Özet

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Published: February 25, 2022
doi:

Özet

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Abstract

Beyindeki belirli sinapsların fizyolojik özelliklerini ve plastik değişikliklere nasıl maruz kaldıklarını incelemek, modern sinirbilimde önemli bir zorluktur. Geleneksel in vitro elektrofizyolojik teknikler, sinaptik iletimi uyandırmak için elektriksel stimülasyon kullanır. Bu yöntemin en büyük dezavantajı, spesifik olmayan doğasıdır; uyarıcı elektrot bölgesindeki tüm aksonlar aktive edilecek ve bu da belirli bir afferent bağlantıya bir etki atfetmeyi zorlaştıracaktır. Bu sorun, elektriksel stimülasyonun optogenetik temelli stimülasyonla değiştirilmesiyle aşılabilir. Optogenetiği in vitro yama-kelepçe kayıtlarıyla birleştirmek için bir yöntem tanımladık. Bu, anatomik olarak tanımlanmış hassas sinaptik bağlantıların hem bazal sinaptik iletiminin hem de sinaptik plastisitesinin incelenmesi için güçlü bir araçtır ve beyindeki hemen hemen her yola uygulanabilir. Burada, kemirgen beynindeki pre-sinaptik bir bölgeye (medial prefrontal korteks) cerrahi enjeksiyon için kanalrodopsin proteinini kodlayan bir viral vektörün hazırlanmasını ve işlenmesini ve aşağı akış hedef bölgelerinin (lateral entorinal korteks) akut dilimlerinin oluşturulmasını açıklıyoruz. Kısa ve uzun süreli sinaptik plastisiteyi incelemek için yama-kelepçe kayıtlarını ışık stimülasyonu ile sinaptik aktivasyonla birleştirmek için ayrıntılı bir prosedür de sunulmaktadır. Optogenetik ve Cre-bağımlı hücre etiketlemesini birleştirerek yol ve hücre özgüllüğünü sağlayan deney örneklerini tartışıyoruz. Son olarak, ilgilenilen sinaptik öncesi bölgenin histolojik doğrulaması, kesin konumun ve hücre tipinin daha fazla tanımlanmasına izin vermek için post-sinaptik hücrenin biyositin etiketlemesi ile birlikte açıklanmaktadır.

Introduction

Sinapsların fizyolojisini ve plastik değişikliklere nasıl uğradıklarını anlamak, beyin ağlarının sağlıklı beyinde nasıl çalıştığını anlamak için esastır1 ve beyin bozukluklarında nasıl arızalandıklarını anlamak için temeldir. Akut ex vivo beyin dilimlerinin kullanılması, tüm hücre yama-kelepçe kayıtları kullanılarak tek nöronlardan sinapsların elektriksel aktivitesinin yüksek sinyal-gürültü oranıyla kaydedilmesini sağlar. Membran potansiyelinin kontrolü ve basit farmakolojik manipülasyon, reseptör alt tiplerinin izolasyonuna izin verir. Bu kayıtlar, laminer ve alt bölgesel pozisyon2, hücresel morfoloji3, moleküler belirteçlerin varlığı4, afferent projeksiyonları5 veya yakın zamanda aktif olsa bile6 dahil olmak üzere post-sinaptik nöronu tanımlamak için mükemmel bir özgüllükle yapılabilir.

Bununla birlikte, sinaptik öncesi girdilerin özgüllüğünü elde etmek biraz daha zordur. Geleneksel yöntem, belirli bir laminada çalışan aksonları uyarmak için stimülasyon elektrotları kullanmıştır. Bunun bir örneği, stratum radiatumdaki lokal stimülasyonun, CA3’ten CA1 alt alanı7’ye yansıyan sinapsları aktive ettiği hipokampustadır. Bu örnekte, CA3 girişi, CA1 piramidal hücrelere8 yansıyan stratum radyatumunda bulunan tek uyarıcı girişi temsil ettiği için presinaptik özgüllük elde edilir. Bununla birlikte, CA3-CA1 eksenlerinin geleneksel elektriksel presinaptik aktivasyonu ile elde edilebilen bu yüksek giriş özgüllüğü derecesi, bu sinapsın maruz kaldığı yoğun çalışmaya yansıyan bir istisnadır. Diğer beyin bölgelerinde, çoklu afferent yollardan gelen aksonlar aynı laminada, örneğin neokorteks9’un 1. tabakasında bir arada bulunur, böylece geleneksel uyarıcı elektrotlarla girişe özgü presinaptik stimülasyonu imkansız hale getirir. Farklı sinaptik girdiler farklı fizyolojik özelliklere sahip olabileceğinden bu sorunludur; bu nedenle, birlikte stimülasyonları sinaptik fizyolojinin yanlış karakterize edilmesine yol açabilir.

