Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Civciv Embriyolarında İnsan Kök Hücre Sferoidlerinin Davranışının İncelenmesi İçin Etiketsiz Bir Ksenogreft Modeli

1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63067

⸱

15 Ekim 2021

 , 
1Morphological Sciences Program, Biomedical Sciences Institute, Federal University of Rio de Janeiro, 2Department of Life Science and Technology, Tokyo Institute of Technology

Bu makalede

Özet

Burada, insan hücresi sferoidlerini civciv embriyolarına nakletmek ve tanımlamak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu ksenogreft modeli, hücre göçünü, farklılaşmasını ve tropizmi analiz etmek için öğretici sinyallerin kaynağı olarak embriyonik mikro çevreyi kullanır ve özellikle birincil ve/veya heterojen hücre popülasyonlarının incelenmesi için uygundur.

Özet

Ksenogreftler, insan hücrelerinin davranışını in vivo olarak araştırmak için değerli yöntemlerdir. Özellikle, embriyonik ortam, yetişkin ksenogreft modellerinde genellikle bulunmayan benzersiz öğretici sinyaller ve germ tabakası kimliği ile hücre göçü, farklılaşması ve morfogenezi için ipuçları sağlar. Ek olarak, embriyonik modeller öz ve öz olmayan dokuları ayırt edemez, bu da greftin reddedilme riskini ve konağın bağışıklık baskılanması ihtiyacını ortadan kaldırır. Bu makale, insan hücrelerinin sferoidlerinin erişilebilir, manipülasyona uygun ve 37 ° C'de gelişen tavuk embriyolarına nakli için bir metodoloji sunmaktadır.

Sferoidler, transplantasyon için embriyonun belirli bir bölgesinin seçilmesine izin verir. Greftlendikten sonra, hücreler konak dokuya entegre olur ve göçlerinin, büyümelerinin ve farklılaşmalarının takibine izin verir. Bu model, heterojen birincil hücre popülasyonları ve kanser hücreleri dahil olmak üzere farklı yapışık popülasyonların kullanımına izin verecek kadar esnektir. Önceden hücre etiketleme ihtiyacını ortadan kaldırmak için, insana özgü Alu problarının hibridizasyonu yoluyla donör hücrelerin tanımlanması için bir protokol de açıklanmaktadır, bu da heterojen hücre popülasyonlarını araştırırken özellikle önemlidir. Ayrıca, DNA probları diğer donör türleri tanımlamak için kolayca uyarlanabilir. Bu protokol, sferoidlerin hazırlanması, tavuk embriyolarına aşılanması, parafin kesiti için dokunun sabitlenmesi ve işlenmesi ve son olarak DNA in situ hibridizasyon kullanılarak insan hücrelerinin tanımlanması için genel yöntemleri açıklayacaktır. Bu yöntemin sınırlamalarına ek olarak, önerilen kontroller, sonuçların yorumlanması örnekleri ve test edilebilecek çeşitli hücre davranışları tartışılacaktır.

Giriş

Ksenogreftler, insan hücrelerinin davranışını in vivo olarak araştırmak için yararlı araçlardır. Bu modeller, insan kök hücrelerininbiyolojisi 1, hücresel olayların gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesi2 ve tümöral anjiyogenez ve metastaz3'ün araştırılması gibi çok çeşitli bilimsel konular için paha biçilmez bilgiler sağlamıştır. Ek olarak, hastaya özgü ksenogreftlerin tümörijenezi de dahil olmak üzere kanser biyolojisinin çeşitli yönleri incelenmiştir 4,5. Bu ksenogreft modellerinin her birinin avantajları ve dezavantajları vardır ve bu nedenle her biri belirli bilimsel sorular için daha uygundur. Civciv embriyoları, cerrahi manipülasyona uygun, erişilebilir bir amniyot modeli oldukları için popüler bir gelişimsel biyoloji modelidir. Heterolog greftler, araştırmacıların kesin kader haritalarıoluşturmasına 6 veya bir özelliğin hücre özerk olup olmadığını veya çevre tarafından talimat verilip verilmediğinikeşfetmesine izin vermiştir 7,8. Benzer bir mantık, civciv embriyosunun insan hücrelerinin davranışını incelemek için bir ksenogreft modeli olarak kullanılmasına izin verir.

Embriyonik ortam, hücre-hücre etkileşimlerinin yanı sıra göç ve farklılaşma sinyalleri ile doku morfogenezini aktif olarak düzenler. Bu nedenle, yetişkin ksenogreft modelleriyle karşılaştırıldığında, embriyo, örneğin yetişkin kök hücre nişlerinde bulunan sinyalleri taklit ederek (örneğin, BMP'ler, WNT'ler, NOTCH ve SHH9) aşılanmış hücrelerin davranışını analiz etmek için daha öğretici bir ortam sağlar. Ek olarak, erken gelişim sırasında adaptif bir bağışıklık sisteminin olmaması, ksenogreftlerin bir bağışıklık tepkisi veya donör dokunun reddi riski olmadan gerçekleştirilmesine izin verir10. Önceki çalışmalar, bu amaçla insan hücrelerinin ksenogreftlerini tavuk embriyolarına araştırmıştır. İnsan kök hücrelerinin nörojenik potansiyeli, embriyonik kök hücrelerin12 ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin 13 embriyoya entegrasyonuna ek olarak, nöral tüpe veya kan damarlarına11 enjeksiyondan sonra test edilmiştir. İnsan melanom hücreleri de civcivin embriyonik ortamı kullanılarak incelenmiştir, bu da tümör oluşumu ile nöral krest hücrelerinin14 davranışı arasındaki bağlantıları ve ayrıca tümör hücrelerinin embriyodan15 gelen bilgilerle yeniden programlanmasını ortaya çıkarmıştır. Bu makale, özellikle insan birincil ve heterojen hücre popülasyonlarının davranışlarını incelemek için uygun olan bir protokolü açıklamaktadır.

Son yıllarda, çeşitli dokuların stromal bileşeni, otolog bir progenitör/kök hücre kaynağı olarak ve daha önce "mezenkimal kök hücreler" olarak bilinen proanjiyojenik ve immün düzenleyici özellikleri açısından incelenmiştir16,17,18. Bu hücre popülasyonlarından karakterize edilen ilk şey, osteo-, adipo- ve daha az ölçüde kondrojenik potansiyele sahip olan kemik iliği stromal/kök hücre popülasyonu (BMSC'ler) idi in vivo19,20. Adipoz kaynaklı stromal hücreler (ADSC'ler), lipoaspirat veya dermolipektomi örneklerinin enzimatik sindirimi, ardından stromal-vasküler fraksiyonun (SVF) izolasyonu ve son olarak kültürde genişleme ile elde edilen heterojen bir popülasyondur21. Kültürde, bu hücreler fenotipik olarak CD90, CD73, CD105 ve CD44 gibi diğer mezenkimal popülasyonlarla paylaşılan belirteçler, CD36 gibi benzersiz belirteçler ve hematopoietik (CD45) veya endotelyal (CD31) belirteçlerin yokluğu ile karakterize edilir22. Ek olarak, ADSC'ler in vitro osteo-, adipo- ve kondrojenik potansiyele sahiptir ve bu popülasyondaki kök / progenitör hücrelerin sayısı fibroblastoid koloni oluşturan birim (CFU-F) testi22 ile tanımlanabilir. İn vivo, ADSC fenotipine sahip hücrelerin stromal23 ve/veya perivasküler24 bölmede bulunduğu bildirilmiştir. İn vitro kültürden sonra belirteçlerin paylaşılmasına rağmen, farklı dokuların stromal kompartmanının belirli bir organın içsel özelliklerini yansıttığı ve bu hücre popülasyonlarının kaynaklarına bağlı olarak farklı özelliklere sahip olduğu giderek daha açık hale gelmektedir 17,25,26,27. Ayrıca, bu hücreler bir hücre kültürü kabına yapışmalarına bağlı olarak izole edildiğinden, çeşitli germ katmanlarındanhücrelerden oluşabilirler 28. Bu nedenle, stromal hücrelerin farklılaşma potansiyelini ve tropizmini tarafsız bir şekilde incelemek için bir ksenogreft yöntemi kullanmak, gelecekteki hücre tedavilerinin geliştirilmesine rehberlik etmek için bu hücre popülasyonları hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.

