Yöntem makalesi

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

DOI:

10.3791/63062

⸱

16 Aralık 2021

 ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology & Hepatology, Mayo Clinic, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Mayo Clinic

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSEC'ler), dolaşım ve karaciğer parankimi arasındaki arayüzde yer alan özelleşmiş endotel hücreleridir. LSEC'ler, fenestra varlığı ve bazal membranın yokluğu ile karakterize edilen farklı bir morfolojiye sahiptir. LSEC'ler, metabolik disregülasyon, inflamasyon, fibroz, anjiyogenez ve karsinogenez dahil olmak üzere karaciğerdeki birçok patolojik bozuklukta önemli rol oynamaktadır. Bununla birlikte, LSEC'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu hakkında çok az şey yayınlanmıştır. Burada, bu protokol LSEC'in hem sağlıklı hem de alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) farelerinden izolasyonunu tartışmaktadır. Protokol, fare karaciğerinin kollajenaz perfüzyonuna ve LSEC'leri saflaştırmak için manyetik boncukların parankimal olmayan hücrelerin pozitif seçimine dayanmaktadır. Bu çalışma, akış sitometrisi ile spesifik belirteçler kullanarak LSEC'leri karakterize eder ve elektron mikroskobu taraması ile karakteristik fenotipik özellikleri tanımlar. Bu protokolü takiben izole edilen LSEC'ler, yapışma ve geçirgenlik testleri de dahil olmak üzere fonksiyonel çalışmaların yanı sıra belirli bir ilgi yolu için aşağı akış çalışmaları için kullanılabilir. Ek olarak, bu LSEC'ler ayrı ayrı havuzlanabilir veya kullanılabilir, RNA-seq kütlesi veya tek hücreli, proteomik veya fosfo-proteomik ve diğerlerinin yanı sıra dizileme (ATAC-seq) kullanarak Transpozaz-Erişilebilir Kromatin Testi dahil olmak üzere multi-omik veri üretimine izin verir. Bu protokol, LSEC'lerin sağlık ve hastalıktaki diğer karaciğer hücreleri ile iletişimini inceleyen araştırmacılar için yararlı olacak ve LSEC'lerin akut ve kronik karaciğer hasarının patojenik mekanizmalarındaki rolünün derinlemesine anlaşılmasını sağlayacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSEC'ler) hepatik sinüzoid duvarları kaplar ve karaciğerde en bol bulunan parankimal olmayan hücrelerdir1. LSEC'ler, vücudun başka yerlerindeki diğer kılcal endotel hücrelerinden fenestra varlığı ve klasik bir bazal membran veya diyaframeksikliği ile ayırt edilir 2,3. Bu nedenle, LSEC'ler, lipitler ve lipoproteinler de dahil olmak üzere çeşitli dolaşımdaki makromolekülleri ortadan kaldırmak için geçirgenliklerini ve endositik kapasitelerini artıran ayırt edici fenotipik ve yapısal özelliklere sahiptir. LSEC'ler, yıldız hücreleri ve bağışıklık hücreleri gibi parankimal ve parankimal olmayan hücreler arasındaki çapraz konuşmada çok önemli bir rol oynar. LSEC'ler, yıldız hücrelerini ve Kupffer hücrelerini sessiz bir durumda tutarak karaciğer homeostazını korumada anahtardır4. LSEC'ler, dolaşımdaki lökositlerin adezyona ve transendotel göçüne aracılık ederek hepatik immün hücre popülasyonlarının bileşimini modüle eder 5,6. İskemi-reperfüzyon hasarı (IRI)8, alkolsüz steatohepatit (NASH)9 ve hepatosellüler karsinom (HCC) dahil olmak üzere akut ve kronik karaciğer hasarı7 sırasında, LSEC'ler defenestrasyon ve bazal membran oluşumu ile karakterize kapillarizasyon olarak bilinen fenotipik değişikliklere uğrar10. LSEC'lerdeki bu fenotipik değişiklikler, LSEC'lerin disfonksiyonu ve protrombotik, proenflamatuar ve profibrojenik özelliklerin kazanılması ile ilişkilidir.