Optogenetiğin ortaya çıkışı, channelrhodopsin-2 (ChR2) gibi ışığa duyarlı membran proteinlerinin (opsinler) genetik kodlaması, beyin bölgeleri10,11 arasındaki izole sinaptik projeksiyonları incelemek için olasılıkların geniş bir genişlemesine izin vermiştir. Burada, uzun menzilli sinaptik fizyoloji ve plastisiteyi incelemek için genelleştirilebilir ve düşük maliyetli bir çözümü açıklıyoruz. Optogenetik yapılar, ilgilenilen sinaptik öncesi bölgenin son derece hassas kontrolüne izin veren viral vektörler kullanılarak oldukça spesifik bir şekilde teslim edilir. Efferent projeksiyonları, bu liflerin bir hedef bölgede aktivasyonuna izin veren ışıkla aktive edilen kanalı ifade edecektir. Böylece, geleneksel, spesifik olmayan, elektriksel stimülasyon ile bağımsız olarak aktive edilemeyen uzun menzilli, anatomik olarak dağınık yollar incelenebilir.

Örnek bir yol olarak, medial prefrontal korteksin (mPFC) uyarıcı katyon kanallı opsinleri kodlayan adeno ilişkili virüslerle (AAV’ler) transdüksiyonunu tanımladık. Daha sonra lateral entorinal korteksten (LEC) akut dilimlerin hazırlanmasını, katman 5 LEC piramidal nöronlarından yama-kelepçe kayıtlarını ve glutamaterjik mPFC-LEC projeksiyonlarının ışıkla uyarılmış aktivasyonunu tanımladık (Şekil 1). Ayrıca, pre-sinaptik bölgenin yerini doğrulamak ve post-sinaptik hücre morfolojisinin tanımlanmasını doğrulamak için enjeksiyon bölgesinin histolojik değerlendirmesini de açıklayacağız.

