açık piksellerle ve arka plan ^6,7 olarak koyu pikselli yüzeyleri ilişkilendirerek bu şekilde çalışır. Yüksekliğe dayalı tanımlama yoluyla, eşik teknikleri, aynı odak düzleminde bulunmaları koşuluyla, gürültüyü istenen nesnelerden rutin olarak ayırt edebilir. Alan tabanlı bir niceleme ile eşleştirildiğinde, bir havza dönüşümü, kenar algılama gibi tipik segmentasyon tekniklerinin yanlış olacağı ortamlardaki nesne gruplarını doğru bir şekilde tanımlayabilir.

Havza dönüşümleri, görüntüleri daha temiz bir analiz için hazırlamak için genellikle segmentasyon teknikleriyle birleştirilir ve hücre sayımının daha yüksek doğruluğu ile sonuçlanır. Bu süreç için, havza dönüşümü, segmentasyondan önce potansiyel ilgi alanlarını vurgulamak için kullanılır. Bir havza dönüşümü, görüntülerin ön planındaki hücreleri tanımlayarak benzersiz faydalar sağlar; bu, düzensiz arka plan yamaları gibi hücreler için potansiyel yanlış pozitifleri kaldırarak segmentasyon analizinin doğruluğunu artırabilir. Bununla birlikte, hücre tabanlı görüntüleri bir havza dönüşümüne uyarlamaya çalışırken zorluklar ortaya çıkabilir. Yüksek hücre yoğunluğuna sahip görüntüler, hücre agregalarının tek tek bileşenler yerine tekil bir grup olarak tanımlandığı alt segmentasyonla boğuşabilir. Gürültü veya keskin yoğunluk değişikliklerinin varlığı, algoritmanın hücreleri aşırı izole ettiği ve aşırı ve yanlış hücre sayımlarına neden olan aşırı segmentasyona da neden olabilir⁸.

Burada, Şekil 1'de gösterildiği gibi, bir eşik analizinin bileşenlerini alan tabanlı bir niceleme algoritmasına dahil ederek havza dönüşümünün birincil dezavantajlarını en aza indirgemek için bir yöntem detaylandırıyoruz. Özellikle, bu algoritma açık kaynaklı ve / veya yaygın olarak bulunan yazılımlarla uygulandı ve bu hücre sayma çerçevesinin uygulanması, pahalı reaktifler veya karmaşık hücre hazırlama teknikleri olmadan mümkün oldu. RAW264.7 makrofajları, bağ dokusu bakımı ve yara iyileşme süreçlerinin düzenlenmesindeki kritik rolleri nedeniyle yöntemi göstermek için kullanıldı⁹. Ek olarak, NIH / 3T3 fibroblastları doku bakımı ve onarımındaki kilit rolleri nedeniyle analiz edildi. Fibroblast hücreleri sıklıkla makrofajlarla birlikte bulunur ve onları destekler, bu da kokültür çalışmalarında bu fenotipik olarak farklı hücre tiplerini ayırt etme ihtiyacını doğurur.

Yüksek canlı hücre yoğunluğuna (VCD) sahip görüntülerden elde edilen hücre sayımları, hücrelerin kapladığı alanı ve tekil bir hücrenin kapladığı ortalama alanı hesaplayarak güvenilir ve verimli bir şekilde ölçülebilir. Hücre tanımlaması için segmentasyonun aksine eşik değerlemenin kullanılması, kokültürlerdeki farklı hücre tiplerinin eşzamanlı olarak analiz edildiği deneyler gibi daha karmaşık analizlere de olanak sağlamıştır. Genellikle bir yara iyileşme bölgesi içinde RAW264.7 makrofajları ile kolokalize olduğu tespit edilen NIH / 3T3 fibroblastlarının,^{makrofajların} fokal düzleminden farklı bir odak düzleminde büyüdüğü bulunmuştur. Buna göre, analiz edilen hücre tipine bağlı olarak arka planı ve ön planı tanımlamak için çoklu eşik algoritmaları çalıştırıldı ve aynı görüntü içindeki iki farklı hücre tipinin doğru sayılmasını sağladı.