LSEC'lerin fare karaciğerinden izolasyonu için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir11. Bazı teknikler, parankimal olmayan ve parankimal hücrelerin ayrılmasına ve ardından LSEC'leri parankimal olmayan fraksiyonlardan arındırmak için yoğunluk gradyanı santrifüjlenmesine bağlıdır. Bu yöntemin sınırlaması, LSEC'lerin izolasyonunun son adımlarında kirletici makrofajların varlığıdır ve bu da izole edilmiş LSEC'lerin saflığını etkileyebilir12. Bu protokol, fare karaciğerinin kollajenaz perfüzyonuna ve LSEC'leri saflaştırmak için CD146 + manyetik boncukların parankimal olmayan hücrelerin pozitif seçimine dayanmaktadır. Bu yöntem kullanılarak izole edilen LSEC'ler yüksek saflık ve korunmuş morfoloji ve canlılık gösterir. Bu LSEC'ler, geçirgenlik ve adezyon testi de dahil olmak üzere fonksiyonel çalışmaların yanı sıra ilgilenilen yollar için aşağı akış çalışmaları için de optimumdur. Dahası, hem klinik araştırma hem de keşif biliminde büyük veri kümeleri oluşturmaya olan ilginin artmasıyla birlikte, alkolsüz steatohepatit (NASH) veya diğer koşullara sahip hem sağlıklı hem de hastalıklı karaciğerlerden izole edilen bu yüksek kaliteli LSEC'ler, çoklu omik veri üretimine ve sağlık ile hastalık arasında karşılaştırmaya izin vererek ayrı ayrı toplanabilir veyakullanılabilir13,14 . Ek olarak, izole LSEC'ler, LSEC'lerdeki aktif sinyal yolunu ve farklı zararlı uyaranlar altında ve çeşitli terapötik müdahalelere yanıt olarak diğer karaciğer hücreleriyle hücresel iletişimlerini deşifre etmek için organoidler gibi iki boyutlu ve üç boyutlu in vitro modeller geliştirmek için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan protokolleri, Mayo Clinic'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandığı şekilde yürütülmüştür. Jackson Laboratuvarı'ndan sekiz haftalık C57BL/6J erkek fareler satın alındı. Fareler, diyete ücretsiz erişimi olan sıcaklık kontrollü 12: 12 saatlik bir aydınlık-karanlık döngü tesisinde barındırıldı.

1. Kollajen kaplı kültür tabağı veya tabağının hazırlanması

  1. 50 mL 0.02 mol / L asetik asit yapmak için, 49.4 mLH2O'ya 0.6 mL buzul asetik asit ekleyin.
  2. 0.02 mol / L asetik asit içinde 50 μg / mL kollajen tip I yapın. Seyreltme, partinin konsantrasyonuna bağlıdır.
  3. 10 cm'lik kültür kaplarını 3 mL kollajen çözeltisi ile kaplayın. 1 saat boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.
    NOT: Kültür için farklı bir tabak veya tabak kullanırken, kaplama çözeltisinin hacminin kültür alanına göre ayarlanması gerekir, genellikle 6-10 μg /cm2 kullanın.
  4. Kaplanmış yüzeydeki fazla sıvıyı çıkarın ve 3 kez Fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Bulaşıkların havalanarak kurumasını bekleyin.
  5. Kollajen çözeltisi steril değilse, kollajen kaplı bulaşıkları steril bir doku kültürü başlığında 10 dakika boyunca ultraviyole (UV) ışığa maruz bırakarak sterilize edin.

2. Ekipman kurulumu

  1. Isıtılmış ve nemlendirilmiş devridaim perfüzyon aparatını Şekil 1B'de gösterildiği gibi kurun.
  2. Perfüzyon sistemini 5 dakika boyunca% 10 ağartıcı kullanarak ve ardından 10 dakika daha steril su kullanarak durulayın.
  3. Kollajenaz çözeltisini perfüze etmeden önce durulama sıvısını mümkün olduğunca boşaltın.
  4. Kollajenaz çözeltisini perfüzyon sisteminden ( Şekil 1B'de gösterildiği gibi) 37 ° C'de ön ısıtmak için infüze edin. Pompa hızını hız kontrol kadranında gösterildiği gibi 1 hızına ayarlayın (40 mL/dk'ya eşit).
  5. Bu hızı tüm prosedür boyunca aynı tutun. LSEC izolasyonunun yapıldığı gün boyunca kapalı devrede çalıştırılan kollajenaz çözeltisini yeniden kullanın.
    NOT: LSEC'lerin biyolojik durumunu bozabilecek mekanik basıncı önlemek için pompa hızı 1'e sabitlenmiştir.

