Bazal Enerji Harcamasının Ve Termojenik Adipositlerin Obez Farelerde Enerji Harcama Kapasitesinin Belirlenmesi

Metabolizma, hücrelerin büyümek ve işlevlerini yerine getirmek için kullandıkları besin alımı, depolama, dönüşüm ve arızadan sorumlu biyokimyasal reaksiyonların entegrasyonu olarak tanımlanabilir. Metabolik reaksiyonlar, besin maddelerinde bulunan enerjiyi, hücreler tarafından yeni molekülleri sentezlemek ve iş yürütmek için kullanılabilecek bir forma dönüştürür. Bu biyokimyasal reaksiyonlar, bu enerjiyi yaşamı sürdürmek için kullanılabilir bir forma dönüştürmede doğası gereği ^verimsizdir1. Bu verimsizlik, ısı şeklinde enerji dağılımına neden olur ve bu ısı üretimi bir organizmanın Standart Metabolizma Hızını (SMR) ölçmek için ^{kullanılır1}. Standart durum klasik olarak uyanık ama dinlenmiş bir yetişkinde meydana gelen ısı üretimi, yiyecekleri yutmuyor veya sindirmiyor, termonötralitede ve herhangi bir stres olmadan ^{olarak tanımlandı1}. Farelerde Bazal Metabolizma Hızı (BMR) veya bazal enerji harcaması SMR olarak adlandırılır, ancak bireylerde hafif termal stres altında yiyecekleri yutarak ve sindirerek (ortam sıcaklıkları 21-22 °C)¹. Isı üretiminin doğrudan ölçülmesinin zorlukları ve zorlukları, BMR'yi belirlemek için en popüler yaklaşım haline gelmek için dolaylı kalorimetre, yani ısı üretimini oksijen tüketim ölçümlerinden hesaplama yaptı. BMR'nin oksijen tüketiminden hesaplanması mümkündür, çünkü BESINLerİN ATP sentezlemek için mitokondri tarafından oksidasyonu, bir organizmada tüketilen toplam oksijenin% 72'sinden sorumludur, toplam oksijen tüketiminin% 8'i mitokondrilerde de meydana gelir, ancak ATP (ayrılmamış solunum) üretmeden ¹. Tüketilen oksijenin kalan %20'sinin çoğunluğu diğer hücre altı yerlerdeki besin oksidasyonuna (peroksisyomal yağ asidi oksidasyonu), anabolik süreçlere ve reaktif oksijen türlerinin ^{oluşumuna bağlanabilir1}. Böylece, 1907'de Lusk, oksijen tüketimini ve _CO2 üretimini ısı olarak enerji dağılımına dönüştürmek için yaygın olarak kullanılan ampirik ölçümlere dayanan bir denklem kurdu. İnsanlarda beyin BMR'nin ~%25'ini, kas-iskelet sisteminin ~%18,4'ünü, karaciğeri ~%20'sini, kalbi ~%10'unu ve yağ dokusunu ~3-7%^2'yi oluşturur. Farelerde, BMR'ye doku katkısı biraz farklıdır, beyin ~ 6.5%, iskelet kası ~ 13%, karaciğer ~ 52%, kalp ~ 3.7% ve yağ dokusu ~ 5% ³ temsil eder.

Dikkat çekici bir şekilde, BMR'yi tanımlayan biyokimyasal reaksiyonlar sabit değildir ve dış çalışma (fiziksel aktivite), gelişim (doku büyümesi), iç stresler (enfeksiyonlara karşı koyma, yaralanmalar, doku devri) ve ortam sıcaklığındaki değişiklikler (soğuk savunma)¹ gibi farklı ihtiyaçlara yanıt olarak değişmez. Bazı organizmalar, soğuk maruziyette ısı üretmek için süreçleri aktif olarak işe alır, metabolizma tarafından üretilen ısının sadece kazara bir yan ürün olmadığını ima eder. Bunun yerine, evrim, metabolik reaksiyonların hızını değiştirerek ısı üretimini özel olarak yükseltir düzenleyici mekanizmaları ^seçti1. Bu nedenle, aynı oksijen tüketimi ölçümleri, bir organizmanın soğuğa yanıt olarak ısı üretme kapasitesini belirlemek için kullanılabilir.