Protocol

Tüm hayvan prosedürleri, Birleşik Krallık Hayvanlar Bilimsel Prosedürler Yasası (1986) ve ilgili kılavuzların yanı sıra yerel kurumsal yönergelere uygun olarak yürütülmüştür. 1. Stereotaksik viral enjeksiyon NOT: Mevcut protokol anatomik gerektirir, ancak sinaptik hücre sonrası hücre tipi değil, özgüllük gerektirir. Uygun hayvanı seçin. Bu protokolde erkek vahşi tip Lister kapüşonlu sıçanlar kullanıldı (300-350 g, yaklaşık 3 aylık). Uygun viral yapıyı seçin. Göz önünde bulundurulması gereken birkaç faktör vardır (bkz. Mevcut protokol, uyarıcı nöronları (AAV9 – CaMKIIa – ChR2 (E123T / T159C) – mCherry; titre: 3.3 x 10 13 viral genom / mL) dönüştürmek için optogenetik kanal ChETATC 12’yi eksprese etmek için bir virüs kullanır. Daha önce tarif edildiği gibi bir beyin atlası kullanarak enjeksiyonun koordinatlarını ve hacmini belirleyin35. Viral preparatın stereotaksik enjeksiyonuNOT: Hayvanların kullanımı ve bakımı ile ilgili tüm ulusal ve kurumsal kılavuzlara uyulmalıdır. Viral vektörler daha önce tarif edildiği gibi stereotaksik olarak enjekte edilir13 aşağıdaki değişikliklerle.Anestezi ve hayvanın hazırlanması sırasında viral preparatı buz üzerinde tutun. % 4 izofluran içeren bir anestezik indüksiyon odasında anesteziyi indükleyin. Daha yavaş düzenli solunum hızı (1 Hz) ve pedal ve kornea reflekslerinin yokluğu ile belirtilen anestezi seviyesini izleyin (sırasıyla ayak parmaklarını sıkıştırarak ve gözün köşesine hafifçe dokunarak test edin; yanıt tespit edilmemelidir). İnvaziv prosedürden en az 30 dakika önce meloksikam gibi ameliyat öncesi analjezik uygulayın. Hayvan tamamen anestezi altına alındığında, kürkü kafa derisinden çıkarmak için makas kullanın. İzofluran akışını stereotaksik çerçevenin burun konisine geçirin ve sıçanı çerçeveye monte edin. İşlem sırasında kuruluğu önlemek için gözlere yağlayıcı göz jeli uygulayın. Ameliyat aseptik koşullarda yapılmalıdır. İşlem boyunca steril eldivenler ve aletler kullanın. Kafa derisini% 4 w / v klorheksidin çözeltisi ile dezenfekte etmeden önce lidokain merhem (% 5 w / w) uygulayın ve ardından vücudu steril bir örtü ile örtün. Bir neşter kullanarak, bregmayı ortaya çıkarmak için kafa derisi üzerinde yaklaşık 15 mm uzunluğunda uzunlamasına bir kesi yapın. Bir Hamilton şırıngasını, stereotaksik çerçeveye monte edilmiş hareketli bir kola bağlı bir mikroenjeksiyon şırınga pompasına yükleyin. Virüsün 5 μL’lik bir alikotunu 0.2 mL’lik bir tüpe yerleştirin ve tüm hacim tüpün dibinde olana kadar birkaç saniye döndürün. Pipet, tüpün kapağına viral preparatın 2 μL’sini verir. Önce iğne ucunu cerrahi mikroskopla görüntüleyerek şırıngayı viral preparatla doldurun ve ardından virüsün bolusunu manuel olarak iğnenin ucuna yerleştirin ve pompa kontrollerini kullanarak şırınga pistonunu geri çekin. Pompa enjeksiyon hacmini 300 nL’ye ve akış hızını 100 nL/dk’ya ayarlayın. Pompayı çalıştırın ve iğne ucundaki virüs damlacığını gözlemleyerek doğru akışı onaylayın. Virüsü bir pamuk tomurcuğu üzerinde emin ve iğneyi% 70 etanol ile nazikçe temizleyin. Stereotaksik çerçeve üzerindeki ayarlayıcı vidaları kullanarak iğne ucunu bregmaya (kafatası üzerinde koronal ve sagital sütürlerin buluştuğu nokta) yönlendirin ve çerçeve üzerindeki üç vernier ölçeğinde gözlenen stereotaksik ölçümleri not alın. Sıçan mPFC’nin bregmasına göre koordinatlar anterior-posterior + 3.1 mm, mediolateral ± 0.7 mm, dorsoventral – 4.5 mm’dir; Bu mesafeleri bregma koordinatlarından ekleyin / çıkarın (belirtildiği gibi) ve daha sonra iğneyi ön-arka ve mediolateral koordinatlara yönlendirin ve iğneyi yavaşça kafatası yüzeyine indirin.NOT: Yukarıda verilen mPFC koordinatları, 300-350 g’lık erkek lister kapüşonlu sıçanlar için uygundur; sıçan suşundaki değişiklikler, boyut bu koordinatlarda değişiklikler gerektirebilir (bkz. İğneyi kafatası yüzeyinden kaldırın ve bu noktayı ince uçlu kalıcı bir işaretleyici kalemle işaretleyin. Bu noktada stereotaksik kola monte edilmiş bir mikro matkap kullanarak bir çapak deliği açın. İğneyi önceden belirlenmiş dorsoventral koordinatta beyne yerleştirin ve önceden belirlenmiş bir hacim aşılayın (mPFC için: 300 nL). Bolusun difüzyonuna izin vermek için iğneyi yerinde 10 dakika bekletin. İğnenin çıkarılmasından sonra, iğnenin tıkanmadığından emin olmak için pompayı çalıştırın.NOT: Beyin dokusuna verilen hasarı ve virüsün iğne sistemine geri akışını en aza indirmek için iğneyi yavaşça (~ 3 mm / dak) takın ve çıkarın. Hidrasyonu korumak için 2.5 mL ısıtılmış sodyum klorür (% 0.9 w / v) ve glikoz (% 5 w / v) çözeltisini deri altından uygulayın. 1.4.12 adımını yineleyin. ikinci yarımküre için. Kafa derisi insizyonunu dikin ve prosedürün tamamlanmasından sonra, 2.5 mL sodyum klorür ve glikoz çözeltisi ve ağrı yönetimi için uygun, kurumsal olarak önerilen, analjezik (örneğin, buprenorfin veya meloksikam) uygulayın. Bilinçsizken hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Sıçanı, bilincini tamamen geri kazanana kadar ısıtılmış bir kurtarma kutusuna yerleştirin. Sadece tamamen iyileştikten sonra diğer hayvanlarla ev kafesine dönün. Viral transfekte kemirgenler için ameliyat sonrası bakım ve barınma prosedürleri için kurumsal yönergeleri izleyin. Deneye başlamadan önce opsin transgeninin yeterince ifade etmesi için en az 2 hafta bekleyin.NOT: Transdüksiyon için gereken süre, sinaptik öncesi ve sonrası bölgeler arasındaki bağlantının mesafesine ve gücüne bağlıdır. mPFC’den LEC’ye 4-6 hafta gereklidir. 