Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Özet

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Özet

Beyindeki belirli sinapsların fizyolojik özelliklerini ve plastik değişikliklere nasıl maruz kaldıklarını incelemek, modern sinirbilimde önemli bir zorluktur. Geleneksel in vitro elektrofizyolojik teknikler, sinaptik iletimi uyandırmak için elektriksel stimülasyon kullanır. Bu yöntemin en büyük dezavantajı, spesifik olmayan doğasıdır; uyarıcı elektrot bölgesindeki tüm aksonlar aktive edilecek ve bu da belirli bir afferent bağlantıya bir etki atfetmeyi zorlaştıracaktır. Bu sorun, elektriksel stimülasyonun optogenetik temelli stimülasyonla değiştirilmesiyle aşılabilir. Optogenetiği in vitro yama-kelepçe kayıtlarıyla birleştirmek için bir yöntem tanımladık. Bu, anatomik olarak tanımlanmış hassas sinaptik bağlantıların hem bazal sinaptik iletiminin hem de sinaptik plastisitesinin incelenmesi için güçlü bir araçtır ve beyindeki hemen hemen her yola uygulanabilir. Burada, kemirgen beynindeki pre-sinaptik bir bölgeye (medial prefrontal korteks) cerrahi enjeksiyon için kanalrodopsin proteinini kodlayan bir viral vektörün hazırlanmasını ve işlenmesini ve aşağı akış hedef bölgelerinin (lateral entorinal korteks) akut dilimlerinin oluşturulmasını açıklıyoruz. Kısa ve uzun süreli sinaptik plastisiteyi incelemek için yama-kelepçe kayıtlarını ışık stimülasyonu ile sinaptik aktivasyonla birleştirmek için ayrıntılı bir prosedür de sunulmaktadır. Optogenetik ve Cre-bağımlı hücre etiketlemesini birleştirerek yol ve hücre özgüllüğünü sağlayan deney örneklerini tartışıyoruz. Son olarak, ilgilenilen sinaptik öncesi bölgenin histolojik doğrulaması, kesin konumun ve hücre tipinin daha fazla tanımlanmasına izin vermek için post-sinaptik hücrenin biyositin etiketlemesi ile birlikte açıklanmaktadır.

Giriş

Sinapsların fizyolojisini ve plastik değişikliklere nasıl uğradıklarını anlamak, beyin ağlarının sağlıklı beyinde nasıl çalıştığını anlamak için esastır¹ ve beyin bozukluklarında nasıl arızalandıklarını anlamak için temeldir. Akut ex vivo beyin dilimlerinin kullanılması, tüm hücre yama-kelepçe kayıtları kullanılarak tek nöronlardan sinapsların elektriksel aktivitesinin yüksek sinyal-gürültü oranıyla kaydedilmesini sağlar. Membran potansiyelinin kontrolü ve basit farmakolojik manipülasyon, reseptör alt tiplerinin izolasyonuna izin verir. Bu kayıtlar, laminer ve alt bölgesel pozisyon², hücresel morfoloji³, moleküler belirteçlerin varlığı⁴, afferent projeksiyonları⁵ veya yakın zamanda aktif olsa bile⁶ dahil olmak üzere post-sinaptik nöronu tanımlamak için mükemmel bir özgüllükle yapılabilir.