İki büyük proses, soğuğa maruz kalınca ısı üretimine katkıda bulunur. Bunlardan ilki, istemsiz kas kasılması ile yapılan fiziksel işleri kapsayacak şekilde kastaki mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu ve glikolizi artırarak ısı üreten titremedir. Bu nedenle, soğuk maruziyet kaslarda oksijen tüketimini ^{artıracaktır1}. İkincisi, kahverengi ve bej adipositlerde (BA) oksijen tüketiminde bir artış yoluyla ortaya çıkan Titremeyen Termogenezdir. BA'da enerjinin ısıya dağıtılması, protonun mitokondriyal matrise yeniden girmesini sağlayan ve mitokondriyal proton gradyanını düşüren mitokondriyal ayrıştırma proteini 1 (UCP1) ile aracılık eder. Mitokondriyal proton gradyanının UCP1 tarafından dağıtılması, elektron transferi ve oksijen tüketimindeki yükselme ve ATP (ayrılmamış) üretmeden proton dağılımının serbest bırakıldığı enerji ile ısı üretimini arttırır. Ayrıca, termojenik BA, beyhude oksidatif ATP sentezini ve tüketim döngülerini etkinleştirerek proton gradyanında büyük bir dağılmaya neden olmadan oksijen tüketimini yükselten ek mekanizmalar oluşturabilir. Burada açıklanan metabolik kafesler, yani Columbus Instruments'ın CLAMS-Oxymax sistemi, farklı ortam sıcaklıklarında enerji harcamalarını ölçme imkanı sunar. Bununla birlikte, tüm vücut oksijen tüketimi ölçümlerini kullanarak BA termojenik kapasitesini belirlemek için şunları yapmak gerekir: (1) titremenin ve BA dışı diğer metabolik süreçlerin enerji harcamasına katkısını ortadan kaldırmak ve (2) özellikle BA termojenik aktivitesini in vivo olarak etkinleştirmek. Bu nedenle, ikinci bir protokol, termoneutralitede (30 °C) anestezik farelerde farmakoloji kullanılarak BA in vivo'nun seçici olarak nasıl aktive edilmesini, anestezi ve termonötralitenin diğer BA dışı termojenik süreçleri (yani fiziksel aktiviteyi) sınırlamasını açıklar. BA'yı aktive etmek için farmakolojik strateji, fareleri β3-adrenerjik reseptör agonist CL-316,246 ile tedavi etmektir. Bunun nedeni, soğuk maruziyetin, BA'daki β-adrenerjik reseptörleri aktive etmek için norepinefrin salgılayan sempatik bir yanıtı teşvik etmesidir, bu da UCP1 ve yağ oksidasyonunu aktive eder. Ayrıca, β3-adrenerjik reseptör ekspresyoz ifadesi farelerde yağ dokusunda oldukça zenginleştirilmiştir.

Tüm deneyler Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles'taki (UCLA) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Farelere diyetleri ve su ad libitumları metabolik kafeste uygulandı, sıcaklık kontrollü bir ortamda (~ 21-22 veya 30 ° C) 12 saat açık / karanlık bir döngü ile yerleştirildi. Bu çalışma için 8 hafta boyunca yüksek yağlı diyet veya yemek diyeti ile beslenen 8 haftalık dişi fareler kullanılmıştır.

1. Bazal Metabolizma Hızının (BMR) Ölçümü

1. 0,1 g aralığında doğrulukla bir ağırlık ölçeği kullanarak farenin toplam vücut ağırlığını ölçün.
   NOT: Bu, fareleri metabolik kafeslerde barınmadan önce ve metabolik kafeslere alışma süresinin 2-3 gününden sonra yapılmalıdır.
2. Uygun bir vücut kompozisyon analiz sistemi kullanarak anestezi edilmemiş farelerde yağ ve yağsız kütle de dahil olmak üzere vücut kompozisyonunu ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: Bu ölçümler enerji harcamasını belirlemek için gereklidir ve toplam vücut ağırlığı ölçümlerine paralel olarak gerçekleştirilen ölçümlerdir (adım 1.1).
3. Metabolik kafesleri kurun ve alışma dönemine başlayın.
   NOT: Metabolik kafesler sistemi, kullanıcının 12 kafesin muhafaza sıcaklığını ve ışığını kontrol etmesini sağlayan bir muhafaza içerir (Şekil 1A,B). Her kafeste bir su şişesi, bir besleyici ve bir ızgara vardır (Şekil 1C). Izgara fareyi kafesin altından ayırarak dışkı toplanmasına izin verir. Kafes önceden belirlenmiş her alana monte edildikten sonra, kafesi mühürleyen bir kapak su şişesi yuvasını, boru örnekleme havasını, hava akış sistemini ve fiziksel aktivite sensörünü içerir (Şekil 1D).
   1. Teste başlamadan önce sıcaklık muhafazasını, hava akışı sistemini ve bilgisayarı 2 saat açın.
   2. 2 saat sonra, muhafazayı kontrol eden yazılımı açın (bkz. Malzeme Tablosu) ve hava akışı ve yazılımın bilgisayarın ekipmanla iletişimini test etmesine izin verin.
      NOT: Oxymax yazılımı mevcut çalışma için kullanılmıştır.