Protokol

1. Hücre kültürü ve görüntü alımı

1. Kültür RAW264.7 Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) 37 ° C'de makrofajlar ve% 5 CO₂ ,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin-streptomisin, 1.5 g / L sodyum bikarbonat ve 5 μM β-merkaptoetanol ile desteklenir.
   1. Monokültür görüntüleme için, 1 mL ortama sahip 5 mL'lik bir hücre kültürü şişesinde 25.000 hücre /^cm2 yoğunluğunda kültür RAW264.7 hücreleri.
2. DMEM'de 37 °C'de kültür NIH / 3T3 hücreleri ve% 5 CO₂ ,% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin¹¹ ile desteklenir.
3. Kokültür görüntüleme için, kültür RAW264.7 makrofajları ve NIH / 3T3 fibroblastları, toplam 25.000 hücre /^cm2 yoğunluğunda, çeşitli oranlarda birlikte bulunur. 1 kısım RAW264.7 medium (DMEM% 10 FBS,% 1 penisilin-streptomisin, 1.5 g / L sodyum bikarbonat ve 5 μM β-merkaptoetanol) ve 1 kısım NIH / 3T3 ortamı (DMEM% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir) olan kokültür ortamı kullanın.
4. Tohumlamayı takiben, hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de inkübe ederek,% 80 hücre birleşmesinin canlı bir hücre yoğunluğuna ulaşın.
5. 40x hedefi ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskopa sahip görüntü hücreleri. Tüm görüntüleri gri tonlamalı olarak alın ve ham '.czi' dosyasına dışa aktarın.
   1. Bir dizi görüntü kalitesine sahip görüntüleri doğru bir şekilde değerlendirmek için algoritmanın kapasitesini belirleyin. Hem 'soğanlı olmayan' görüntüler (Şekil 2) hem de 'soğanlı' görüntüler (Şekil 3) üreterek farklı odaklara sahip görüntüler elde edin.
   2. MATLAB analizinden önce ham '.czi' dosyalarındaki 'Toplu Dönüştürme' işlevini kullanarak ImageJ kullanarak hücre görüntülerini 8 bit tiff (.tiff) görüntü biçimine dışa aktarın ve dönüştürün. Dönüştürülen görüntüleri yerel bir klasörde depolayın ve bu görüntü dosyalarını ilgili MATLAB kutusuna el ile aktarın.

2. Öncelikle "monokültür" dosyasını kullanan görüntü analizi-monokültür .m

NOT: Aşağıdaki adımlar MATLAB kullanılarak gerçekleştirilmiştir. MATLAB protokolü için üç dosya kullanılmıştır: "süreç.m" (Ek kodlama dosyası 1), algoritmayı içeren dosya, "monokültür.m" (Ek kodlama dosyası 2), monokültür görüntülerini analiz etmek için çalıştırılacak dosya ve "coculture_modified.m" (Ek kodlama dosyası 3), ortak kültür görüntülerini analiz etmek için çalıştırılacak dosya.