2. Akut beyin dilimlerinin hazırlanması NOT: Burada, elimizde yetişkin farelerden ve sıçanlardan yüksek kaliteli kortikal, hipokampal ve talamik dilimler elde etmek için yeterli olan beyin dilimlerinin hazırlanması için basit bir yöntem açıklıyoruz. Diseksiyon için çözeltileri hazırlayın.250 mL’lik bir beheri, 25 mL sıcaklıkta 18,2 MΩ cm dirençliliğe sahip ultra saf suda (UPW) üretilen ~200 mL buz gibi soğuk sakkaroz kesme çözeltisi (189 mM sakaroz, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glukoz, 5 mM MgSO4,3 mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO4 ve 0,2 mM CaCl2ile doldurun ve25 °C’de 18,2 MΩ cm direnç gösterin veya yeterli hacim elde edin. Karbojenli kabarcık (% 95 O 2,% 5 CO2) ve buz üzerinde tutun. Bir dilim toplama odasını, karbojenle kabarcıklanmış oda sıcaklığında yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glukoz, 3 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1.25mM NaH2 PO4 ve 1 mM MgSO4) ile doldurun. Dilim toplama odası14, bir naylon ağ tabakasına yapıştırılmış ve aCSF’ye batırıldığı bir beher içine yerleştirilmiş bir mikrosantrifüj tüp rafından özel olarak yapılmıştır (Şekil 2A). 50 mL’lik bir tüpü fosfat tamponunda %4 paraformaldehit (PFA) ile doldurun (PB; 75,4 mM Na 2 HPO 4,7H 2 O ve 24,6 mM NaH2PO4). H2O).DİKKAT: PFA toksiktir. Duman davlumbazında kullanın. Beynin diseksiyonu.Solunum yavaş ve düzenli olana kadar (~ 1 Hz) sıçanı% 5 izofluran kullanarak bir indüksiyon odasında anestezi yapın. Pedal ve kornea reflekslerinin yokluğu için yeterli düzeyde anestezi testi sağlamak. Bir giyotin kullanarak hayvanın kafasını kesin. Daha önce tarif edildiği gibi tüm beyni hızla diseke edin15 ve sakkaroz kesme çözeltisine aktarın. İyi dilim kalitesi ve başarılı tüm hücre kaydı için 90 saniyelik kafa kesme adımını tamamlayın. Metal bir çay kaşığı kullanarak beyni alın, fazla kesme solüsyonunu atın ve tezgahın üstündeki bir filtre kağıdına yerleştirin. Bir neşter veya tıraş bıçağı kullanarak, beyinciği hızla çıkarın ve koronal düzlemdeki beyinciği uzunluğu boyunca yaklaşık olarak yarıya kadar kesin; arka yarısı LEC doku bloğudur. Sonraki adımlar için dilimlenecek bölgeye ek olarak bazı fazla dokuları da eklediğinizden emin olun. Hem bu doku bloğunu hem de beynin geri kalanını sakkaroz kesme çözeltisine geri döndürün. Bir vibratom doku aşamasına bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin. Önceki adımda oluşturulan doku bloğundan biraz daha büyük bir alana sahip ince bir tabakaya yayın. Bir çay kaşığı kullanarak LEC doku bloğunu alın, fazla çözeltiyi atın ve ön koronal kesim yapışacak şekilde tutkal yamasına aktarın. Aşamayı vibratom doku odasına takın ve dokuyu batırmak için hızlı bir şekilde yeterli miktarda sakkaroz kesme çözeltisi dökün; Bu çözeltiyi karbojenle kabarcıklayın. LEC doku bloğunu ventral yüzeyle bıçağa doğru yönlendirin. Ortam odası aydınlatması opsini’yi aktive etmek için yetersiz olsa da, vibratomda bulunabilecek ek ışık kaynaklarını kullanmaktan kaçının. Yüksek bıçak salınım hızı (100 Hz) ve yavaş bıçak ilerleme hızı (0,06 mm/s) kullanarak ventralden sırta 350 μm kalınlığındaki dilimleri kesin. Tipik olarak, yarımküre başına yedi LEC dilimi elde edilebilir. Dilimleri dilim toplama odasına aktarın. Dilim toplama işleminin tamamlanmasının ardından, oda sıcaklığına dönmeden önce toplama odasını 1 saat boyunca 34 °C’lik bir su banyosuna aktarın. Sürekli karbojenli kabarcık. Dilimler en az 6 saat boyunca kayıt için yeterince sağlıklı olacaktır. Enjeksiyon bölgesinin post-hoc muayenesi için beynin geri kalanını 48 saat PFA’ya yerleştirin (bkz. bölüm 4). 3. Elektrofizyoloji ve optogenetik stimülasyon Hedef hücrenin tanımlanması.Dilimi, peristaltik bir pompa tarafından 2 mL/dak hızında aCSF ile perfüze edilmiş 34 °C’de batık bir kayıt odasına yerleştirin. Bir dilim ankrajı kullanarak dilimi hareketsiz hale getirin. Eğik kızılötesi aydınlatma kullanan geniş alan mikroskobunun düşük büyütme (4x) hedefi altında, LEC katman 5’e gidin. Pial yüzeyden gerekli katmana olan mesafeyi ölçün.NOT: Eğik kızılötesi aydınlatma, kayıt odası kapak kaymasının yaklaşık 3 mm altında, kapak kaymasının düzlemine ~55°’lik bir açıyla yakın kızılötesi bir LED konumlandırılarak elde edilmiştir (Şekil 2B). Diferansiyel girişim kontrastı, dilim elektrofizyolojisi için alternatif ve yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Yüksek büyütmeli suya daldırma hedefine (40x) geçin ve piramidal nöronları tanımlayın. Bilgisayar monitöründeki hücrenin konumunu bantla işaretleyin.NOT: Piramidal nöronlar, dilimin pial yüzeyine doğru çıkıntı yapan belirgin apikal dendritlerle kabaca üçgen bir morfolojiye sahiptir (Şekil 3A). Hücre sağlığı, yoğunlaşmış, görünür