Burada açıklanan protokol (Şekil 1), civciv embriyolarının düşük maliyetinden ve manipülasyon kolaylığından yararlanan bir ksenogreft yöntemidir. Daha önce insan ADSC29, cilt fibroblastları29, adet kanından türetilmiş stromal hücreler30 ve glioblastoma hücreleri31'in davranışını incelemek için kullanılmıştır. Bu yöntem, hücrelerin herhangi bir yapışık hücre popülasyonundan hazırlanabilen sferoidler32 olarak transplantasyonunu içerecektir (Şekil 2). Cerrahi prosedürler ve özel cerrahi materyallerin hazırlanması - mikro neşterler ve cam kılcal damarlar - da açıklanacaktır (Şekil 3). İnsan hücreleri, insana özgü Alu problarının hibritleştirilmesiyle histolojik kesitlerde tespit edilir (Şekil 4), böylece aşılanmış hücrelerin önceden etiketlenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır. Temsili sonuçlar, hem kanat tomurcuğu seviyesindeki somitik bölgede (Şekil 5, Şekil 6 ve Şekil 7) hem de ilk faringeal arkta (Şekil 8) aşılanan insan ADSC'sinin davranışını ve ayrıca prosensefalonda aşılanan insan primer glioblastoma sferoidlerini tanımlar (Şekil 8). Hücre göçü, farklılaşması ve civciv embriyonik dokuları ile etkileşimin yanı sıra, bitişik bölümlerin birlikte boyanması veya boyanması kullanılarak hücre davranışını daha fazla araştırmak için önerilen tahliller açıklanacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm in vivo prosedürler, Brezilya deneysel hayvan kullanım yönergelerine (L11794) uygun olarak, hayvan testleri ve araştırmaları için ilgili tüm deneysel yönergelere uygundur. Tavuk embriyolarını işlemek için kullanılan protokollerin tümü, Bilimsel Deneylerde Hayvanların Kullanımı Etik Komitesi (Rio de Janeiro Federal Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi) tarafından onaylandı. İnsan hücrelerinin kullanımı, Clementino Fraga Filho Üniversite Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (numaralar 043/09 ve 088/04). White Leghorn tavuğunun (Gallus gallus) spesifik patojen içermeyen (SPF) yumurtaları kullanıldı.

1. Hücre sferoidlerinin hazırlanması

NOT: Hücre sferoidleri, yapışık oldukları sürece çok çeşitli hücre tipleri ile hazırlanabilir. Bu protokol için, insan adipoz kaynaklı stromal hücreler (ADSC'ler) daha önce tarif edildiği gibiizole edildi 21,27 kullanılacaktır (Şekil 2A). Hücreler, yağ dokusu fragmanlarının veya lipoaspiratların kollajenaz IA ile 37 ° C'de 1 saat çalkalama altında sindirilmesi, ardından 1-2 × 104 hücre/cm2'de kaplama ve gece boyunca inkübasyon ile elde edildi. Yapışık olmayan hücreler atıldı ve yapışık hücreler 3-6 pasaj için genişletildi. ADSC'ler, CD105, CD90, CD13 ve CD44 yüzey antijenlerinin ekspresyonu için homojen ve hematopoetik antijenler CD45, CD14, CD34, CD3 ve CD19 için negatifti27. Burada tarif edilen yöntem, hücre kültürü için rutin olarak kullanılanın ötesinde minimal materyallerle kolayca gerçekleştirilebilirken, optimal agregasyon süresi ve kısmi ayrışma ihtiyacı ampirik olarak belirlenmelidir. Hücre sferoidlerinin hazırlanması için asılı bırakma yöntemi33 veya agaroz kaplı kuyucuklar34 gibi alternatif yöntemler kullanılabilir; Daha fazla ayrıntı için tartışmaya bakın. Tüm prosedürler aseptik teknikler kullanılarak temiz bir tezgah üzerinde gerçekleştirilmelidir.

  1. Hücre manipülasyonundan önce steril PBS (fosfat tamponlu salin), kültür ortamı ve tripsin çözeltisini 37 ° C'ye ısıtın.
  2. % 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş düşük glikozlu DMEM'de kültür ADSC'leri. İki sferoid plakasının hazırlanması için 25cm'lik 2 bir ADSC şişesi kullanın. Kültür ortamını atın ve kültür kabını uygun miktarda steril PBS ile üç kez yıkayın (25cm2 hücre kültürü şişesi kullanılıyorsa her yıkama için 5 mL PBS).
  3. Hücreleri kaplayacak kadar tripsin çözeltisi (0.78 mM EDTA içeren) ekleyin (25cm2 hücre kültürü şişesi kullanılıyorsa 1 mL tripsin çözeltisi) ve kültür şişesini oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.
  4. Hücreleri ayırmak için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Tripsini inaktive etmek için FBS içeren aynı miktarda kültür ortamı ekleyin ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
  5. 180 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, ve peleti gevşetmek için tüpe hafifçe vurun.
  6. Hücreleri, hücre tipi için yeterli olan 500 μL-2 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin (bkz. adım 1.2).
    NOT: ADSC'ler × fibroblastlar gibi yapışık hücreler için minimum konsantrasyon 5 ila 105 hücre / mL'dir. Birleştirilmiş 25cm'lik 2 ADSC şişesi 2 mL ortamda yeniden süspanse edilmeli ve her biri 1 mL kullanılarak 2 Petri kabına kaplanmalıdır. Glia gibi daha az yapışan hücreler, daha düşük bir hacimde ~ 2 × 106 hücre / mL'de kaplamadan yararlanabilir.
  7. Hücre süspansiyonunu steril 60 mm'lik bir Petri kabının (agar plakalarını hazırlamak için kullanılanlar gibi kaplanmamış ve işlenmemiş) bir tarafına dikkatlice aktarın. Çanağı inkübatörde eğik tutmak için katlanmış, temiz bir gazlı bez parçasının üzerine yerleştirerek kültür ortamını mümkün olan en küçük alanla sınırlamaya çalışın (Şekil 1B).
  8. Hücre süspansiyonunu 37 ° C'de,% 5 CO2'de, hücre agregaları oluşana kadar (ADSC'lerin kaplanmasından 6-8 saat sonra) inkübe edin.
    NOT: Sferoid agregasyon süresi hücre tipine göre değişebilir.
  9. Gerekirse (tartışmaya bakın), 1000 μL'lik uçlar kullanarak hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek büyük hücre agregalarını kısmen ayırın. Kaplamadan 6-8 saat sonra ADSC sferoidlerini ayırın.
  10. Sferoidler nakledilmeye hazır olana kadar plakayı inkübatöre yerleştirin: yuvarlak, kenarları belirgin ve kolayca dağılmaz (Şekil 1C,D).
    NOT: ADSC sferoidleri kısmi ayrışmadan 2 gün sonra hazırdır.