   3. İletişim kurulduktan sonra Dosya'yı tıklatın, sonra Deneme Yapılandırmasını Aç (Şekil 2A) ve satıcı tarafından önceden tasarlanmış deneme yapılandırmasını seçin (veya önceki bir testten ayarlayın).
   4. Deneme'ye tıklayın, ardından Deneme Özellikleri penceresini açacak özelliklere tıklayın (Şekil 2B).
   5. Özellikler penceresinde, Ortam Sıcaklığı (21 °C) ve 12 saat Işık döngüleri de dahil olmak üzere çevresel muhafazanın parametrelerini ayarlayın.
      NOT: Yazılımı açık ve çalışır durumda tutmak, seçilen sıcaklık ve ışık döngülerini korumak için kafeslere ve muhafazaya hava akmasını sağlar. Böylece, tüm sistem kafeslerin içindeki farelerle birkaç gün boyunca oksijen ve _CO2 ölçmeden bile çalışabilir.
   6. Deneme'ye tıklayın, sonra Kur'a tıklayın ve her metabolik kafesin parametrelerinin tanımlandığı Deneme Kurulumu penceresi açılacaktır.
   7. Her fare kimliği, farenin bulunduğu tek tek kafese atayın (Şekil 2C).
   8. Her fare için yağsız kütleyi veya toplam vücut ağırlığını yalnızca gruplar arasında vücut ağırlığında herhangi bir fark gözlenmezse ekleyin.
      NOT: Oksijen tüketimi ve enerji harcamasının ham değerlerinin elde etmek ANCOVA analizlerini kolaylaştırır.
   9. Hava akış hızını metabolik kafese 0,5-0,6 L/dk olarak ayarlayın.
   10. Deneme Kurulumu penceresinde, dosya kaydetme yolunu ve adını seçin. Yedekleme dizinini seçin (Şekil 2D).
   11. Besleyicilere 1 gün boyunca en az gıda alımını kapsayan önceden ağırlıklı miktarda yiyecek ekleyin.
       NOT: Kafeslerin entegre terazileri varsa, yiyecekler doğrudan eklenebilir ve yazılım bunu kaydeder.
   12. Su şişelerini ekleyin. Şişenin doğru şekilde kapatılmış olup olmadığını ve sızmadığını kontrol edin.
   13. Yiyecekleri ekledikten 24 saat sonra, kafeste kalan yiyecekleri tartın.
       NOT: Eklenen gıda gramı eksi kalan gıda gramı gıda alımını ölçecektir.
   14. Gıda alım değerleri normal kafeslerde bulunan farelerle aynı olduğunda oksijen, _CO2 ve aktivite ölçümlerini (adım 1.4.10) başlatın.
       NOT: Burada alışma süresi (genellikle 2-3 gün) tamamlanır ve enerji harcaması ölçümleri başlayabilir.
4. Enerji harcamasını değerlendirmek için dolaylı kalorimetre ve aktivite ölçümleri
   1. Ölçümlere başlamadan önce tüm farelerin vücut ağırlığını, yağ ve yağsız kütlesini ölçün.
      NOT: Bunlar ANCOVA analizleri yapmak için kullanılan vücut ağırlığı ve yağsız kütle değerleridir.
   2. CLAMS sisteminin _O2 ve _CO2 Zirkonya tabanlı dedektörünü (bkz. Malzeme Tablosu) önerilen oksijen konsantrasyonu ile kalibre edin; yeni bir deneye başlamadan önce dedektörü her zaman yeniden kalibre edin.
   3. Bilinen bileşimli bir kalibrasyon gazı kullanın (%20,50 oksijen ve %0,50 _CO2).
      NOT: Gaz tedarikçileri genellikle bu gazı "Birincil Standart Sınıf" olarak adlandırır.
   4. Açın ve tank çıkış basıncının 5-10 psi'de olduğundan emin olun.
   5. Gaz sensörlerini kalibre etmek ve test etmek için Kalibrasyon Yardımcı Programı yazılımını açın (Şekil 2E). Deney'e tıklayın, sonra kalibre edin.
   6. Başlat'a basın. Ardından, sensörlerin test edilip yazılımın kullanıcıdan O2 kimliğinin değeri 1 (Şekil 2G-H) olana kadar gaz sensörünün düğmelerini (Şekil 2F) çevirmesini istemesini bekleyin. Adım tamamlandığında İleri'yi tıklatın.
      NOT: Kalibrasyon Yardımcı Programı tüm geçerli adımları gerçekleştirirse, ilerleme çubuğu dolduğunda kalibrasyon otomatik olarak bir sonraki adıma geçin.