3. Cerrahi prosedür

  1. Fareyi tartın.
  2. 90 mg / kg vücut ağırlığı ketamin ve 10 mg / kg vücut ağırlığı intraperitoneal olarak ksilazin (IP) enjekte edin.
  3. Fare ağrılı uyaranlara karşı reaktif olmadığında, Şekil 1B'de gösterildiği gibi fareyi cerrahi yüzeye sabitleyin.
  4. Fare karnına% 70 etanol püskürtün. Cerrahi makas kullanarak, karnın alt kısmından başlayarak ksifoid sürece kadar ~ 5 cm uzunluğunda bir kesi yapın.
  5. Daha sonra, karın organlarını tamamen açığa çıkarmak için karnın her iki tarafında küçük iris makası kullanarak iki yanal kesim yapın.
  6. Karnı kaldırmak ve düzleştirmek için intravenöz (IV) kateterin kılıfını hayvanın sırtının altına yerleştirin.
  7. Düzenli bir kavisli pansuman forseps kullanarak, bağırsakları ve mideyi hayvanın soluna doğru yavaşça çekin.
  8. Açıkta kalan sol böbreğin hemen altındaki inferior vena kavanın (IVC) altına 5-0 cerrahi sütür yerleştirin. Dikişe gevşek bir bağlantı bağlayın.
  9. Hepatik PV'den dalak veni dallanma noktasının hemen üstüne hepatik portal venin (PV) etrafına 5-0 cerrahi sütür daha yerleştirin. Dikişe gevşek bir bağlantı bağlayın.
  10. PV sütürünü gerginlik olarak kullanarak, 20 G IV kateteri 1 cm aşağıdaki hepatik PV'ye yerleştirin ve burada sağa ve sola hepatik PV'ye dallanır.
  11. Kateteri damardan yukarı kaydırın, ancak dallanma bölgesinin altında tutun. Kanın damlamaya başlayana kadar kateterden aşağı inmesine izin verin.
  12. Tampon A'nın bir kısmı (Tablo 1) cerrahi alanın üzerine yerleştirilmiş bir intravenöz (IV) şişedeyken, bir IV hattı kullanın ve kateterin üzerine takın. Sisteme hava girmesini önlerken karaciğeri bu çözelti ile yıkayın.
  13. Böbreğin altındaki inferior vena kavanın etrafındaki dikişi bağlayın. Bu, karaciğerin retro perfüzyona izin verecektir.
  14. Hayvanın kanamasına izin vermek için IVC'yi dikişin altında kesin.
    NOT: Karaciğerin tıkanmasını önlemek için bu adım hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir.
  15. IV kateteri PV sütür ile sabitleyin.
  16. Rahatsız ettikten sonra, mideyi, bağırsakları, dalağı ve karaciğere bağlı diğer bağırsakları kesin.
  17. Diyaframı ve ana damarları göğüs boşluğundan kesin. Karaciğeri hayvandan çıkarın ve perfüzyon tepsisine yerleştirin.
  18. IV hattını dikkatlice çıkarın ve kollajenaz çözeltisini devridaim odasına bağlayın.
    NOT: 3.16-3.18 adımlarının 5 dakika içinde yapılması gerekir, bu nedenle karaciğer Tampon A ile çok uzun süre perfüze edilmeyecektir.
  19. Kapsül benekli hale gelene ve yumuşak görünene kadar karaciğerin perfüzyonuna izin verin (10-15 dakika veya daha fazla, süre farklı kollajenaz partilerine bağlı olarak değişir).
  20. Karaciğer perfüzyon halindeyken, bir nekropsi torbasına atmadan önce hayvanın öldüğünden emin olun.
  21. Sindirildikten sonra, karaciğeri odadan çıkarın ve yaklaşık 20 mL serumsuz Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içeren 10 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
  22. Karaciğeri birkaç pipet ucuyla yavaşça ayırın ve safra ağacını atın.
  23. Karaciğer süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir konik tüpe filtreleyin.
  24. RT'de 2 dakika boyunca 50 x g'de hücre süspansiyonunu santrifüj edin. Parankimal olmayan hepatik hücreler içeren süpernatantı toplayın.
    NOT: Hepatositler pelet içinde çökeltilir, bu da daha önce tarif edildiği gibi gradyan santrifüjleme kullanılarak daha da saflaştırılabilir15.