1. Göreceli yükseklik varyasyonları gösteren hücrelerin görüntülerini elde etmek için alan tabanlı yöntemi kullanın. Her alt görüntü için 'imshow()' işlevini kullanarak her alt adım için görüntü çıktıları. Analiz için görüntü dosyasını kopyalayıp çöp kutusuna yapıştırın ve aşağıdaki komutta dosya adını girin. Programı başlatmak için çalıştır'a basın.
   imread('dosya adı.tiff')
   1. Ön planı arka plandan büyütmek için kaynak işlevleri^8'i kullanarak görüntüleri 'yeniden yapılandırmayla açma' ve ardından 'yeniden yapılandırma ile kapatma' ile analiz edin. Yeniden yapılandırma ile açmak için ilk komutu ve yeniden yapılandırma ile kapatmak için ikinci ve üçüncü sıraları kullanın
      'imopen()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. Yüzdelik dilim tabanlı bir tanımlama sistemi kullanarak yeniden yapılandırılmış görüntüleri saf siyah ve saf beyaz piksellere ikiye bölün. Bu sistemde hücrelerin '255' saf beyaz piksel değerine dönüştürüldüğünü, arka plan ve yabancı (hücresel olmayan) nesnelerin ise '0' saf siyah piksel değerine dönüştürüldüğünü unutmayın.
   1. Belirli bir görüntünün en az %0,5'ini oluşturan en büyük piksel değeri olan "maksimum alakalı piksel"den yüzdelik bir fark kullanarak hücreleri arka plandan ayırt edin.
   2. RAW264.7 makrofajlar için piksel değerlerini analiz edin ve değerlendirin. Bu değerler maksimum alakalı pikselin %4,5'i içindeyse pikseli hücresel olarak işaretleyin.
      NOT: Bu komut, basit bir if deyimi kullanılarak verilebilir.
   3. Şekil 2'de görülenler gibi soğanlı hücre profilleri içeren görüntüler için, hücrelerin merkezlerindeki hatalı ikilileştirmeyi düzeltmek için yinelemeli bir prosedür uygulayın ("adalar" olarak adlandırılır; aşağıya bakınız).
   4. Toplam hücre kapsamı için bir başlangıç tahmini belirleyin; Bu çalışmada %60'ından yararlanılmıştır. Görüntüde bulunan hücre sayısının hücre kapsamına bağlı olması gerektiğini unutmayın - hücre sayısı ile hücre kapsamı arasındaki ilişki bu nedenle deneysel olarak belirlenebilir. Bu ilişkiyi kullanarak, 'Alfa' ve 'kappa' değişkenlerini belirleyin.
      NOT: 'Alfa', aşağıdaki göreceli yükseklik yüzdelik dilimlerini içeren 3 x 1 vektörü temsil eder: hücrelerin tanımlandığı yükseklik yüzdelik dilimi, arka planın tanımlandığı yükseklik yüzdelik dilimi ve yoğunluk değerlerinin tipik olarak hücre değerlerinden önemli ölçüde daha düşük olduğu adaların-bölgelerin bulunduğu yükseklik yüzdelik dilimi. 'Kappa', görüntüdeki hücrelerin kapladığı toplam alanı temsil eder.
   5. (i) adaların bir bölümünü doldurmak için alfa ve kappa'nın ilk tahminlerini kullanarak görüntüleri analiz edecek ve (ii) kappa'yı yeniden hesaplamak için analiz sonrası hücre sayılarını ve kapsamını kullanacak olan algoritmayı çalıştırın. Kappa değeri ilk tahminin %10'u içindeyse, bir sonraki adıma geçin.
      NOT: RAW264.7 ve NIH/3T3 hücrelerini içeren görüntülerde alfanın [4.3, 5.5, 10] olduğu bulunmuştur. Başka bir deyişle, ilgili maksimum pikselden% 4,3'lük bir fark, hücrelerin tanımlandığı yükseklik yüzdelik dilimini, maksimum ilgili pikselden% 5,5'lik bir fark, arka planın tanımlandığı yükseklik yüzdelik dilimini belirledi. İlgili maksimum pikselden %10'luk bir fark, adaların tipik olarak bulunduğu yükseklik yüzdelik dilimini belirledi.
3. Görüntünün ikilendirilmesini takiben, ikili görüntü^12,13,14 üzerinde bir Hough dönüşümü gerçekleştiren açık kaynaklı daire bulma algoritmasını kullanarak ortalama hücre alanını otomatik olarak belirleyin. Görüntüde bulunan tüm merkez konumlarının ve dairelerin yarıçaplarının vektörünü elde etmek için aşağıdaki komutu kullanın.
   '[merkezler, yarıçap] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])'
   Bu komuttaki 'A' seçilecek görüntüdür ve [minradius, maxradius], algoritmanın algılamaya çalışacağı yarıçap aralığıdır.
   NOT: Ortalama hücre alanını belirlemeye yönelik bu prosedür, makrofaj hücrelerinin morfolojisinin hücreler arasında hem dairesel hem de tutarlı olduğunu varsayar¹⁰. Deneysel verilerden, makrofajların yarıçapının en yaygın olarak 40x büyütmede 30 ila 50 piksel arasında olduğu gözlenmiştir. Bu piksel aralığı, daire bulma algoritması için kabul edilebilir aralık olarak tanımlanır. Yarıçap diğer hücre tipleri için önemli ölçüde farklı olabilir ve deneysel analiz kullanılarak belirlenmesini gerektirir.
   1. Ortalama hücre alanının ortalamasını alarak hesaplamak için yarıçap çıkışlarını kullanın. Doğru alan tanımlamasını sağlamak için en az 10 hücreyi analiz edin.
4. Ortalama hücre alanını kullanarak görüntüdeki toplam hücre sayısını belirleyin.
   1. Görüntü matrisinde döngü yapın ve toplam hücre pikseli sayısını sayın. Hücre piksellerinin sayısını görüntüdeki toplam piksel sayısına bölerek toplam hücre kapsamını belirleyin. Hücre piksellerinin sayısını hücrenin ortalama alanına bölerek görüntüdeki toplam hücre sayısını belirleyin.