bir çekirdeğin yokluğu ve pürüzsüz görünmesi gereken plazma zarının incelenmesi ile değerlendirilebilir. Aksonların opsin-florofor füzyon proteini tarafından net floresan etiketlemesinin, geniş alan floresan mikroskobu kullanıldığında görünür olması muhtemel değildir. Aksonal projeksiyonları görselleştirmek için, opsin floroforuna karşı birincil bir antikor kullanarak post-hoc immünohistokimya yapın ve aynı veya benzer dalga boyundaki bir florofora konjuge edilmiş ikincil bir antikor ile yükseltin. Tüm hücre yama kelepçesinin oluşumu.Bir pipet çektirici kullanarak bir borosilikat cam mikropipet imal edin ve filtrelenmiş hücre içi kayıt çözeltisi (120 mM k-glukonat, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA ve UPW’de yapılan %0,25 biyositin, pH 7,25, 285-300 mOsm) ile doldurun. Doldurulmuş mikropipeti, elektrot telinin hücre içi çözelti ile temas halinde olmasını sağlamak için yama kelepçeli amplifikatör baş tarafındaki elektrot tutucusuna yerleştirin. Elektrot tutucu yan portuna boru ile bağlanmış bir ağızlığa (piston çıkarılmış 1 mL’lik bir şırınga gibi) sert bir şekilde üfleyerek ağız yoluyla pozitif basınç uygulayın ve sıralı üç bir valfi kapatarak basıncı koruyun. Mikroskop hedefini bir menisküs oluşturacak şekilde yükseltin ve elektrodu mikroskopta görülene kadar menisküsün içine yerleştirin. WinLTP16’da (veya başka bir edinme yazılımı/osiloskopta) Sızdırmazlık Testi penceresini açın ve amplifikatör voltaj kelepçesi modundayken, pipet direncinin 3-6 MΩ olup olmadığını belirlemek için 5 mV’luk bir kare darbe uygulayın. Pipet ucu ile tanımlanan hücreye yaklaşın ve dokunun; bu, hücre zarında bir girinti (Şekil 3A; sağ panel) ve pipet direncinde küçük bir artışa (0.1 MΩ) neden olmalıdır. Pozitif basıncı serbest bırakın ve ağızlığa orta derecede emme uygulayarak negatif basınç uygulayın; bu, pipet direncinde büyük bir artışa neden olmalıdır (>1000 MΩ). Basınç artık nötr bırakılabilir. Hücre zarı yırtılana kadar kademeli olarak artan bir rampada, tüm hücre kapasitans geçicileri ile sonuçlanan negatif basınç uygulayın. Optogenetik olarak uyarılmış sinaptik olayları kaydedin.Akım kelepçesi yapılandırmasını girin.NOT: Çoğu durumda uzun menzilli sinaptik iletim glutamaterjiktir, bu nedenle klorür ters çevirme potansiyeline yakın membran potansiyellerinde kayıt yapmak, AMPA reseptörü (AMPAR) aracılı iletimi en iyi şekilde izole edecek ve uyarılan herhangi bir ileri besleme inhibisyonunun (FFI) ölçümünü en aza indirecektir. Klorür tersine çevrilmesi, hücre içi kayıt çözeltisinin ve aCSF’nin bileşimine bağlıdır ve Goldman-Hodgkin-Katz denklemi kullanılarak hesaplanabilir; Yukarıdaki çözümler için bu -61.3 mV idi. Katman 5 LEC piramidal nöronları ortalama dinlenme zarı potansiyeli -62 mV’a sahipti ve gerektiğinde sabit akım enjeksiyonu ile bu potansiyelde tutuldu. Alternatif olarak, hücreler istenen potansiyele voltajla kenetlenebilir. Uzun menzilli inhibitör projeksiyonları kaydetmek için16 veya FFI’yı kaydetmek için, GABAerjik klorür iletkenliğini izole etmek için katyon ters çevirme potansiyelinde voltaj kelepçesi. Membran potansiyellerinde aksiyon potansiyeli eşiğinin üzerindeki voltaj sıkıştırıcı nöronlar kullanıldığında, voltaj kelepçesini iyileştirmek ve aksiyon potansiyellerinin başlatılmasını önlemek için voltaj kapılı sodyum kanal blokerleri içeren sezyum bazlı bir hücre içi çözelti kullanılır (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 klorür,4 mM MgATP, 0.5 mM EGTA, 0.3 mM NaGTP, UPW’de yapılan% 0.25 biyositin, pH 7.25, 285-300 mOsm). Veri toplama yazılımını kullanarak, monte edilmiş 470 nm LED’i etkinleştirmek için transistör-transistör mantığı (TTL) sinyallerini bir LED sürücüsüne gönderin. Monte edilmiş LED, optogenetik uyarıcı post-sinaptik potansiyelleri (oEPSP’ler) uyandırmak için 40x hedefi aracılığıyla dilime ışık darbeleri uygulamak için filtre küpleri ve uygun optikler (Şekil 2B) kullanılarak mikroskop ışık yoluna yönlendirilir.NOT: Işık darbeleri perizomatik / dendritlerin üzerine uygulanabilir, bu da aksonlar ve presinaptik boutondaki opsinlerin aktivasyonu ile sonuçlanır veya araştırmacı, aşırı bukton stimülasyonunu önlemek için hedefi kaydedilen hücreden aksonlara hareket ettirebilir (bkz. Maksimum oEPSP genliği, sinaptik projeksiyonun gücüne, viral enjeksiyonların etkinliğine ve kullanılan opsin’e bağlıdır. oEPSP’ler, değişen ışık yoğunluğu ve / veya süresi18 ile istenen genliğe titre edilebilir; Işık darbelerinin süresini değiştirmek (maksimum LED güç çıkışında 0,2-5 ms arasında tipik süre, 4,4 mW / mm ışık yoğunluğu19 ile sonuçlanır), LED’in güç çıkışını değiştirmekten daha tutarlı oEPSP genlikleri sağlar. Farklı uyaranlar arası aralıklara sahip çoklu ışık darbelerinin trenlerini ileterek presinaptik salınım özelliklerini (voltajdaki değişim) araştırın (Şekil 3E); Optogenetik olarak uyarılmış iletimi yorumlarken dikkatli olunmalıdır (bkz. Uzun süreli plastisiteyi oEPSPs19’u tekrar tekrar uyandırarak veya ligandların uygulanmasıyla araştırın. Plastisite indüksiyonundan önce stabiliteyi sağlamak için oEPSP genliğini 5-10 dakika