2. Sferoidlerin civciv embriyolarına nakli

  1. Hazırlık
    1. İstenilen Hamburger-Hamilton (HH) aşamasınaulaşılana kadar 37.5 °C'de nemli bir inkübatörde 15-30 yumurtayı kuluçkaya yatırarak tavuk yumurtası hazırlayın: Ekstremite tomurcuk seviyesindeki somitlerdeki greftler için 40-45 saat (HH11-12 veya 13-19 somit) veya sefalik bölgedeki greftler için 29-33 saat (HH8-9 veya 5-8 somit). Yumurtaları yatay olarak yerleştirin ve kuluçkadan önce yumurtaların üstüne kurşun kalemle bir çizgi çizin (Şekil 3D).
      NOT: Kuluçka süreleri, bireysel inkübatörlere göre biraz değişebilir. Bir çizgi çizmek, embriyonun bulunduğu yumurtanın üst kısmının, deneyden önce yumurta döndürülürse kolayca tanımlanabilmesini sağlayacaktır.
    2. Metal bir iğne tutucusuna bir dikiş iğnesi takarak keskin iğneler ("mikro neşter") hazırlayın (Şekil 3B). Yağlı bir bileme taşı kullanarak, iğneyi ince kenarlı küçük bir neşter gibi olana kadar keskinleştirin (Şekil 3C). Alternatif olarak, elektroliz36 ile keskin bir tungsten iğnesi hazırlayın.
    3. Bir cam Pasteur pipetinin ince kısmını kısaca eritmek için bir Bunsen brülörünün alevini kullanarak cam kılcal damarları hazırlayın. Erimiş kısmı alevlerden çıkarın ve ince bir kılcal damar oluşturacak şekilde gerin. Kılcal damarı mikroforceps ile kırarak dikkatlice iki parçaya bölün. Hindistan mürekkebi enjeksiyonu için ince bir kılcal damar ve sferoidleri aktarmak için kalın bir kılcal damar hazırlayın (Şekil 3B).
      NOT: Çekme mukavemetini değiştirerek farklı kılcal mastarlar oluşturmak mümkündür. Ameliyattan hemen önce kılcal damarlar hazırlanmalıdır.
    4. Çalışma yüzeyini ve diğer malzemeleri yumurta manipülasyonu için hazırlayın (Şekil 3A). Tüm cerrahi malzemeleri gece boyunca 100 °C fırında veya kullanmadan hemen önce %70 etanol ile sterilize edin. Steril PBS'yi 37 °C'ye ısıtın. Hindistan mürekkep enjeksiyonu ve sferoidlerin aktarılması için aspiratör borusu tertibatına 200 μL'lik bir uç (bariyerli) takın.
      NOT: İnsan hücrelerinin sferoidlerini aktarırken bariyerli uçlar kullanın.
    5. Deneyden hemen önce, 30 mm'lik Petri kabına 2 damla Hindistan mürekkep suyu çözeltisi ekleyin ve 1 mL steril PBS ile karıştırın. Küresel plakayı inkübatörden çıkarın ve deneyin geri kalanı için bir buz kutusunun üzerine yerleştirin.
  2. Her yumurtanın hazırlanması
    1. Kuluçka makinesinden bir yumurta çıkarın ve bir yumurta tutucunun üzerine yerleştirin. Yumurtanın keskin ucunda küçük bir delik açın (Şekil 2D) ve bir şırınga ve iğne kullanarak 1.5 mL albümini aspire edin. Yumurta sarısına zarar vermemek için iğneyi yumurtaya dik olarak sokun. Yapışkan bant kullanarak deliği kapatın. İsteğe bağlı olarak, deneyden önce tüm yumurtalar için bu adımı tekrarlayın ve yumurtaların geri kalanını yeniden inkübe edin.
    2. Makas kullanarak yumurtanın üstündeki bir pencereyi dikkatlice kesin (Şekil 3D). Pipeti kullanarak yumurta sarısının üzerine 1-2 damla PBS ekleyin. Gerekirse, pipeti kullanarak büyük albümin kabarcıklarını ( Şekil 3F'de görülenler gibi) çıkarın.
    3. İnce kılcal damarı aspiratör borusu tertibatına takın. Cam kılcal damarı kısmen aspirasyon yoluyla Hindistan mürekkebi çözeltisi ile doldurun. Embriyonik yapılar görülene kadar embriyonun altındaki yumurta sarısına yeterince Hindistan mürekkebi enjekte edin (Şekil 3E, F).
    4. Stereomikroskobu kullanarak somit sayısını sayın (Şekil 4A). Yumurtaları bir kalem kullanarak tek tek numaralandırın (Şekil 4B).
  3. Sferoid nakli
    1. Greft bölgesini tanımlayın: kanat tomurcuğu seviyesinde paraaksiyel mezoderm (varsayımsal 15. ila 20. somitlerin presomitik mezodermi 3 7) (Şekil 3G ve Şekil 5A) veya varsayımsal birinci faringeal ark bölgesi (ektoderm ve endoderm arasında lateral posterior mezensefalon / birinci eşkenar dörtgen38) (Şekil 8A).
    2. Bir mikro neşter kullanarak vitellin zarını hedef bölge üzerinde kesin.
    3. Bir çift mikro neşter kullanarak, sferoidin implante edileceği bölgede sığ bir kesim yapın (Şekil 3H).
      NOT: Altta yatan endoderme zarar vermekten kaçının; Aksi takdirde, yumurta sarısı sızar (bu olursa, yumurtayı atın).
    4. İnce kılcal damarı aspiratörden çıkarın ve kalın kılcal damar ile değiştirin. Stereomikroskop altında sferoidleri gözlemleyin ve somit ile yaklaşık olarak aynı boyutta bir sferoid seçin (Şekil 2D). Bu sferoidi kılcal damara aspire edin.
    5. Sferoidi nazikçe kesilen bölgenin yanına bırakın (Şekil 3H). Keskin iğneleri kullanarak sferoidi kesilen bölgeye itin (Şekil 3I,J).
    6. Sferoidin sıkıca yerleştirildiğinden emin olmak için pipeti kullanarak embriyonun üzerine 1-2 damla PBS ekleyin.
      NOT: Greft yerinden çıkarsa, yeni bir sferoid nakledilmelidir (adım 2.3.4 ve 2.3.5).
    7. Kontaminasyonu önlemek için yumurtanın tamamen kapatılabilmesini sağlamak için yumurta kabuğundaki herhangi bir albümin sızıntısını kağıt mendil kullanarak temizleyin. Yapışkan bant kullanarak pencereyi yumurtaya kapatın.
    8. Aşılı bölgeye dikkat edin (Şekil 4A). Yerleştirilen sferoidin yerinden çıkmasını önlemek için yumurtayı dikkatlice 37,5 °C'deki nemli inkübatöre geri koyun.
    9. İstenilen aşamaya kadar yumurtayı kuluçkaya yatırın.
      NOT: Ksenogreft, ekstremite tomurcuğu seviyesinde somitlere gerçekleştirildiğinde, 3.5 günlük embriyolarda (HH21) migrasyon ve hücre ölümü başarılı bir şekilde test edilmiş ve 6 günlük embriyolarda (HH29) hücre farklılaşması ve tropizmi gözlenmiştir (Şekil 5A). 8 günlük embriyolarda da konak dokulara entegrasyon gerçekleştirilmiştir (HH33). Faringeal ark bölgesine aşılanan donör hücreler 4.5 günlük embriyolarda (HH25) incelenmiştir (Şekil 8A).