4. Parankimal olmayan hepatik hücrelerin ayrılması ve LSEC'lerin saflaştırılması

NOT: CD146+ LSEC'leri, üreticinin talimatlarını izleyerek immünomanyetik boncukları kullanarak saflaştırın.

  1. Süpernatantı 300 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  2. Hücre peletini toplayın ve 1 mL izolasyon tamponunda yeniden askıya alın (Tablo 1), üreticinin talimatlarını izleyerek otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre numarasını belirleyin.
  3. Hücre süspansiyonunu 300 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatantı tamamen aspire edin.
  4. Pelet, toplam 10 7 hücre başına 90 μL izolasyon tamponu ileyeniden askıya alın.
  5. Toplam 107 hücre başına 10 μL CD146 manyetik boncuk ekleyin. İyice karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. Hücreleri yıkamak için, 107 hücre başına 1-2 mL izolasyon tamponu ekleyin, 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve ardından süpernatantı tamamen aspire edin.
  7. 500 μL izolasyon tamponunda 10adede kadar 9 hücreyi yeniden askıya alın (Tablo 1).
    NOT: Daha yüksek hücre sayıları için, arabellek hacmini uygun şekilde ölçeklendirin.
  8. Ayırma kolonunu hazırlayın, 3 mL izolasyon tamponu ile durulayın.
  9. Hücre süspansiyonunu 70 μm ön ayırma filtreleriyle istiflenmiş sütuna uygulayın.
  10. Kolonu 3 mL izolasyon tamponu ile 3 kez yıkayın.
    NOT: Kolonu yıkarken, kolon haznesi boşalır boşalmaz izolasyon tamponu eklenmelidir.
  11. Kolonu separatörden çıkarın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Pipet kolon üzerine 5 mL izolasyon tamponu yerleştirin.
  12. Manyetik boncuk etiketli hücreleri kurtarmak için, hücreleri temizlemek için pistonu sütuna sıkıca itin.
  13. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. LSEC'ler mikroskobik inceleme ve aşağı akış analizi için hazırdır.

5. LSEC'lerin immünofenotiplenmesi ve akım sitometrisi ile saflık değerlendirmesi

  1. Üreticinin yönergelerini izleyerek otomatik hücre sayacı kullanarak yalıtılmış LSEC'lerin hücre numaralarını belirleyin.
  2. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin, süpernatantı tamamen aspire edin.
  3. 1 x 106 hücre/tüp alın ve 90 μL boyama tamponu ile yeniden askıya alın (Tablo 1).
  4. 10 μL/tüp fare FcR bloğu ve 1 μL canlılık boyası ekleyin, 10 dakika boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  5. CD45, CD146 ve stabilin-2 antikorlarının bir kombinasyonu ile hücreleri lekeleyin, 1:50'de boyama tamponu ile seyreltilir. 20 dakika boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  6. Hücreleri 5 mL boyama tamponu ile yıkayın ve 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın, ardından süpernatantı tamamen aspire edin.
  7. Hücreleri 300 μL boyama tamponu ile yeniden askıya alın ve akış sitometresinden geçirin.

6. LSEC'lerin kültürü ve sınavı

  1. Tohum 1 x 106 hücreli bir plakada 6 hücreli bir kuyucuk ve kültür,% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 1 endotel hücreleri büyüme takviyesi ve% 1 primosin çözeltisinden oluşan endotel hücreleri büyüme ortamı ile kültürleyin.
  2. İzole LSEC'leri ışık mikroskobu ile inceleyin. 10x büyütme ile parlak alan görüntüleri elde edin.