boyunca izleyin ve ardından kararlı bir genliğe ulaşılana kadar (tipik olarak 30-40 dakika) izleyin.NOT: Mevcut opsinlerin çoğu, LTP’yi indüklemek için tipik olarak kullanıldığı gibi, yüksek frekanslarda çoklu aksiyon potansiyellerini, örneğin 100 Hz’de verilen 100 uyaranı güvenilir bir şekilde uyandıramaz. OEPSP’lerin monosinaptik olduğunu doğrulamak için, hedefi dendritik çardak üzerine konumlandırarak ve 0.5 μM tetrodotoksin ve 100 μM aminopiridin varlığında uyararak dönüştürülmüş yolun aşırı bukon aktivasyonunu gerçekleştirin. Tetrodotoksin uygulaması, yanıtlar aksiyon potansiyeline bağımlıysa iletimi ortadan kaldıracak ve daha sonra aminopiridin dahil edilmesi, oEPSP’ler monosinaptik olarak19,20 üretilirse iletimi kısmen geri yükleyecektir. Biyositinin nöronu doldurmasına izin vermek için, tüm hücre konfigürasyonuna girdikten sonra en az 15 dakika bekleyin. Voltaj kelepçesinde, membran kapasitansını ve giriş direncini izleyin. Pipetin yaklaşma açısı boyunca yavaşça hücrenin soma’sından uzağa çekilmesi, kapasitans geçicilerinin ve membran akımının yavaş yavaş kaybolduğunu gözlemleyerek hücre zarının yeniden sızdırmazlığını ve pipet ucunda bir dış-dış yama oluşumunu gözlemleyin. Dilimin yönünü ve dilim içindeki hücrelerin konumunu not edin. Dilimi 24 delikli bir plakada PFA’ya koyun ve gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin ve ardından 0,1 M PB’ye aktarın.NOT: Dilimler bir haftaya kadar saklanabilir. Daha uzun süre depolama gerekiyorsa, PB’yi düzenli olarak değiştirin veya sodyum azid içeren PB kullanın (sodyum azidin% 0.02 -% 0.2’si). 4. Histoloji Dilimleme enjeksiyon bölgesiFiksasyonu takiben, dokuyu batana kadar PB’de% 30 sakkarozda (w / v) kriyoprotezde korur (başlangıçta sakkaroz çözeltisinde yüzer), genellikle oda sıcaklığında gece boyunca veya 4 ° C’de 24-48 saat. Optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamını kullanarak, kriyostat numune diskine bir doku bloğu takın. 4.1.3 ila 4.1.4 arasındaki adımları izleyerek doku bloğunu dondurun. İzopentanı uygun bir kaba koyun. Sadece numune diskini batırın ve dokunun isopentan seviyesinin üzerinde olmasını sağlayın. İzopentan kabını sıvı azota (veya kuru buza) indirin ve dokunun donmasına izin verin. Tamamen dondurulduktan sonra (tüm doku bloğu soluk ve sertleşir), bloğun sıcaklığının dengelenmesine izin vermek için doku bloğunu kriyostat odasında -20 ° C’de 30 dakika bekletin. Kriyostattaki 40 μm kalınlığındaki kesitleri -20 °C’de kesin. Bölümleri bıçaktan çıkarmak için ince bir boya fırçası kullanın. Dondurulmuş kesitleri oda sıcaklığında, poli-L-lizin kaplı, cam mikroskopla kaydırılan bölümlere kaydırarak yapıştırın. Her slayta yaklaşık 150 μL montaj ortamı ekleyin ve bir kapak kayması ile örtün; Kapak kapağına hafifçe bastırarak hava kabarcıklarını çıkarın. Fotobeyazlatmaya karşı korumak için kızakları örtün ve oda sıcaklığında en az 12 saat (veya gece boyunca) hava ile kurutun. Bir floresan mikroskobu kullanarak, viral enjeksiyon bölgesinin yerini inceleyin. Biyositin boyama protokolüNOT: Bu protokol kalın bölümlere uygulanabilir; dilimlerin yeniden bölümlenmesine gerek yoktur.Beyin dilimlerini fosfat tamponlu salin (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 ve 1.8 mM KH2PO4) ile yıkama başına 10 dakika boyunca altı kez yıkayın. Her adımdan sonra kuyucukları boşaltmak için bir transfer pipeti kullanın. Herhangi bir endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için dilimleri PBS’de%3 H 2O2 (w / v) içinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu oksijen kabarcıkları oluşturur. Beyin dilimlerini PBS ile yıkama başına 10 dakika boyunca veya daha fazla oksijen kabarcığı görünmeyene kadar altı kez yıkayın. Beyin dilimlerini, 3 saat boyunca oda sıcaklığında% 0.1 (v / v) Triton X-100 içeren% 1 (v / v) avidin-biyotinile HRP kompleksi (ABC) çözeltisinde inkübe edin. Beyin dilimlerini PBS ile yıkama başına 10 dakika boyunca altı kez yıkayın. Her dilimi 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) çözeltisinde, nöronal yapıların biyositin boyaması görünür hale gelene kadar birkaç dakika boyunca inkübe edin (yaklaşık 5-10 dakika sürer).DİKKAT: DAB toksiktir. Duman davlumbazında kullanın.NOT: DAB inkübasyon süreleri tahmin edilemez olabilir, renk geliştikçe dokuyu yakından izleyin. Dilimleri soğuk (4 °C) PBS’ye aktararak reaksiyonu durdurun. Beyin dilimlerini PBS ile yıkama başına 10 dakika boyunca altı kez yıkayın. Beyin dilimlerini poli-L-lizin kaplı cam mikroskop slaytlarına monte etmek için bir fırça kullanın. Tüm fazla PBS’yi temiz bir doku ile çıkarın. Her dilimi yaklaşık 200 μL montaj ortamı ile örtün; kapak kapaklarıyla örtün ve hava kabarcıklarını dışarı itmek için kapak kapağına hafifçe bastırın. Oda sıcaklığında en az 12 saat (veya gece boyunca) hava ile kurulayın. Bir ışık mikroskobu kullanarak, hücrelerin yerini ve morfolojik ayrıntılarını inceleyin.NOT: Biyositin alternatif olarak florofor konjuge streptavidin kullanılarak görselleştirilebilir; Bununla birlikte, görüntüleme rezeksiyon veya konfokal mikroskop kullanımı gerektirebilir21.