   7. Tüm adımlar tamamlandığında ve sonuçlar sunulduğunda kalibrasyon sonuçlarını doğrulayın.
   8. Kalibrasyon gazını kapatın.
   9. Yiyecekleri değiştirin ve 48-72 saat boyunca yeterli yiyecek ekleyin.
      NOT: Vücut ağırlığını izlemek ve yiyecekleri günlük olarak değiştirmek için enerji harcaması ölçümleri sırasında kafesler açılabilmesine rağmen, fareler bu manipülasyonlarla strese sokılabilir ve kafesler açıldığında ölçümler kaybedilir. Bu nedenle, ölçüm süresi boyunca herhangi bir manipülasyondan kaçınmanız önerilir.
   10. Yazılımda, oksijen, _CO2 ve aktivite ölçümlerini başlatmak için Deney ve Ardından Çalıştır'a tıklayın (Şekil 3A).
       NOT: Ölçümlerin yürütülmesi, yazılımın sol alt bölümünde bulunan bir kutuda gerçek zamanlı olarak izlenebilir (kırmızı dikdörtgen, Şekil 3B). Şekil 3B'deki kırmızı dikdörtgen, sistemin #3 aralığında 1 numaralı kafesi, yani üçüncü ölçümü ölçtüğünü gösterir. Bir kafeste bir ölçüm yaklaşık 1 dakika sürebilir. Böylece, bağlı 12 kafes ile oksijen tüketimi yaklaşık her 12 dakikada bir ölçülebilir. En az 48 saat boyunca sürekli ölçüm yapılması önerilir.
   11. Deney'i ve ardından Durdur'a tıklayarak denemeyi durdurun (Şekil 3C).
   12. Kafesleri açın, fareleri ve yiyecekleri tartın. 48-72 saat ölçüm süresi boyunca atılan kalori ve lipit sayısını hesaplamak için dışkıyı toplayın.
       NOT: Dışkı daha sonraki analizler için -20 °C'de saklanabilir. Bu kafesler idrar toplamak için etkili bir şekilde kullanılamaz.
   13. Denemeler'e tıklayın, sonra Dışa Aktar ve Tüm konuları CSV dosyası olarak dışa aktar (Şekil 3D).
       NOT: ANCOVA analizlerini kolaylaştırmak için, ham Oksijen tüketimi (_VO2) ve _CO2 üretim (VCO2) değerlerinin vücut ağırlığı tarafından normalleştirilmeden ihraç edilmesi esastır.
5. Veri analizi ve kalite kontrolü
   1. Dışa aktarılan CSV sayfasında (Şekil 3D) (adım 1.4.13'ten itibaren), yazılım tarafından otomatik olarak listelenen ve ölçüldüğü saat ve tarih olan bir zaman damgası içeren 2-3 günlük dönemde her 12 dakikada bir ölçülen oksijen tüketiminin (_{VO2) ve CO2 üretiminin} (VCO2) ham değerlerini kullanın.
      NOT: Vücut ağırlığı veya yağsız kütle değerleri eklenirse _{VO2 ve} VCO2 değerleri otomatik olarak düzeltilir.
   2. Dışa aktarılan CSV sayfasında, yazılım tarafından zaman damgalarına göre otomatik olarak hesaplanan ve listelenen solunum değişim oranının (RER: _VCO2/_VO2) ham değerlerini kullanın.
      NOT: 1'e yakın değerler, farenin öncelikle karbonhidratları oksitlediğini gösterirken, 0,7'ye yakın değerler farenin esas olarak yağ oksitleyici olduğunu temsil eder. 1'in üzerindeki RER, anaerobik egzersiz sırasında ortaya çıkabilir, çünkü vücut laktatın neden olduğu asidozu telafi etmek için daha fazla _CO2 salgılar. 1'den yüksek RER stresi gösterebilir. Dışa aktarılan CSV dosyası ayrıca, 2-3 günde her 12 dakikada bir ölçülen, fare başına dakika başına kalori olarak Enerji harcaması (EE) veya Isı üretiminden elde edilen ham değerleri içerir. Burada, listelenen tüm değerler bir zaman damgası içerir.
   3. Ancova için fare başına tek EE değerleri gerektiğinden, ışık (gündüz) fazı için 09:00-16:00 ve fare başına karanlık (gece) fazı için 19:00-04:00 arasında kaydedilen EE değerlerinin ortalamasını elde edin.
      NOT: Bu, Excel veya Graph Pad kullanılarak manuel olarak yapılabilir. Bu iki zamanlı pencerelerin seçilmesi, açık-koyu faz geçişiyle ilişkili ara, kademeli ve kararsız EE değerlerinin ortalamasını almaktan kaçınır.
   4. 48 saat boyunca, Excel veya Graph Pad kullanarak fare başına iki gün ışığı değerinin ve iki koyu faz değerinin ortalamasını hesaplayın.