7. LSEC'lerin morfolojisi ve taramalı elektron mikroskobu ile fenestrae incelemesi

  1. Hücre kültürü eklerini (3 μm gözenek boyutu) kollajen çözeltisi ile önceden kaplayın.
  2. 37 ° C sıcak ve nemlendirilmiş atmosferde 24 delikli bir plakada endotel hücreleri büyüme ortamı ile kesici uç üzerinde kültür izole LSEC'ler (120.000 hücre). Hücrelerin yerleşmesine ve 2 saat boyunca yapışmasına izin verin.
  3. Hücre fiksasyonu için, 37 ° C'de önceden ısıtılmış eşdeğer bir hacim ekleyin Trump'ın hücre kültürü ortamına sabitleyicisi.
  4. 10 dakika boyunca kuluçkadan sonra,% 50 seyreltilmiş Trump'ın fiksatifini seyreltilmemiş Trump'ın fiksatif ile değiştirin.
  5. Trump fiksatif içindeki hücreleri 2 saat sabitleyin, daha sonra% 1 osmiyum tetroksitlerde 1 saat inkübe edin.
  6. Numunelerin dehidrasyonuna, kritik nokta kurutma cihazında kurutulmasına, montajına, püskürtme kaplamasına ve taramalı elektron mikroskobu kullanılarak incelenmesine devam edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel şemalar ve ekipman kurulumu:
Bu protokolde, fare karaciğeri kapalı bir perfüzyon devresi kullanılarak sindirildi, daha sonra parankimal olmayan hücreler ve hepatositler 2 dakika boyunca 50 x g'de düşük hızlı santrifüjleme ile ayrıldı. Primer LSEC'ler parankimal olmayan fraksiyondan CD146 manyetik boncuk seçimi kullanılarak izole edildi. Deneysel şemalar Şekil 1A'da gösterilmiştir. Kanül PV yoluyla yerleştirilirken, inferior vena kava karaciğer yoluyla ko...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, iki aşamalı kollajenaz perfüzyonu ve ardından manyetik aktive hücre sıralamadan (MACS) oluşan fare karaciğerinden LSEC izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol aşağıdaki üç adımdan oluşur: (1) Karaciğer hücresi dispersiyonunu sağlamak için kalsiyum içermeyen bir tampon ile PV yoluyla perfüzyon ve ardından kollajenaz içeren bir tampon; (2) Düşük hızlı santrifüjleme ile hepatositlerin dışlanması; ve (3) anti-CD146 manyetik boncuklar kullanarak parankimal olmayan hücrelerden (NPC'ler) LSEC'leri...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarların açıklayacağı herhangi bir çatışma yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, NIH Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (1RO1DK122948'den SHI'ye) ve NIH Silvio O. Conte Sindirim Hastalıkları Araştırma Çekirdek Merkezleri P30 hibe mekanizması (DK084567) tarafından desteklenmiştir. Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (JSPS) Denizaşırı Araştırma Bursu tarafından KF'ye de destek sağlandı. Ayrıca Dr. Gregory J. Gores ve Steven Bronk'a kollajenaz perfüzyon aparatının orijinal tasarımı ve optimizasyonu için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2.0 inç 20 G İntra Venöz (IV) kateterTerumo, SOmerset, NJ, ABDSR-OX2051CA
2– Merkezde bir delik bulunan 3 inçlik parfüm tepsisiözelleştirilmiş; evde üretilmiştir
à 488MBL International, Woburn, MA, ABDD317-A48
BSA hisse senediMiltenyi, Bergisch Gladbach, Almanya130-091-376
Anti-CD146 (LSEC)-PE, anti-fareMiltenyi, Bergisch Gladbach, Almanya130-118-407
CD146 (LSEC) Mikro Boncuklar, fareMiltenyi, Bergisch Gladbach, Almanya130-092-007
Anti-CD45-Viogreen, anti-fareMiltenyi, Bergisch Gladbach, Almanya130-110-803
Kollajen tip ICorning, Corning, NY, ABD354236
Kollajenaz IIGibco, Waltham, MA, ABD17101-015
Endotel hücreleri büyüme ortamıScienCell Araştırma Laboratuvarları, Carlsbad, CA, ABD211-500
FcR bloke edici reaktif, fareMiltenyi, Bergisch Gladbach, Almanya130-092-575
FlowJo yazılımı, sürüm 10.6Becton, Dickinson and Company
Sertleştirilmiş İnce makasFST, Foster city, CA, ABD14091-11
Isıtmalı (37 ° C) ve 10psi hızında Oksijen enjeksiyonu ile donatılmış nemlendirilmiş devridaim perfüzyon aparatı.özelleştirilmiş; Made in house
Hitachi S 4700 taramalı elektron mikroskobuHitachi Inc, Pleasanton, CA, ABDSEM096
LS sütunlarıMiltenyi, Bergisch Gladbach, Almanya130-042-401
MACS ön ayırma filtreleri (70 μ m)Miltenyi, Bergisch Gladbach, Almanya130-095-823
MACS durulama tamponuMiltenyi, Bergisch Gladbach, Almanya130-091-222
MACS Akıllı Süzgeç (70 & mu; m)Miltenyi, Bergisch Gladbach, Almanya130-098-462
MACSQunt akış sitometresiMiltenyi, Bergisch Gladbach, Almanya
Millicell Hücre Kültürü EkiMillipore Sigma, Burlington, MA, ABDPITP01250
Nexcelom hücre sayacıNexcelom biyobilimi, Lawrence, MA, ABDCellometer Auto T4 Plus
PercollGE Sağlık, Chicago, IL, ABD17-0891-01
Cerrahi makasF.S.T, Foster city, CA, ABD14001-12
Çok küçük kavisli pansuman forsepsFST, Foster city, CA, ABD11063-07
405/520 canlılık boyası Miltenyi, Bergisch Gladbach, Almanya 130-110-205 4 inç düzenli kavisli pansuman forseps Fisher Marka FS16-100-110 5-0 Perma-El ipek sütür Ethicon, Raritan, NJ, ABD A182H Anti-stabilin-2 (Fare) mAb-Alexa Fluor