3. Doku diseksiyonu, fiksasyonu, işlenmesi ve histolojik kesitlerin hazırlanması

  1. Diseksiyon ve fiksasyon
    1. Fiksatifi hazırlayın (en az 1 mL / embriyo): etanol% 100 -formaldehit% 37 - buzlu asetik asit 6: 3: 1 oranında. Çalışma yüzeyini, bir çift mikroforceps, cerrahi makas veya iris makası ve oluklu bir kaşığı temizleyin. 60 mm'lik bir cam Petri kabını soğuk PBS ile doldurun ve stereomikroskop altına yerleştirin.
    2. Yapışkan bandı keserek yumurtayı açın.
    3. Embriyonun etrafındaki zarları kesin ve oluklu kaşığı kullanarak çıkarın.
    4. Embriyoyu Petri kabına aktarın. Embriyo 5 günlük (HH26) veya daha büyükse, herhangi bir manipülasyondan önce derhal başını kesin.
    5. Mikroforseps ve makas kullanarak kalan zarları çıkarın. Kalan yumurta sarısı damlacıklarını yıkamak için numuneyi PBS'de nazikçe çalkalayın.
    6. Ksenogreft kanat seviyesinde yapıldıysa, kafayı atın. Hücreler sefalik bölgeye aşılanmışsa, vücudun alt yarısını kesin ve atın, böylece kalp bölgesinin sağlam kalmasını sağlayın.
    7. Her numuneyi 1 mL fiksatif içeren ayrı bir 2.0 mL tüpe aktarın. Tüpleri daha önce olduğu gibi ayrı ayrı tanımlayın (Şekil 4B). Onları gece boyunca 4 ° C'de çalkalama ile inkübe edin.
    8. Pozitif kontrol olarak bir hücre veya sferoid peleti kullanın (Şekil 4F). Bunun için, bir hücre süspansiyonunu (adım 1.5) veya hücre sferoidlerini (adım 1.10) 1.5 mL'lik bir tüpte 10 dakika boyunca 180 × g'da santrifüjleyin, kültür ortamını atın ve peleti bozmadan 1 mL fiksatif ekleyin. Tüpü gece boyunca 4 °C'de çalkalamadan inkübe edin ve civciv örneklerinde olduğu gibi devam edin.
  2. Dehidrasyon ve gömme
    1. Embriyoları, her biri en az 1 saat boyunca 1x PBS'de 1 mL% 70,% 80,% 90 ve% 100 etanol art arda yıkayarak dehidre edin.
    2. Numuneleri gece boyunca 1 mL %100 etanol içinde oda sıcaklığında çalkalama ile inkübe edin.
    3. Numuneleri bir çeker ocakta 1 saat boyunca 1 mL %100 ksilen içinde inkübe edin. İki kez daha tekrarlayın.
    4. Tüpün içeriğini boyama bloğuna aktarın ve ksileni atın. Embriyoyu kaplayacak kadar erimiş parafin ekleyin ve boyama bloğunu cam kapağı ile kapatın. Gece boyunca 65 °C fırında inkübe edin.
    5. Gömmek için parafin blokları için ılık bir plaka ve bir kalıp hazırlayın.
      NOT: Embriyoyu konumlandırmak için bir çift gerilmiş ataş kullanışlıdır.
    6. Kalıbı erimiş parafin ile doldurun ve embriyoyu ona aktarın. Gövdenin enine bir kesitini (Şekil 5A) veya başın koronal bir bölümünü (Şekil 8A) elde etmek için embriyoyu konumlandırın.
    7. Embriyoyu doğru yönde kesmeye yardımcı olmak için parafinin içine, kesilecek yüzeyin karşısına bir kağıt isim etiketi yerleştirin (Şekil 4C).
    8. Kullanılıyorsa, gömme kasetini örneğin üzerine yerleştirin. Kalıbından çıkarmadan önce bloğun tamamen soğumasını bekleyin. Alternatif olarak, sertleştirilmiş parafin bloğunu erimiş parafin kullanarak kasete veya diğer blok tutucuya takın ve tekrar soğumaya bırakın.
  3. Bölümlere ayırma
    1. Malzemeleri bölümlere ayırmak için hazırlayın. Sıcak bir plakayı 42 °C'ye ısıtın ve bir karton veya strafor plakayı yaklaşık 30 cm x 20 cm temiz alüminyum folyo ile kaplayın. Kullanmadan önce tüm yüzeyleri temizleyin.
      NOT: Nükleazlarla kontaminasyonu önlemek için eldiven kullanın, özellikle de bazı bölümler RNA in situ hibridizasyon için kullanılacaksa. Su ve yüzeyler önceden iyice temizlenmedikçe, aynı nedenle parafin bölümlerini germek için bir histoloji banyosu kullanmaktan kaçının.
    2. Fazla parafini bir mikrotom bıçağıyla kesin. Daha sonraki bir adımda bir neşter bıçağı kullanarak her bölümün kolayca ayrılması için her iki tarafta trapez şeklinde bir eğim oluşturun (Şekil 3A).
    3. Bloğu mikrotoma takın. Sol ve sağ tarafların birbirine paralel olduğundan emin olmak için bloğu dikkatlice konumlandırın. Numunenin birkaç bölümünü kestikten ve mikroskop altında gözlemledikten sonra daha ince bir ayar yapın.
    4. Hedef bölgeye ulaşıldığında (uzuv tomurcuğu veya ilk faringeal kemer), 7 μm'lik bölümler kesin ve parafin şeritlerini alüminyum folyo ile kaplı plakanın üzerine yerleştirin. Tüm hedef bölgeyi bölümlere ayırın (Şekil 4C).
    5. Seri bölümleri hazırlamak için, yeterli sayıda sürgülü camı steril deiyonize su damlaları ile kaplayın. Fırça ve neşter kullanarak tek tek bölümleri slaytlara sırayla aktarın. Seri bölümler oluşturmak için bitişik bölümleri farklı slaytlara aktarın (Şekil 4D). 3.5 günlük embriyolar için 3 slayt, 4.5 günlük embriyolar için 4 slayt ve 6 günlük embriyolar için 5 slayttan oluşan seriler hazırlayın. Bitişik bölümleri farklı problar, antikorlar veya klasik histolojik lekelerle boyayın.
      NOT: Aynı seri, embriyonun büyük bir kısmı kesitliyse birden fazla bitişik slayt içerebilir. Her slayta birden fazla bölüm aktarılabilir ve bölümler arasında esnemelerine izin vermek için biraz boşluk bırakılabilir. Slaytı henüz ılık tabağın üzerine koymayın.
    6. Tüm bölümler slaytlara aktarıldıktan sonra, tüm bölümler tek bir su damlası üzerinde yüzene kadar daha fazla su ekleyin. Slaytı ılık bir tabağa yerleştirin ve bölümlerin gerilmesine izin verin. Slaytı ılık plakadan çıkarın ve sürgülü camı kağıt mendile dikkatlice eğerek suyu çıkarın.
      NOT: Bölümlerin esnemeden önce cam kızağa doğrudan temas etmesine izin vermeyin.
    7. Slaytları gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde kurumaya bırakın.

4. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile digoksigenin etiketli Alu problarının sentezi

  1. Aşağıdaki insana özel primerler39 için bir stok çözümü hazırlayın: AluFw: 5'-CGA GGC GGG TGG TGG ATC ATG AGG T-3' ve AluRev: 5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'.
  2. Aşağıdaki PCR reaksiyonundan 50 μL hazırlayın40: 1x PCR tamponu, 2.0 mM MgCl2, 0.1 mM dCTP, 0.1 mM dGTP, 0.1 mM dATP, 0.065 mM dTTP, 0.035 mM dig-11-dUTP, 0.4 μM AluFw primerleri, 0.4 μM AluRev primerleri, 0.05 U/μL Taq polimeraz ve 1 ng/μL insan genomik DNA'sı.
  3. PCR'yi aşağıdaki ayarları kullanarak çalıştırın: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ilk denatürasyon, ardından 20 saniye boyunca 94 ° C, 20 saniye boyunca 60 ° C ve 20 saniye boyunca 72 ° C'de 40 döngü, ardından 5 dakika boyunca 72 ° C'lik son denatürasyon.
  4. Bir spektrofotometre kullanarak prob konsantrasyonunu ölçün. Probları -20 °C'de saklayın.
    NOT: PCR ürünü, %200 agaroz jel29 içinde elektroforezden sonra 300-2 bp uzunluğunda olmalıdır.

5. Alu probları ile yerinde kesit hibridizasyonu,

  1. 1. Gün: Geçirgenlik ve hibridizasyon
    NOT: 1. günde gerçekleştirilen tüm adımlar için sterilize edilmiş bir sürgülü cam kavanoz kullanılmalıdır.
    1. 37 °C'lik bir su banyosunda bir yıkama PBT'yi (PBS'de %0,1 Tween 20) önceden ısıtın ve %50 formamid/%50 deiyonize su içeren nemli bir oda hazırlayın.
      NOT: Tüm yıkamaların hacmini cam kavanoz boyutuna göre hesaplayın. Belirtilmedikçe, tüm yıkamalar, slaytların çözeltiye daldırılmasıyla gerçekleştirilir.
    2. Parafini, bir çeker ocakta her biri 5 dakika olmak üzere ksilen içinde art arda üç yıkama ile çıkarın.
    3. Seriyi her biri 5 dakika boyunca %100 etanol içinde iki yıkama ile yeniden sulandırın, ardından her biri 2 dakika boyunca PBS'de %90/70/30 etanol ile yıkayın.
    4. PBT'de (PBS'de %0.1 Tween, 20) her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    5. Geçirgenlik için, önceden ısıtılmış PBT'ye 2 μg/mL Proteinaz K ekleyin, slaytları çözeltiye daldırın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 14 dakika inkübe edin.
    6. Bölümleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit/PBS'ye daldırarak sabitleyin.
    7. PBS ile 5 dakika yıkayınız.
    8. Her slayttan fazla PBS'yi sildikten sonra, bölümleri 300 μL hibridizasyon tamponu (%50 deiyonize formamid, 4x SSC pH 5.0, 1x Denhardt solüsyonu, %5 dekstran sülfat, 100 μg/mL somon sperm DNA'sı) ile kapatın (Tablo 1). Formamid haznesinde 42 °C'de 1 saat inkübe edin.
    9. Hibridizasyon tamponunda 0.2 ng / mL Alu probu çözeltisi hazırlayın. Hibridizasyon tamponunu çıkarmak için sürgüyü eğin ve bölümlerin üzerine 120 μL Alu prob çözeltisi ekleyin. Kabarcıkları önlemek için dikkatli bir cam lamel ile örtün.
      NOT: Parafilm, 70 °C'nin üzerindeki sıcaklıklarda eriyeceği için bu adımda slaytları kaplamak için kullanılmamalıdır.
    10. Slaytları sıcak bir plaka üzerinde 95 °C'de 5 dakika ısıtın.
      NOT: Formamid dumanlarını solumayın.
    11. Slaytları gece boyunca formamid odasında 42 ° C'de inkübe edin.
  2. 2. Gün: Sıkılık yıkamaları ve immünohistokimya
    1. 20x SSC tamponu hazırlayın (3 M NaCl, 0.3 M sodyum sitrat, pH 7.5) (Tablo 1). 0.1x tuzlu sodyum sitrat (SSC) tamponu, pH 7.5, 42 ° C'ye kadar iki yıkamayı önceden ısıtın.
    2. Sürgülü bir cam kavanozu 2x SSC tamponu, pH 7.5 ile doldurun. Slaytları yavaşça solüsyona yerleştirin ve lamellerin kendiliğinden ayrılmasını bekleyin. Kerpeten kullanarak lamelleri çıkarın ve slaytları oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2x SSC tamponunda inkübe edin.
    3. Slaytları 2x SSC tamponu, pH 7.5 ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca tekrar yıkayın.
    4. Slaytları 0.1x SSC tamponu, pH 7.5 ile 42 ° C'de her biri 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
    5. Slaytları MABT (Tween ile maleik asit tamponu; 0.1 M maleik asit, 0.15 M sodyum klorür, %0.1 Tween 20, pH 7.5) ile iki kez yıkayın (Tablo 1) her biri oda sıcaklığında 30 dakika.
    6. Her slayttan fazla tamponu silin ve bölümleri 400 μL bloke edici solüsyonla kaplayın (% 10 inaktive edilmiş normal keçi serumu,% 2 MABT'de bloke edici reaktif). Oda sıcaklığında nemli bir odada (deiyonize su ile hazırlanmış) 2 saat inkübe edin.
    7. Sıvıyı çıkarmak için slaytları eğin ve bloke edici çözeltide 1: 2.000 seyreltmede alkalin fosfataza konjuge edilmiş 150 μL Fab anti-DIG fragmanı ekleyin. Bir cam lamel veya parafilm ile örtün ve nemli odada 4 ° C'de 16 saat inkübe edin.
  3. 3. Gün: Renk geliştirme
    1. MABT'li bir kavanozun içindeki lamelleri veya parafilmi nazikçe çıkarın (adım 5.2.2'de olduğu gibi) ve slaytları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca MABT'de inkübe edin.
    2. MABT ile her biri 30 dakika boyunca üç kez daha yıkayın.
    3. MAB (maleik asit tamponu; 0.1 M maleik asit, 0.15 M sodyum klorür, pH 7.5) (Tablo 1) ile 30 dakika yıkayın.
    4. Her biri 10 dakika boyunca NTM (NaCl-Tris-MgCl2 tamponu; 100 mM Tris-HCl pH 9.5, 100 mM sodyum klorür, 50 mM magnezyum klorür) (Tablo 1) ile iki kez yıkayın.
    5. Boyama solüsyonunu (0.45 μL/mL 4-Nitro mavi tetrazolyum klorür, 3.5 μL/mL 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat p-toluidin NTM'de) ekleyin (Tablo 1) boyama kavanozuna ve slaytları solüsyona daldırın. Kavanozu alüminyum folyo ile örtün ve rengin gece boyunca 37 °C'de oluşmasına izin verin.
  4. 4. Gün: Boyama ve montaj
    1. Slaytları PBS ile oda sıcaklığında her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
      NOT: Boyama solüsyonunun halojen atığı olarak uygun şekilde atıldığından emin olun.
    2. Sulu bir montaj ortamından damlalar ekleyerek ve bölümleri bir cam lamel ile kaplayarak kızakları oldukları gibi monte edin. Alternatif olarak, nükleer hızlı kırmızı veya Alcian mavisi karşı boyamaya devam edin.
    3. Fazla PBS'yi silin ve bölümlerin üzerine 500 μL %0.1 nükleer hızlı kırmızı41 (Tablo 1) nükleer karşı boyama solüsyonu ekleyin ve slaytları nemli bir odada 10 dakika inkübe edin. Fazla nükleeri hızlı bir şekilde çıkarmak için uç kırmızıyı açın ve dehidrasyona devam edin (adım 5.4.5).
    4. Bölümleri 10 dakika boyunca% 0,5 Alcian mavisi çözeltisine (kıkırdak karşı leke)42 daldırın; Damıtılmış suda durulayın ve% 1 fosfomolibdik asit içinde 10 dakika inkübe edin. Tekrar suyla durulayın ve dehidrasyona devam edin.
      NOT: Fosfomolibdik asit yıkama atlanırsa, Alcian mavisi nükleer bir karşı leke haline gelir.
    5. Her biri 5 dakika boyunca 70/95/100/100% etanol içinde kurutun.
    6. Çeker ocakta her seferinde 5 dakika boyunca üç kez ksilen ile yıkayın.
    7. Ksilen bazlı bir montaj ortamı ve cam lameller ile monte edin.
    8. Sürgüleri çeker ocakta en az 16 saat kurumaya bırakın.