Representative Results

Bu protokolde, optogenetik yapıların viral iletimini kullanarak uzun menzilli sinaptik fizyoloji ve plastisitenin nasıl çalışılacağını açıklıyoruz. Protokol, beyindeki hemen hemen her türlü uzun menzilli bağlantıyı incelemek için çok kolay bir şekilde uyarlanabilir. Örnek olarak, bir opsini sıçan mPFC’sine kodlayan AAV’lerin enjeksiyonunu, LEC’den akut dilimlerin hazırlanmasını, katman 5 LEC piramidal nöronlarından yama-kelepçe kayıtlarını ve LEC’deki mPFC terminallerinin ışıkla uyarı…

Discussion

Burada sunulan protokol, optogenetik yapıları kodlayan AAV’leri ve akut beyin dilimlerinde elektrofizyolojiyi sunmak için stereotaksik cerrahinin bir kombinasyonunu kullanarak oldukça spesifik uzun menzilli sinaptik projeksiyonları keşfetmek için bir yöntemi açıklamaktadır (Şekil 1). Bu teknikler birlikte, daha önce geleneksel, spesifik olmayan, elektriksel stimülasyon kullanılarak erişilemeyen uzun menzilli ve anatomik olarak dağınık yollarda beyin devresinin fizyolojisin…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Wellcome hibe 206401/Z/17/Z tarafından desteklenmektedir. Zafar Beşir’e uzman mentorluğu için ve Dr. Clair Booth’a teknik yardım ve makale hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz.