   5. Toplam fiziksel aktiviteyi ölçmek için, metabolik kafeslerde ölçülen ve her fare için CSV dosyasında listelenen x, y ve z ışın kesme sayılarını toplamak için Excel veya Grafik Defteri'ni kullanın.
      NOT: x,y,z toplam etkinliği, önce fare ve döngü başına her X, Y, Z'nin ortalama değerini yaparak hesaplanır. Daha sonra, fare ve döngü başına her ortalama X, Y, Z değerlerinin toplamı, Şekil 5E'deki gibi (2 günlük ortalama olmak üzere) verileri çizmek için belirlenir.
   6. Alternatif olarak, ışıktan karanlık döngülere geçiş sırasında EE'deki değişiklikleri gösteren eğriler oluşturan zaman içinde her ölçüm değerini gösteren verileri temsil edin.
      NOT: Ancova analizlerinin nasıl ve ne zaman gerçekleştirilmesiyle ilgili tartışma bölümüne bakın ve _VO2, _VCO2 ve EE'yi hesaplamak için kullanılan farklı formüller Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.

2. Termojenik adipositlerin enerji harcama kapasitesinin ölçülen

1. Ölçümleri ve fare tedavilerini ayarlayın. Adipositlerdeki termojenik kapasite 2.1.1-2.2.2 adımlarını izleyerek dolaylı olarak oksijen tüketimi ile belirlendiği için oksijen tüketimini izlemek için deneysel preparatlar hakkında ayrıntılar için 1.
   NOT: Bu protokol, BETA termojenik kapasitesinin hızlı bir değerlendirmesini veren beta-3 reseptör agonisti CL-316.243 ile fare anestezisi ve akut tedavi gerektirir (bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Vücut kompozisyon analizi yapın ve fareleri tartın. İSTIRIDYE'yi açın, sıcaklığı 30 °C'ye (termonöratralite) ayarlayın ve tüm sistemin ısınması için 2 saat bekleyin.
   2. Işık da dahil olmak üzere test koşullarının geri kalanını ayarlayın, her kafese fare kimliği atayın ve gruplar arasında vücut ağırlığında bir fark görülmezse, ilgili kafese her farenin vücut ağırlığı değerini ekleyin.
   3. Oksijen/_CO2 dedektörünü 1.4.2-1.4.7 adımlarında olduğu gibi kalibre edin.
   4. Deney'i yazılımda başlatın.
   5. Her fareye pentobarbital (60-120 mg/kg) enjekte edin ve her fareyi atanmış metabolik kafesine yerleştirin (adım 2.1.2).
      NOT: Termoneutralitede (30 °C) uyuyan fareleri tutmak için gereken pentobarbital dozu fare zorlanması ve genotip ile değişir. 50 ila 120 mg / kg arasında farklı pentobarbital dozların test etmesi önerilir ve fareyi 30 ° C'de 2-3 saat boyunca uyuşturan olanı seçti. Fiziksel aktivitenin enerji harcamasına katkısını kaldırmak için verimli anestezi şarttır.
   6. Anesteziyi sağlamak için, pentobarbital enjeksiyondan sonra fareleri tamamen uyuyana ve azalan oksijen tüketim oranları sabit hale gelene kadar gözlemleyin.
   7. CL-316,243 enjekte etmeden önce en az 3 kararlı ardışık oksijen tüketim oranı elde etmeyi bekleyin.
      NOT: Oksijen tüketiminin dengelenmesini beklerken, şırıngları her fare için CL-316.243 (1 mg/kg) ile hazırlayın.
   8. Kafes #1'i açın ve 1 numaralı kafeste bir _{VO2 ve VCO2} ölçümü gerçekleştikten hemen sonra CL-316.243'ü deri altı olarak enjekte edin. Fareyi enjeksiyondan hemen sonra #1 kafesine geri döndürün.
      NOT: Ölçümler yazılımın sol alt bölümünde gerçek zamanlı olarak belirtilmektedir (Şekil 3B, kırmızı dikdörtgen).
   9. Kafes #2'nin ölçülmesini bekleyin (Şekil 3B, kırmızı dikdörtgen) ve ardından #2 kafesi için 2.1.8 adımında olduğu gibi devam edin.
      NOT: Bir ölçümden hemen sonra CL-316,243 enjekte etmek, enjeksiyonlar arasındaki zaman sabitini korumayı sağlar. Örneğin, tek tek kafeslerde ardışık olarak toplanan ölçümler ve kafes başına 55 s süren koleksiyon ile çalışan 12 fare / kafes varsa, her dakika bir fare enjekte etmelisiniz. Bu enjeksiyon oranları ile ilk ölçüm 12 kafeste enjeksiyondan 12 dakika sonra gerçekleşecektir.