Bununla birlikte, sinaptik öncesi girdilerin özgüllüğünü elde etmek biraz daha zordur. Geleneksel yöntem, belirli bir laminada çalışan aksonları uyarmak için stimülasyon elektrotları kullanmıştır. Bunun bir örneği, stratum radiatumdaki lokal stimülasyonun, CA3'ten CA1 alt alanı^7'ye yansıyan sinapsları aktive ettiği hipokampustadır. Bu örnekte, CA3 girişi, CA1 piramidal hücrelere⁸ yansıyan stratum radyatumunda bulunan tek uyarıcı girişi temsil ettiği için presinaptik özgüllük elde edilir. Bununla birlikte, CA3-CA1 eksenlerinin geleneksel elektriksel presinaptik aktivasyonu ile elde edilebilen bu yüksek giriş özgüllüğü derecesi, bu sinapsın maruz kaldığı yoğun çalışmaya yansıyan bir istisnadır. Diğer beyin bölgelerinde, çoklu afferent yollardan gelen aksonlar aynı laminada, örneğin neokorteks^9'un 1. tabakasında bir arada bulunur, böylece geleneksel uyarıcı elektrotlarla girişe özgü presinaptik stimülasyonu imkansız hale getirir. Farklı sinaptik girdiler farklı fizyolojik özelliklere sahip olabileceğinden bu sorunludur; bu nedenle, birlikte stimülasyonları sinaptik fizyolojinin yanlış karakterize edilmesine yol açabilir.

Optogenetiğin ortaya çıkışı, channelrhodopsin-2 (ChR2) gibi ışığa duyarlı membran proteinlerinin (opsinler) genetik kodlaması, beyin bölgeleri^10,11 arasındaki izole sinaptik projeksiyonları incelemek için olasılıkların geniş bir genişlemesine izin ^vermiştir. Burada, uzun menzilli sinaptik fizyoloji ve plastisiteyi incelemek için genelleştirilebilir ve düşük maliyetli bir çözümü açıklıyoruz. Optogenetik yapılar, ilgilenilen sinaptik öncesi bölgenin son derece hassas kontrolüne izin veren viral vektörler kullanılarak oldukça spesifik bir şekilde teslim edilir. Efferent projeksiyonları, bu liflerin bir hedef bölgede aktivasyonuna izin veren ışıkla aktive edilen kanalı ifade edecektir. Böylece, geleneksel, spesifik olmayan, elektriksel stimülasyon ile bağımsız olarak aktive edilemeyen uzun menzilli, anatomik olarak dağınık yollar incelenebilir.

Örnek bir yol olarak, medial prefrontal korteksin (mPFC) uyarıcı katyon kanallı opsinleri kodlayan adeno ilişkili virüslerle (AAV'ler) transdüksiyonunu tanımladık. Daha sonra lateral entorinal korteksten (LEC) akut dilimlerin hazırlanmasını, katman 5 LEC piramidal nöronlarından yama-kelepçe kayıtlarını ve glutamaterjik mPFC-LEC projeksiyonlarının ışıkla uyarılmış aktivasyonunu tanımladık (Şekil 1). Ayrıca, pre-sinaptik bölgenin yerini doğrulamak ve post-sinaptik hücre morfolojisinin tanımlanmasını doğrulamak için enjeksiyon bölgesinin histolojik değerlendirmesini de açıklayacağız.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Birleşik Krallık Hayvanlar Bilimsel Prosedürler Yasası (1986) ve ilgili kılavuzların yanı sıra yerel kurumsal yönergelere uygun olarak yürütülmüştür.

1. Stereotaksik viral enjeksiyon

NOT: Mevcut protokol anatomik gerektirir, ancak sinaptik hücre sonrası hücre tipi değil, özgüllük gerektirir.