Materials

0.2 mL tube Fisher Scientific Ltd 12134102
10 µL pipette Gilson FD10001
24 well plate SARSTEDT 83.3922
3 way luer valve Cole-Parmer WZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate Vector Laboratories SK-4105
40x objective Olympus LUMPLFLN40XW
4-aminopyridine Hello Bio HB1073
4x objective Olympus PLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry Addgene 35512 Viral titre: 3.3×1013 GC/ml
Achromatic lens Edmund Optics 49363 Focusses visual spectrum and near-IR
Benchtop microcentrifuge Benchmark Scientific C1005*
Biocytin Sigma-Aldrich B4261
Borosillicate glass capillary Warner Instruments G150F-6
Burr Fine science tools 19008-07
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
Camera – Qimaging Retiga Electro Photometrics 01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol Tocris 2810
Chlorhexidine surgical scrub Vetasept XHG008
Clippers Andis 22445 AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper
Collimation condenser lens ThorLabs ACL2520-A
Coverslips Fisher Scientific Ltd 10011913
Cryostat Leica CM3050 S
CsMeSO4 Sigma-Aldrich C1426
Cyanoacrylate glue Rapid Electronics Ltd 84-4557
Data acquisition device National Instruments USB-6341 BNC
D-glucose Sigma-Aldrich G8270
Dichroic mirror 500 nm long-pass Edmund Optics 69899
Dichroic mirror 600 nm long-pass Edmund Optics 69901
Dichroic mirror cube ThorLabs CM1-DCH/M
EGTA Millpore 324626
Electrode holder with side port HEKA 895150
Emission filter Chroma 59022m
Excitation filter Chroma ET570/20x
Eye gel Dechra Lubrithal
Fine paint brush Scientific Laboratory Supplies BRU2052
Guillotine World Precision Instruments DCAP
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroxide solution Sigma-Aldrich H1009 30% (w/w)
Isoflurane Henry Schein 988-3245
Isopentane Sigma-Aldrich M32631
KCl Sigma-Aldrich P3911
k-gluconate Sigma-Aldrich G4500
Kinematic fluorescence filter cube ThorLabs DFM1T1
LED driver ThorLabs LEDD1B
Lidocaine ointment Teva 80007150
MgATP Sigma-Aldrich A9187
MgCl Sigma-Aldrich M2670
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Micro drill Harvard Apparatus 75-1887
Microelectrode puller Sutter instruments P-87
Microinjection syringe Hamilton 7634-01/00
Microinjection syringe needle Hamilton 7803-05 Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12°
Microinjection syringe pump World Precision Instruments UMP3T-1
Mounted blue LED ThorLabs M470L5
Mounted green LED ThorLabs M565L3
Na2HPO4.7H2O Sigma-Aldrich S9390
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
NaH2PO4.H2O Sigma-Aldrich S9638
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761
NIR LED OSRAM SFH4550 Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method
OCT medium VWR International RAYLLAMB/OCT Optimal cutting temperature medium
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Patch clamp amplifier Molecular Devices 700A
Peristaltic pump World Precision Instruments Ministar
Poly-L-lysine coated microscope slides Fisher Scientific Ltd 23-769-310
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Scalpel blade Swann Morton #24
Slice anchor Warner Instruments SHD-26-GH/15
Stereotaxic frame Kopf Model 902
Stereotaxic holder for micro drill Harvard Apparatus 75-1874
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Surgical Microscope Carl Zeiss OPMI 1 FR pro
Suture Ethicon W577H
Syringe filter for intracellular recording solution Thermo Scientific Nalgene 171-0020
Tetrodotoxin citrate Hello Bio HB1035
Transfer pipettes Fisher Scientific Ltd 10458842
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Upright fluorescence microscope Leica DM6 B
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kit Vector Laboratories PK-4000
Vibratome Campden Instruments 7000smz-2
WinLTP https://www.winltp.com/ Version 2.32 Data acquisition software
Solution
aCSF
sucrose cutting solution
PFA
Intracellular?

Referanslar

  1. Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).
  2. Poorthuis, R. B., et al. Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors. Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).
  3. Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nature Communications. 10 (1), 4174 (2019).
  4. Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
  5. Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons. Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).
  6. Whitaker, L. R., et al. Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning. Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).
  7. Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).
  8. van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).
  9. Cruikshank, S. J., et al. Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex. Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).
  10. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  11. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  12. Berndt, A., et al. High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).
  13. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).
  14. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).
  15. Booker, S. A. Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).
  16. Anderson, W. W., Collingridge, G. L. Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions. Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).
  17. Basu, J., et al. Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science. 351 (6269), (2016).
  18. Zhang, Y. P., Oertner, T. G. Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).
  19. Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus. Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).
  20. Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
  21. Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).
  22. Jones, B. F., Witter, M. P. Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat. Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).
  23. Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex. Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).
  24. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).
  25. Mattis, J., et al. Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins. Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).
  26. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
  27. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  28. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  29. Marshel, J. H., et al. Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception. Science. 365 (6453), (2019).
  30. Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport. Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).
  31. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PLoS One. 8 (9), 76310 (2013).
  32. Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Nörobilim. 161 (2), 441-450 (2009).
  33. Dimidschstein, J., et al. A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species. Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).
  34. Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6 (2020).
  35. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn. , (2013).
  36. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn. , (2019).
  37. Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
  38. Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission. Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).
  39. Xia, S. H., et al. Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses. Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).
  40. Anisimova, M., et al. Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality. BioRxiv. , (2021).
  41. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Kinnavane, L., Banks, P. J. Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex. J. Vis. Exp. (180), e63077, doi:10.3791/63077 (2022).

View Video