6. Görüntü edinme

  1. Monte edilen slaytlar iyice kurutulduktan sonra, dik bir parlak alan mikroskobu kullanarak aşılanmış insan hücrelerinin varlığı açısından tüm bölümleri inceleyin (Şekil 4E). Mavi-mor Alu-pozitif hücreleri arayın (Şekil 4F,G) ve Alu-pozitif hücreleri içeren bölümleri bir işaretleyici kalem kullanarak işaretleyin (Şekil 4E).
    NOT: Bölümleri Alu-pozitif hücrelerle işaretlemek, fotoğraflarını çekerken ve diğer işaretleyicilerle lekelenmiş bitişik slaytları karşılaştırırken onları bulmayı kolaylaştıracaktır.
  2. Ksenogreft içeren bölümlerin slayt üzerindeki yerleştirilme sırasına göre (ön-arka yön) fotoğraflanmasına özen gösterin. Her fotoğrafı, [ksenogreft tarihi]_[hücre tipi]_[embriyonik yaş]_[prob tipi]_[bölüm numarası]_001 gibi ilgili tüm bilgilerle adlandırın. Ölçek çubuğunu daha sonra eklemek için meta veri dosyalarını dahil edin.
  3. Aynı seriden diğer slaytlar, örneğin RNA in situ hibridizasyon veya immünohistokimya gibi başka bir işaretleyici ile boyanırsa, bitişik bölümleri (Şekil 6) aynı şekilde fotoğraflayın ve adlandırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Histolojik kesitlerde Alu-pozitif ADSC'lerin tanımlanması
Alu dizileri, insan genomunun ~'unu oluşturan tekrarlayan elementlerdir ve bu nedenle insan hücrelerini türe özgü bir şekilde tanımlamak için mükemmel hedeflerdir43. DNA probları ile yerinde hibridizasyon, birincil insan hücreleri 29,30,40,44,45,46