   10. Enerji harcama değerleri platoya kadar, genellikle enjeksiyondan sonra 90-180 dk olmak üzere 5-6 ardışık ölçüm için enerji harcaması ölçümlerine devam edin.
       NOT: Fareler deneyler sırasında anesteziden uyanabilir. Bu farelerin analizden çıkarılması gerekir. Bu nedenle, pentobarbital dozların önceden test edilmesi çalışmaların verimliliğini artıracaktır.
   11. Enerji harcaması ölçümlerini durdurun, ancak fareleri uyanana kadar kafeslerinde 30 ° C'de tutun.
   12. Fareler tamamen uyanık olduktan sonra, farelerin sağlığını inceleyin ve ilk kafeslerine geri döndürün.
   13. Bölüm 1.4.13'te açıklandığı gibi, ekipman yazılımını kullanarak her farenin verilerini CSV dosyası olarak dışa aktarın.
2. Veri analizi
   NOT: Veri analizi Excel veya Graphpad tarafından gerçekleştirildi
   1. Fareler tamamen uyuşturulduğu zaman metabolizma hızını temsil eden değerler olduğu için, zaman içinde istikrarlı ve sabit olan 3-5 ardışık _VO2, _VCO2 ve EE değerlerini çizin.
   2. Ardından, enjeksiyondan sonra elde edilen ilk ve aşağıdaki ardışık _VO2, _VCO2 ve EE ölçümlerini çizin.
      NOT: EE'nin mutlak değerleri ve enjeksiyonla indüklenen EE'deki kat artışı BA termojenik fonksiyonunu ^gösterir7.

Şekil 4'te CLAMS sisteminin metabolik kafesleri kullanılarak elde edilen VO2, VCO2, Isı üretimi/Enerji harcaması (EE), Solunum Değişim Oranı (RER) ve X, Y, Z fiziksel aktivite değerleri gösterilmiştir. CLAMS sistemi tarafından sağlanan VO2 ve VCO2, dakikadaki gaz hacmidir (mL) ve ölçümlere başlamadan önce CLAMS yazılımına bu ağırlık değerleri girilerek vücut ağırlığına veya yağsız kütle değerlerine bölünebilir. Bununla birlikte, ANCOVA analizine ihtiyaç duyulduğu ve Oxymax yazılımı bu hesaplamaları yapamadığından, fare grupları arasında vücut ağırlığında farklılıklar gözlenirse vücut ağırlığı değerleri girilmemelidir. Enerji harcaması (ısı) Lusk denklemi kullanılarak kcal/h olarak hesaplanır. Fareler gecedir ve gece / karanlık dönemde daha fazla enerji harcarlar, bu da enerji harcama hesaplamalarının ışık döngüsüne göre ayrılması gerektiği anlamına gelir. Beklendiği gibi, karanlık faz sırasında fareler Şekil 4C'de gösterildiği gibi daha yüksek O2 tüketimine, CO2 üretimine ve dolayısıyla daha yüksek EE'ye sahiptir. Düzenli bir diyette ve fed durumundaki fareler, karanlık döngüde meydana gelen gıda yutulması ile, karbonhidrat kullanma tercihi anlamına gelen 1'e (Şekil 4D) yakın RER değerleri ile karakterize edilir. Işık döngüsü sırasında, fareler çoğunlukla uyuduğunda ve bu nedenle hızlı olduğunda, RER değerlerinin 0,7'ye daha yakın olmasıyla yağ oksidasyonuna bir kayma vardır. Buna göre x,y,z lazer ışını kırılma sayısı olarak ölçülen fiziksel aktivite karanlık fazda artar ve ışık fazı sırasında azalır (Şekil 4E).