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morin, O., Goulet, F., Normand, C. Liver sinusoidal endothelial cells: isolation, purification, characterization and interaction with hepatocytes. Revisiones Sobre Biologia Celular: RBC. 15, 1-85 (1988).
  2. Ibrahim, S. H. Sinusoidal endotheliopathy in nonalcoholic steatohepatitis: therapeutic implications. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 321 (1), 67-74 (2021).
  3. Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
  4. Marrone, G., Shah, V. H., Gracia-Sancho, J. Sinusoidal communication in liver fibrosis and regeneration. Journal of Hepatology. 65 (3), 608-617 (2016).
  5. Shetty, S., Lalor, P. F., Adams, D. H. Liver sinusoidal endothelial cells - gatekeepers of hepatic immunity. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 15 (9), 555-567 (2018).
  6. Smedsrød, B., Pertoft, H., Gustafson, S., Laurent, T. C. Scavenger functions of the liver endothelial cell. Biochemical Journal. 266 (2), 313-327 (1990).
  7. DeLeve, L. D. Liver sinusoidal endothelial cells in hepatic fibrosis. Hepatology. 61 (5), 1740-1746 (2015).
  8. Dar, W. A., Sullivan, E., Bynon, J. S., Eltzschig, H., Ju, C. Ischaemia reperfusion injury in liver transplantation: Cellular and molecular mechanisms. Liver International. 39 (5), 788-801 (2019).
  9. Furuta, K., Guo, Q., Hirsova, P., Ibrahim, S. H. Emerging Roles of Liver Sinusoidal Endothelial Cells in Nonalcoholic Steatohepatitis. Biology. 9 (11), Basel. 395(2020).
  10. Wu, L. Q., et al. Phenotypic and functional differences between human liver cancer endothelial cells and liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 45 (1), 78-86 (2008).
  11. Meyer, J., Gonelle-Gispert, C., Morel, P., Bühler, L. Methods for isolation and purification of murine liver sinusoidal endothelial cells: A systematic review. PLoS One. 11 (3), 0151945(2016).
  12. Meyer, J., Lacotte, S., Morel, P., Gonelle-Gispert, C., Buhler, L. An optimized method for mouse liver sinusoidal endothelial cell isolation. Experimental Cell Research. 349 (2), 291-301 (2016).
  13. Furuta, K., et al. Lipid-induced endothelial vascular cell adhesion molecule 1 promotes nonalcoholic steatohepatitis pathogenesis. Journal of Clinical Investigation. 131 (6), (2021).
  14. Guo, Q., et al. Integrin β(1)-enriched extracellular vesicles mediate monocyte adhesion and promote liver inflammation in murine NASH. Journal of Hepatology. 71 (1), 1193-1205 (2019).
  15. Hirsova, P., Ibrahim, S. H., Bronk, S. F., Yagita, H., Gores, G. J. Vismodegib suppresses TRAIL-mediated liver injury in a mouse model of nonalcoholic steatohepatitis. PLoS One. 8 (7), 70599(2013).
  16. Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
  17. Olsavszky, V., et al. Exploring the transcriptomic network of multi-ligand scavenger receptor Stabilin-1- and Stabilin-2-deficient liver sinusoidal endothelial cells. Gene. 768, 145284(2021).
  18. DeLeve, L. D., Maretti-Mira, A. C. Liver sinusoidal endothelial cell: An update. Seminars in Liver Disease. 37 (4), 377-387 (2017).