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol (Şekil 1), civciv embriyolarını model olarak kullanarak, insan hücrelerinin birincil popülasyonlarının davranışını in vivo olarak taramak için uygun bir seçenek sunar. Bu makale, hücre sferoidlerinin oluşumunu (Şekil 2), sferoidin civciv embriyosuna naklini (Şekil 3), örneklerin işlenmesini ve in situ hibridizasyonu, presomiti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Universidade Federal de Rio de Janeiro (J.B. için UFRJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (J.B. için CNPq) ve Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (J.B. için FAPERJ) tarafından desteklenmiştir. Runx2 (Cbfa1) probu için T. Jaffredo'ya (CNRS, Paris, Fransa) teşekkür ederiz. HNK1 antikoru, NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi, Biyolojik Bilimler Bölümü, Iowa City, IA 52242 ABD tarafından sürdürülen Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası'ndan elde edildi. Mikrotoma erişim sağladığı için V. Moura-Neto'ya ve mikroskoba erişim izni verdiği için R. Lent'e teşekkür ederiz. Alu problarının sentezlenmesindeki yardımı için E. Steck'e teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hayvanlar< / güçlü >
Gallus gallus yumurtalarıGranja TolomeiSPF içermeyenBeyaz leghorn tavuk
< güçlü > Reaktifler< / güçlü >
Alcian Blue 8GXSigma-aldrichA5268
AluFw astarlarıSigma-aldrichOLIGO5'-CGA GGC GGG TGG ATC ATG AGG T-3'
AluRev astarlarıSigma-aldrichOLIGO5'-TTT TTT GAG ACG GAG TCT CGC-3'
Nükleer için alüminyum sülfatSigma-aldrich368458hızlı kırmızı çözelti hazırlama
Anti-Digoxigenin-AP, Fab parçalarıRoche11093274910Antikor Kayıt Kimliği: AB_514497
Anti-İnsan Doğal Öldürücü 1 antikoru (HNK1, CD57)Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası3H5Antikor Kayıt Kimliği: AB_2314644
Anti-fare, keçi IgM-HRPSanta Cruz Biyoteknolojisc-2973Antikor Kayıt Kimliği: AB_650513
Anti-fare, keçi IgG (H + L) -HRPNovexG-21040Antikor Kayıt Kimliği: AB_2536527
Anti-Düz Kas Aktin / ACTA2 antikoruDakoM085129Antikor Kayıt Kimliği: AB_2811108
AquatexMerck1085620050Sulu montaj maddesi
5-Bromo-4-kloro-3-indolil fosfat p-toluidin tuzu (BCIP)Sigma-aldrichB8503-100MG
Bloke Edici ReaktifRoche11096176001
Sitrik asitVETEC238SSC tampon hazırlama için
Kollajenaz tip IASigma-aldrichSCR103
dCTP, dGTP, dATP, dTTP setiRoche11969064001
Denhardt çözeltisi 50XInvitrogen750018Hibridizasyon tamponu hazırlama için
Dekstran sülfat sodyum tuzuThermo Scientific15885118Hibridizasyon tamponu hazırlama için
DIG RNA Etiketleme KarışımıRoche11277073910Dig-11-dUTP
DMEM düşük glikozluSigma-aldrichD5523
3,3 & prime; -Diaminobenzidin tetrahidroklorür (DAB)içerirSigma-aldrichD5905-50TAB
N,N-Dimetilformamid (DMF)Sigma-aldrich227056NBT ve BCIP çözeltisinin hazırlanması için
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Sigma-aldrichE6758Tripsin çözeltisinin hazırlanması için
Entellan yeniMerck107961Susuz montaj ortamı
EtanolProquí miosN / A
Fetal sığır serumuThermoFisher1265702956 ° C'de inaktive edilir; C kullanmadan önce
Formaldehit% 37 çözeltiProquí miosN/A
FormamidVetecV900064
Buzlu asetik asitProquí miosN/A
Hindistan mürekkebiPelikan221143
L-glutamin çözeltisi (200 mM)Gibco25030-149
Magnezyum klorürMerck8147330100NTM tampon hazırlama için
Maleik asitSigma-aldrichM0375-500GMAB tampon hazırlama için
MetanolProquí mios
Normal KeçiSerumu Sigma-aldrichNS02L56 ° C'de inaktive olur; Kullanmadan önce C
4-Nitro mavi tetrazolyum klorür (NBT)Roche11585029001
Nükleer hızlı kırmızıSigma-aldrich60700
Paraplast PlusSigma-aldrichP3558
Penisilin G sodyum tuzuSigma-aldrichP3032
Fosfat tamponlu salin (PBS)Sigma-aldrichP3813
Fosfomolibdik asitMerck100532
Proteinaz KGibco BRL25530-015
Somon sperm DNAInvitrogen15632011Hibridizasyon tamponu hazırlama için
SSC, MAB ve NTM tampon hazırlama içinklorürSigma-aldrichS9888
Streptomisin SülfatSigma-aldrichS6501
Taq Polimeraz kitiCenbiot EnzimasN/A
Tris-HClSigma-aldrichT5941
TripsinSigma-aldrichT4799
Tween 20Sigma-aldrichP1379
KsilenProquí miosN/
Mikroskop ve ekipmanları
Axioplan dik mikroskopCarl Zeiss MikroskopiN/A
Axiovision yazılımıCarl Zeiss MikroskopiN/A
Hücre inkübatörüThermoForma3110
Yumurta kuluçka makinesi - 50 yumurtaGP
Deveboynu lambasıBiocamN/AYumurta manipülasyonu için
Fiji yazılımı; Hücre Sayacı eklentisiImageJhttps://imagej.net/software/fiji/
Laminer akış başlığıTROX1385
Nanodrop LiteThermo ScientificND-LITE-PR
Döner mikrotomLeica BiosystemsRM2125 RTSKesit için
StereomikroskopLabomedLuxeo 4DYumurta manipülasyonu için
Sterilizasyon fırınıREALIS7261690Cerrahi malzemelerin sterilizasyonu için
Sarf malzemeleri
0,2 mL (PCR) polipropilen santrifüj tüpleriEppendorf30124707
15 mL polipropilen konik santrifüj tüpleriCorningCLS430791
1,5 mL polipropilen santrifüj tüpleriAxygenMCT-150-C
2 mL polipropilen santrifüj tüpleriAxygenMCT-200-C
50 mL polipropilen konik santrifüj tüpleriCorningCLS430829
Bariyer (Filtre) Uçları, 200 μ L boyutuInvitrogenAM12655Yumurta manipülasyonu için
Kazılmış Cam Blok (Boyama Bloğu) Kapaklı CamHecht Karl42020010
Gömme kasetleriSimportM480Parafin blok tutucu olarak kullanılır
Cam kapak kaydırakları, 24 x 40 mmKasviK5-2440
Cam Pastör pipetleri 230 mmNORMAX5426023Cam kılcal damarların hazırlanması için
Mikrotom bıçaklarıLeica BiosystemsYÜKSEK PROFİLLİ-KULLANIMLIK-BIÇAKLAR-818M'yi bölmek için
ParafilmP7793
Plastik Petri kabı, 30 mmKasviK13-0035Yumurta manipülasyonu için
Plastik Petri kabı, 60 mmProlab0303-8Hücre sferoidlerinin hazırlanması için. Hücre yapışması için tedavi edilmemelidir.
Silanize cam slaytlar (Starfrost)Knittel Glass198Kesit almak için
Şırınga 1 mL, İğneler 26 G (0,45 x 13 mm)Descarpack32972Yumurta manipülasyonu için (albümin aspirasyonu)
Cerrahi aletler
Aspiratör tüpüDrummond2-000-000Yumurta manipülasyonu için
Diseksiyon makasıGüzel Bilim Araçları14061-11Yumurta manipülasyonu için
Mikroforseps (cımbız)İnce Bilim Araçları00108-11Yumurta manipülasyonu ve cam kılcal damarların hazırlanması için
İğne tutucu (ayarlanabilir diseksiyon iğnesi aynası)Fisherbrand8955Yumurta manipülasyonu için
Yağ bileme taşı, 10.000 kumN/AN/ABileme iğneleri için
Bir çift küçük boya fırçalarıN/AN/AParafin bölümlerini işlemek için kullanılır. Herhangi bir marka kullanılabilir.
Dikiş iğneleriN/AN/AMikro neşterleri keskinleştirmek için. Herhangi bir marka kullanılabilir.
Steril tek kullanımlık neşter No. 23Swann-Norton110Kesit için
Cerrahi neşter sapıSwann-Norton914Kesit almak için
Wecker iris makası, keskin/keskinSurtexSS-641-11Yumurta manipülasyonu için
sodyumA Parafilm