16 haftalık dişi farelerin yüksek yağlı bir diyetle (8 hafta) chow ile beslenen farelerle karşılaştırdık, bu da fare grupları arasındaki enerji harcamasının vücut ağırlığındaki farklılıklarla karşılaştırılmasına izin verdi. Beklendiği gibi, yüksek yağlı diyet beslenmesi yağsız kütleyi değiştirmeden yağ kütlesini arttırır (Şekil 5A-C). Yüksek yağlı diyetle beslenen fareler, esas olarak gram gıda başına daha yüksek kalori yoğunluğu nedeniyle daha fazla Kcal / gün yedi (Şekil 5D). Ek olarak, fiziksel aktivite, karanlık dönemde bile yemek ve yüksek yağlı diyetle beslenen fareler arasında benzerdi (Şekil 5E). RER'in düşük değerleri, yüksek yağ alımı ve kas insülin direnci ile beklendiği gibi, yüksek yağlı diyetle beslenen farelerin oksidasyon için birincil substrat olarak yağ kullanma tercihini göstermektedir (Şekil 5F). Yüksek yağlı diyetle beslenen farelerde oksijen tüketimi artar, ancak CO2 üretimi artmaz (Şekil 5G-H). Yüksek yağlı diyetle beslenen farelerde oksijen tüketimindeki artışa fare başına ısı üretimi/enerji harcamasında önemli bir artış eşlik ediyor (Şekil 5I). Bununla birlikte, enerji harcamasının her farenin yağsız kütlesine bölünmesi enerji harcamasında hiçbir farka yol açmıştır (Şekil 5J), toplam vücut ağırlığına bölünmesi ise yüksek yağlı diyetle beslenen farelerde enerji harcamasında bir azalma göstermiştir (Şekil 5K). Kümülatif olarak, bu sonuçlar enerji harcama verilerinin yağsız kütleye veya toplam vücut ağırlığına bölünmesinin, yüksek yağlı diyet beslenmesinin enerji harcaması üzerindeki etkileri üzerinde zıt sonuçlara yol açabileceğini göstermektedir. Birden fazla çalışmada önerildikçe, kovaryans analizi (ANCOVA), enerji harcamalarındaki farklılıkların vücut ağırlığındaki değişikliklerden bağımsız olarak var olup olmadığını belirlemeye izin verir. Bu noktayı göstermek için, Şekil 5A-K'de gösterilen aynı veriler kullanılarak bir ANCOVA analizi yapıldı ve enerji harcaması bağımlı değişken ve vücut ağırlığı veya kovariatlar gibi yağsız kütledir. Ancova'yı toplam vücut ağırlığını bir kovarya olarak kullanarak gerçekleştirirken, sadece yüksek yağlı diyetle beslenen farelerin daha yüksek enerji harcamasına sahip olması için bir eğilim göstermektedir (Şekil 5L), yüksek yağlı diyetle beslenen fareler yağsız kütle kullanıldığında enerji harcamasında önemli bir artış göstermektedir (Şekil 5M). Bu veriler, ANCOVA analizleri yapmak için toplam vücut ağırlığını kullanmanın enerji harcamasını hafife alabileceğini göstermektedir4. Bunun nedenleri şu olabilir: (1) yağ dokusu toplam enerji harcamasının sadece ~ % 5'ine katkıda bulunur ve (2) yüksek yağlı diyet beslenmesinin neden olduğu yağ kütlesinin kazanılması, oksidatif termojenik adipositlerin sayısındaki artıştan ziyade, esas olarak adipositlerdeki trigliserit içeriğinin genişlemesinden kaynaklanır.

Kahverengi ve bej adipositler (BA) termogenez ve dolayısıyla kemirgenlerde enerji harcamasına katkıda bulunur. Birden fazla doku oksijen tükettiğinden, BA'nın enerji harcamasına katkısı sadece tüm vücut oksijen tüketimini ölçerek ve BMR hesaplanarak belirlenemez. BA termojenik kapasite in vivo belirlemek için yaklaşım, tüm dokularda oksijen tüketimini sınırlamak için gerekli olan anesteziyi içerir. Daha sonra anestezi, çoğunlukla termojenik BA'da termogenezi aktive etmek için farmakolojik bir yaklaşımla birleştirilir. Beta-3 adrenerjik reseptörler öncelikle yağ dokusunda ifade edildiği için, BA termojenik fonksiyonunu aktive etmek için beta-3 adrenerjik agonist CL-316.243 kullanılabilir. Ek olarak, uyuşturulmuş fareler, ortam termal stresinin neden olduğu kontrolsüz sempatik BA aktivasyonunu önlemek için 30 ° C'de sıcaklık kontrollü bir muhafazaya yerlenebilir. Şekil 6, farelerin pentobarbital ile uyuşturuldu ve enerji harcamasını standart altı metabolik hızda kaydetmek için 30 °C'de metabolik kafeslere yerleştirilen yüksek yağlı bir diyetle beslendiğini göstermektedir (Şekil 6A-C,D). Bu ölçümü, BA aktivasyonundan beklendiği gibi oksijen tüketimini, CO2 üretimini ve enerji harcamalarını artıran CL-316.243 enjeksiyonu izledi (Şekil 6A-C). Beta-3 agonist tedavi sonrasında enerji harcamalarında 2-3 kat artış tespit edilebilir7.