  19. DeLeve, L. D., Wang, X., Hu, L., McCuskey, M. K., McCuskey, R. S. Rat liver sinusoidal endothelial cell phenotype is maintained by paracrine and autocrine regulation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 287 (4), 757-763 (2004).
  20. Cabral, F., et al. Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993(2018).
  21. Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of tissue extracellular vesicles from the liver. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e58649(2019).
  22. Topp, S. A., Upadhya, G. A., Strasberg, S. M. Cold preservation of isolated sinusoidal endothelial cells in MMP 9 knockout mice: effect on morphology and platelet adhesion. Liver Transplantation. 10 (8), 1041-1048 (2004).
  23. Katz, S. C., Pillarisetty, V. G., Bleier, J. I., Shah, A. B., DeMatteo, R. P. Liver sinusoidal endothelial cells are insufficient to activate T cells. Journal of Immunology. 173 (1), 230-235 (2004).
  24. Liu, W., et al. Sample preparation method for isolation of single-cell types from mouse liver for proteomic studies. Proteomics. 11 (17), 3556-3564 (2011).
  25. Do, H., Healey, J. F., Waller, E. K., Lollar, P. Expression of factor VIII by murine liver sinusoidal endothelial cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (28), 19587-19592 (1999).
  26. Schrage, A., et al. Enhanced T cell transmigration across the murine liver sinusoidal endothelium is mediated by transcytosis and surface presentation of chemokines. Hepatology. 48 (4), 1262-1272 (2008).
  27. Chou, C. H., et al. Lysophosphatidic acid alters the expression profiles of angiogenic factors, cytokines, and chemokines in mouse liver sinusoidal endothelial cells. PLoS One. 10 (3), 0122060(2015).
  28. Deleve, L. D. Dacarbazine toxicity in murine liver cells: a model of hepatic endothelial injury and glutathione defense. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 268 (3), 1261-1270 (1994).
  29. Smedsrød, B., Pertoft, H., Eggertsen, G., Sundström, C. Functional and morphological characterization of cultures of Kupffer cells and liver endothelial cells prepared by means of density separation in Percoll, and selective substrate adherence. Cell and Tissue Research. 241 (3), 639-649 (1985).
  30. Despoix, N., et al. Mouse CD146/MCAM is a marker of natural killer cell maturation. European Journal of Immunology. 38 (10), 2855-2864 (2008).
  31. Strauss, O., Phillips, A., Ruggiero, K., Bartlett, A., Dunbar, P. R. Immunofluorescence identifies distinct subsets of endothelial cells in the human liver. Scientific Reports. 7, 44356(2017).
  32. Halpern, K. B., et al. Paired-cell sequencing enables spatial gene expression mapping of liver endothelial cells. Nature Biotechnology. 36 (10), 962-970 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Liver Sinusoidal Endothelial CellsLSEC IsolationCollagenase PerfusionMagnetic Bead SelectionFlow CytometryScanning Electron MicroscopyNonparenchymal Cell PurificationCD146 MarkerStabilin 2 MarkerIntercellular Communication

İlgili makaleler