Kaynaklar

  1. Herbert, K. E., Lévesque, J. P., Haylock, D. N., Prince, M. The use of experimental murine models to assess novel agents of hematopoietic stem and progenitor cell mobilization. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 14 (6), 603-621 (2008).
  2. Parada-Kusz, M., et al. Generation of mouse-zebrafish hematopoietic tissue chimeric embryos for hematopoiesis and host-pathogen interaction studies. DMM Disease Models and Mechanisms. 11 (11), (2018).
  3. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13 (8), 9959-9970 (2012).
  4. Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicological Research. 30 (1), 1-5 (2014).
  5. Ben-David, U., et al. Patient-derived xenografts undergo mouse-specific tumor evolution. Nature Genetics. 49 (11), 1567-1575 (2017).
  6. le Douarin, N., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. Cambridge. (1999).
  7. Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).
  8. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  9. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  10. Douarin, N., et al. le et al. Evidence for a thymus-dependent form of tolerance that is not based on elimination or anergy of reactive T cells. Immunological Reviews. 149 (1), 35-53 (1996).
  11. Boulland, J. L., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. Xenotransplantation of human stem cells into the chicken embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), e2071(2010).
  12. Goldstein, R. S. Transplantation of human embryonic stem cells and derivatives to the chick embryo. Methods in Molecular Biology. 584, 367-385 (2010).
  13. Akhlaghpour, A., et al. Chicken interspecies chimerism unveils human pluripotency. Stem Cell Reports. 16 (1), 39-55 (2021).
  14. Kulesa, P. M., Morrison, J. A., Bailey, C. M. The neural crest and cancer: A developmental spin on melanoma. Cells Tissues Organs. 198 (1), 12-21 (2013).
  15. Hendrix, M. J. C., et al. Reprogramming metastatic tumour cells with embryonic microenvironments. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 246-255 (2007).
  16. Singer, N. G., Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells: Mechanisms of inflammation. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6, 457-478 (2011).
  17. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal stem cells: Revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  18. Griffin, M. D., et al. Concise review: Adult mesenchymal stromal cell therapy for inflammatory diseases: How well are we joining the dots. Stem Cells. 31 (10), 2033-2041 (2013).
  19. Owen, M., Friedenstein, A. J. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic precursors. Ciba Foundation Symposium. 136, 42-60 (1988).
  20. Bianco, P., Robey, P. G., Saggio, I., Riminucci, M. "Mesenchymal" stem cells in human bone marrow (skeletal stem cells): A critical discussion of their nature, identity, and significance in incurable skeletal disease. Human Gene Therapy. 21 (9), 1057-1066 (2010).
  21. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  22. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: A joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  23. Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: Localization, morphology and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
  24. Zannettino, A. C. W., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214 (2), 413-421 (2008).
  25. Phinney, D. G. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells: Implications for cell therapy. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (9), 2806-2812 (2012).
  26. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  27. Baptista, L. S., et al. marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: How close are they. Journal of Stem Cells. , 73-90 (2007).
  28. Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS ONE. 8 (12), 84206(2013).
  29. Cordeiro, I. R., et al. Chick embryo xenograft model reveals a novel perineural niche for human adipose-derived stromal cells. Biology Open. 4 (9), 1180-1193 (2015).
  30. Santos, R. deA., et al. Intrinsic angiogenic potential and migration capacity of human mesenchymal stromal cells derived from menstrual blood and bone marrow. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 1-23 (2020).
  31. Menezes, A., et al. Live cell imaging supports a key role for histone deacetylase as a molecular target during glioblastoma malignancy downgrade through tumor competence modulation. Journal of Oncology. 2019, 9043675(2019).
  32. Brito, J. M., Teillet, M. A., le Douarin, N. M. Induction of mirror-image supernumerary jaws in chicken mandibular mesenchyme by Sonic Hedgehog-producing cells. Development. 135 (13), 2311-2319 (2008).
  33. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments JoVE. (51), e2720(2011).
  34. de Barros, A. P. D. N., et al. Osteoblasts and bone marrow mesenchymal stromal cells control hematopoietic stem cell migration and proliferation in 3D in vitro model. PLoS One. 5 (2), 9093(2010).
  35. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1951).
  36. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  37. Tickle, C. How the embryo makes a limb: Determination, polarity and identity. Journal of Anatomy. 227 (4), 418-430 (2015).
  38. Couly, G., Grapin-Botton, A., Coltey, P., le Douarin, N. M. The regeneration of the cephalic neural crest, a problem revisited: The regenerating cells originate from the contralateral or from the anterior and posterior neural fold. Development. 122 (11), 3393-3407 (1996).
  39. Walker, J. A., et al. Human DNA quantitation using Alu element-based polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry. 315 (1), 122-128 (2003).
  40. Steck, E., Burkhardt, M., Ehrlich, H., Richter, W. Discrimination between cells of murine and human origin in xenotransplants by species specific genomic in situ hybridization. Xenotransplantation. 17 (2), 153-159 (2010).
  41. Sams, A., Davies, F. M. R. Commercial varieties of nuclear fast red. Stain Technology. 42 (6), 269-276 (1967).
  42. Lison, L. Alcian blue 8 g with chlorantine fast red 5 B. A technic for selective staining of mucopolysaccharides. Biotechnic and Histochemistry. 29 (3), 131-138 (1954).
  43. Cordaux, R., Batzer, M. A. The impact of retrotransposons on human genome evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 691-703 (2009).
  44. Brüstle, O., et al. Chimeric brains generated by intraventricular transplantation of fetal human brain cells into embryonic rats. Nature Biotechnology. 16 (11), 1040-1044 (1998).
  45. Warncke, B., Valtink, M., Weichel, J., Engelmann, K., Schäfer, H. Experimental rat model for therapeutic retinal pigment epithelium transplantation - Unequivocal microscopic identification of human donor cells by in situ hybridisation of human-specific Alu sequences. Virchows Archiv. 444 (1), 74-81 (2004).
  46. Kasten, P., et al. Ectopic bone formation associated with mesenchymal stem cells in a resorbable calcium deficient hydroxyapatite carrier. Biomaterials. 26 (29), 5879-5889 (2005).
  47. Baptista, L., et al. Adipose tissue of control and ex-obese patients exhibit differences in blood vessel content and resident mesenchymal stem cell population. Obesity Surgery. 19 (9), 1304-1312 (2009).
  48. Christ, B., Huang, R., Scaal, M. Formation and differentiation of the avian sclerotome. Anatomy and Embryology. 208 (5), 333-350 (2004).
  49. Scaal, M., Christ, B. Formation and differentiation of the avian dermomyotome. Anatomy and Embryology. 208 (6), 411-424 (2004).
  50. Tucker, G. C., Delarue, M., Zada, S., Boucaut, J. C., Thiery, J. P. Expression of the HNK-1/NC-1 epitope in early vertebrate neurogenesis. Cell and Tissue Research. 251 (2), 457-465 (1988).
  51. Creuzet, S., Schuler, B., Couly, G., le Douarin, N. M. Reciprocal relationships between Fgf8 and neural crest cells in facial and forebrain development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4843-4847 (2004).
  52. Charrier, J. B., Lapointe, F., le Douarin, N. M., Teillet, M. A. Dual origin of the floor plate in the avian embryo. Development. 129 (20), 4785-4796 (2002).
  53. Kordes, U., Cheng, Y. C., Scotting, P. J. Sox group e gene expression distinguishes different types and maturational stages of glial cells in developing chick and mouse. Developmental Brain Research. 157 (2), 209-213 (2005).
  54. Stricker, S., Fundele, R., Vortkamp, A., Mundlos, S. Role of Runx genes in chondrocyte differentiation. Developmental Biology. 245 (1), 95-108 (2002).
  55. Grottkau, B. E., Lin, Y. Osteogenesis of adipose-derived stem cells. Bone Research. 1 (2), 133(2013).
  56. Culling, C. F. A. Handbook of histopathological and histochemical techniques. Including museum techniques. , Elsevier. (1974).
  57. Francis, P. H., Richardson, M. K., Brickell, P. M., Tickle, C. Bone morphogenetic proteins and a signalling pathway that controls patterning in the developing chick limb. Development. 120 (1), 209-218 (1994).
  58. Huber, K., et al. Persistent expression of BMP-4 in embryonic chick adrenal cortical cells and its role in chromaffin cell development. Neural Development. 3, 28(2008).
  59. Pouget, C., Gautier, R., Teillet, M. A., Jaffredo, T. Somite-derived cells replace ventral aortic hemangioblasts and provide aortic smooth muscle cells of the trunk. Development. 133 (6), 1013-1022 (2006).
  60. Kirby, M. L., Hutson, M. R. Factors controlling cardiac neural crest cell migration. Cell Adhesion and Migration. 4 (4), 609-621 (2010).
  61. Isern, J., et al. The neural crest is a source of mesenchymal stem cells with specialized hematopoietic stem cell niche function. eLife. 3, 03696(2014).
  62. Yamazaki, S., et al. Nonmyelinating schwann cells maintain hematopoietic stem cell hibernation in the bone marrow niche. Cell. 147 (5), 1146-1158 (2011).
  63. Carr, M. J., et al. Mesenchymal precursor cells in adult nerves contribute to mammalian tissue repair and regeneration. Cell Stem Cell. 24 (2), 240-256 (2019).
  64. Walker, J. A., et al. Quantitative intra-short interspersed element PCR for species-specific DNA identification. Analytical Biochemistry. 316 (2), 259-269 (2003).
  65. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  66. Yong, K. S. M., Her, Z., Chen, Q. Humanized mice as unique tools for human-specific studies. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 66 (4), 245-266 (2018).
  67. Cordeiro, I. R., Tanaka, M. Environmental oxygen is a key modulator of development and evolution: From molecules to ecology: Oxygen-sensitive pathways pattern the developing organism, linking genetic and environmental components during the evolution of new traits. BioEssays. 42 (9), 2000025(2020).
  68. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  69. Puente, B. N., et al. The oxygen-rich postnatal environment induces cardiomyocyte cell-cycle arrest through DNA damage response. Cell. 157 (3), 565-579 (2014).
  70. Colton, C. K. Implantable biohybrid artificial organs. Cell Transplantation. 4 (4), 415-436 (1995).
  71. Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

nsan K k H creleriH cre GH cre DiferansiyasyonuIn Situ HibridizasyonAlu ProblarParafin Kesit AlmaEmbriyonik Transplantasyon

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.