3. Öncelikle "coculture_modified.m" dosyasını kullanan görüntü analizi-kokültür

NOT: Aşağıdaki adımlar MATLAB kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

1. Göreceli yükseklik varyasyonları gösteren hücrelerin görüntülerini elde etmek için alan tabanlı yöntemi kullanın. Her alt görüntü için 'imshow()' işlevini kullanarak her alt adım için görüntü çıktıları. Analiz için görüntü dosyasını kopyalayıp çöp kutusuna yapıştırın ve aşağıdaki komutta dosya adını girin. Programı başlatmak için çalıştır'a basın.
   'imread('dosya adı.tiff')'
   1. Ön planı arka plandan büyütmek için kaynak işlevleri^10'u kullanarak görüntüleri 'yeniden yapılandırmayla açma' ve ardından 'yeniden yapılandırma ile kapatma' ile analiz edin. Yeniden yapılandırma ile açmak için ilk komutu ve yeniden yapılandırma ile kapatmak için ikinci ve üçüncü sıraları kullanın.
      'açık olmayan ()'
      'imerode()'
      'imreconstruct()'
2. İki hücre tipi arasındaki yükseklik farklılıklarından yararlanarak elde edilen iki seçici ikilendirme kullanarak RAW264.7 ve NIH / 3T3 hücrelerini içeren kokültürlerin analizini yapın.
   1. RAW264.7 ve NIH / 3T3 hücrelerinin görüntülerini kullanarak deneysel olarak bir 'phi' parametresi belirleyin, phi iki hücre tipi arasındaki orantılı yükseklik farkını temsil eder. İlk phi değerini tahmin edin ve hücre sayıları ve kapsama alanı, RAW264.7 ve NIH / 3T3 kokültürüne özgü manuel sayımlarla yakından eşleşene kadar yineleyin.
      NOT: Bu çalışmalarda kullanılan phi değeri 3.2 olarak bulunmuştur. Phi, Şekil 4C'de görüldüğü gibi, bir görüntüyü yalnızca RAW264.7 hücreleri içeriyormuş gibi görünecek şekilde seçici olarak filtrelemek için kullanılır.
   2. RAW264.7 hücre sayılarını ve toplam hücre kapsamını monokültür görüntülerinde olduğu gibi belirleyin.
3. Havza dönüştürülmüş görüntüyü phi parametresi olmadan tekrar analiz edin, hem makrofajları hem de fibroblastları tespit edin. Adım 2'de açıklanan standart eşik ve alan tabanlı niceleme yöntemleri kullanılarak elde edilen RAW264.7 hücre piksellerini seçici olarak çıkararak NIH/3T3 fibroblast verilerini elde edin.
   1. Görüntünün tamamı analiz edildikten sonra, toplam hücre pikseli sayısını RAW264,7 piksel sayısından çıkararak toplam NIH/3T3 piksel sayısını belirleyin. NIH/3T3 ve RAW264.7 hücrelerinin kapsamını, her hücre satırı için hücre pikseli sayısını toplam görüntü pikseli sayısına bölerek hesaplayın.

Sonuçlar

Soğanlı olmayan RAW264.7 makrofajların analizi, 25.000 hücre^/ cm2'de monokültür ortamında gerçekleştirildi. Hücre kültürünün temsili görüntüleri alındı ve ImageJ'de 8-bit tiff'e dönüştürüldükten sonra MATLAB'da işlendi. Süreç boyunca algoritma çıktıları kaydedildi ve temsili görüntü için Şekil 2'de belgelendi. Bu görüntüde, algoritma 226 hücre saydı ve bu görüntü sayısı, 241 hücreyi tanımlayan manuel bir sayımla karşılaştırılarak doğrulandı (% 6.2 hata). RAW264.7 hücre sayımlarını...

Tartışma

Hücreleri hücre yüksekliğine göre doğru ve verimli bir şekilde sayan ve kokültür sistemlerinde bile hücrelerin lekesiz kantitasyonuna izin veren genel bir alan tabanlı prosedür tasarladık. Bu prosedür için kritik adımlar, hücrelerin farklılaştırılabileceği göreceli bir yoğunluk sisteminin uygulanmasını içeriyordu. Göreceli yükseklik analizinin kullanılması iki amaca hizmet etti: verilen hücre tipi ve parametresi için göreceli parametreler sabit olduğundan ve her görüntü için mutlak parlaklık / kontrast seviyelerinin giri...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Axio Observer 7 Ters Mikroskop	Zeiss	1028290770
β-merkaptoetanol	Yaşam Teknolojileri	21985023
Hücre Sıyırıcılar	CellTreat	229310
Dublecco'nun Modifiye Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco'nun PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Yazılımı	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Hücreleri	ATCC	ATCC CRL - 1658
Penisilin ve ndash; Streptomisin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Hücreleri	ATCC	ATCC TIB - 71
Sodyum Bikarbonat	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Hücre Kültürü	Şişesi Corning	CLS3814-24EA