Şekil 1: Çevresel muhafazaya sahip metabolik kafesler ve bireysel metabolik kafeslerin montajı. (A) Çevresel muhafazadaki metabolik kafesler. (B) Muhafaza 12 metabolik kafes barındırabilir ve sıcaklık ve ışığı kontrol etmeyi sağlar. (C) Montajdan önce metabolik kafeslerin bileşenleri. (D) Metabolik kafesler kapakla kapatılmış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Oksijen sensörünün deneysel kurulumu ve kalibrasyonu. (A) Metabolik kafesleri kontrol eden Oxymax yazılımının ekran görüntüsü, (B) deneysel özelliklerini, yani ortam ışığını ve sıcaklığı ayarlamak için bir "Deneysel yapılandırma" penceresinin seçimini ve açılışını gösterir. Ardından, Deneme, her kafese bir fare kimliği, gövde ağırlığı veya yağsız kütle ve 12 kafes için hava akışı hızı atamak için (C) "Deneysel Kurulum" penceresi kullanılarak yapılandırılır. (D) Aynı "Deneysel Kurulum" penceresinde, dosya kaydetme yolu seçilebilir. (E) Gaz sensörünü kalibre etmek için, kullanıcının (G-H) O2 kimliğini 1 olarak ayarlamak için (F) gaz dedektöründeki düğmeyi çevirmesi gerekir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Ölçümlerin başlatılması ve durdurulması. (A) Deneme, "Deney", ardından "Çalıştır" üzerine tıklayarak başlatılır. (B) Kullanıcılar, 12 kafesin hangilerinin şu anda ölçüldüğünü (kırmızı dikdörtgen) ve zaten toplanmış ölçümleri içeren bir tabloyu gerçek zamanlı olarak görebilir. (C) Deney, "Deney"e ve ardından "Durdur"a tıklayarak durdurulabilir. (D) Veriler, "Dosya", ardından "Dışarı Aktar" ve ardından "Tüm Konuları CSV Dışa Aktar" tıklatılarak Excel'e aktarılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Metabolik parametreler elde edilir. (A) Oksijen tüketimi. (B) CO2 üretimi. (C) Enerji Harcaması (EE) yağsız kütleye normalleştirildi. (D) Solunum değişim oranı (RER). (E) Fiziksel Aktivite düzeyleri X, Y, Z lazer ışını kırılma sayılarının toplamı olarak hesaplanır. Veriler SEM. Öğrenci t-testi ± anlamına gelir, **P < 0.01, ***P < 0.001. n = Grup başına 7-8 dişi fare. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: ANCOVA analizi, obez farelerde enerji harcamasındaki değişikliklerin uygun şekilde yorumlanmasını sağlar. (A-M) 8 hafta boyunca bir yemek veya yüksek yağlı diyet (HFD) ile beslenen dişi farelerde ölçümler. (A) Vücut ağırlığı. (B) Yağ kütlesi. (C) Yağsız kütle. (D) Gıda alımı. Öğrenci t-testi, ***P < 0.001. (E) X, Y, Z. (F) Solunum katsayısı oranı (RER) lazer ışını kırılma sayıları olarak metabolik kafeslerle fiziksel aktivite değerlendirildi. (G) Oksijen tüketimi (VO2). (H) CO2 üretimi (VCO2). (I) Enerji harcaması (EE) dolaylı kalorimetre ile ölçüldü. Enerji harcaması (J) Yağsız kütle ve (K) vücut ağırlığı olarak normalleştirildi. *P < 0.05'te Two-ANOVA kullanarak. **P< 0,01, ***P< 0,001. (L) Enerji harcamasının (EE) gece toplam vücut ağırlığına veya (M) yağsız kütleye göre kovariat analizi (ANCOVA). Kesikli çizgiler, her grupta VO2 ve EE'yi belirlemek için modellenen ortalama gövde ağırlığı değerlerini temsil eder. *P < ANCOVA kullanarak 0.05. n = Grup başına 7-8 dişi fare. Veriler ortalama SEM ± gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Seçici β3-agonist, CL-316,243 termonötralitede uyuşturulmuş farelerde enerji harcamasını akut olarak arttırır. Dişi fareler pentobarbital (60 mg/kg) ile uyuşturuldu ve 30 °C'de belirlenen metabolik kafeslere yerleştirildi. Anestezi altında yapılan enerji harcaması, ardışık 3 ölçümde aynı değerlerin gösterilmesine kadar kaydedildi ve bu da tam anesteziyi yansıttı. #1 kafesteki fareye oksijen tüketimi ölçümünden hemen sonra CL-316.243 (1 mg/kg) enjekte edildi. Diğer kafeslerde de aynı enjeksiyon yaklaşımı, enjeksiyon ile tüm farelerde ilk ölçüm arasında aynı sürenin geçmesini sağlamak için kullanılmıştır. (A) Oksijen tüketimi. (B) CO2 üretimi. (C) Enerji harcaması. n = 4 dişi fare. Veriler SEM ± gösterir . Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Oxymax yazılımı tarafından CLAMS sisteminde oksijen tüketimini, CO2 üretimini ve enerji harcamasını hesaplamak için kullanılan formüller.

Yazarlar bu protokol makalesine çıkar çatışması olmadığını beyanda bulunsunlar. M.L., Enspire Bio LLC'nin kurucu ortağı ve danışmanıdır.