1. Uygun hayvanı seçin. Bu protokolde erkek vahşi tip Lister kapüşonlu sıçanlar kullanıldı (300-350 g, yaklaşık 3 aylık).
2. Uygun viral yapıyı seçin. Göz önünde bulundurulması gereken birkaç faktör vardır (bkz. Mevcut protokol, uyarıcı nöronları (AAV9 - CaMKIIa - ChR2 (^{E123T / T159C}) - mCherry; titre: 3.3 x 10 13 viral genom / mL) dönüştürmek için optogenetik kanal ChETA_TC 12'yi eksprese etmek için bir virüs kullanır.
3. Daha önce tarif edildiği gibi bir beyin atlası kullanarak enjeksiyonun koordinatlarını ve hacmini belirleyin³⁵.
4. Viral preparatın stereotaksik enjeksiyonu
   NOT: Hayvanların kullanımı ve bakımı ile ilgili tüm ulusal ve kurumsal kılavuzlara uyulmalıdır. Viral vektörler daha önce tarif edildiği gibi stereotaksik olarak enjekte edilir¹³ aşağıdaki değişikliklerle.
   1. Anestezi ve hayvanın hazırlanması sırasında viral preparatı buz üzerinde tutun.
   2. % 4 izofluran içeren bir anestezik indüksiyon odasında anesteziyi indükleyin. Daha yavaş düzenli solunum hızı (1 Hz) ve pedal ve kornea reflekslerinin yokluğu ile belirtilen anestezi seviyesini izleyin (sırasıyla ayak parmaklarını sıkıştırarak ve gözün köşesine hafifçe dokunarak test edin; yanıt tespit edilmemelidir).
   3. İnvaziv prosedürden en az 30 dakika önce meloksikam gibi ameliyat öncesi analjezik uygulayın.
   4. Hayvan tamamen anestezi altına alındığında, kürkü kafa derisinden çıkarmak için makas kullanın. İzofluran akışını stereotaksik çerçevenin burun konisine geçirin ve sıçanı çerçeveye monte edin. İşlem sırasında kuruluğu önlemek için gözlere yağlayıcı göz jeli uygulayın.
   5. Ameliyat aseptik koşullarda yapılmalıdır. İşlem boyunca steril eldivenler ve aletler kullanın. Kafa derisini% 4 w / v klorheksidin çözeltisi ile dezenfekte etmeden önce lidokain merhem (% 5 w / w) uygulayın ve ardından vücudu steril bir örtü ile örtün. Bir neşter kullanarak, bregmayı ortaya çıkarmak için kafa derisi üzerinde yaklaşık 15 mm uzunluğunda uzunlamasına bir kesi yapın.
   6. Bir Hamilton şırıngasını, stereotaksik çerçeveye monte edilmiş hareketli bir kola bağlı bir mikroenjeksiyon şırınga pompasına yükleyin.
   7. Virüsün 5 μL'lik bir alikotunu 0.2 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve tüm hacim tüpün dibinde olana kadar birkaç saniye döndürün. Pipet, tüpün kapağına viral preparatın 2 μL'sini verir.
   8. Önce iğne ucunu cerrahi mikroskopla görüntüleyerek şırıngayı viral preparatla doldurun ve ardından virüsün bolusunu manuel olarak iğnenin ucuna yerleştirin ve pompa kontrollerini kullanarak şırınga pistonunu geri çekin.
   9. Pompa enjeksiyon hacmini 300 nL'ye ve akış hızını 100 nL/dk'ya ayarlayın. Pompayı çalıştırın ve iğne ucundaki virüs damlacığını gözlemleyerek doğru akışı onaylayın. Virüsü bir pamuk tomurcuğu üzerinde emin ve iğneyi% 70 etanol ile nazikçe temizleyin.
   10. Stereotaksik çerçeve üzerindeki ayarlayıcı vidaları kullanarak iğne ucunu bregmaya (kafatası üzerinde koronal ve sagital sütürlerin buluştuğu nokta) yönlendirin ve çerçeve üzerindeki üç vernier ölçeğinde gözlenen stereotaksik ölçümleri not alın. Sıçan mPFC'nin bregmasına göre koordinatlar anterior-posterior + 3.1 mm, mediolateral ± 0.7 mm, dorsoventral - 4.5 mm'dir; Bu mesafeleri bregma koordinatlarından ekleyin / çıkarın (belirtildiği gibi) ve daha sonra iğneyi ön-arka ve mediolateral koordinatlara yönlendirin ve iğneyi yavaşça kafatası yüzeyine indirin.
       NOT: Yukarıda verilen mPFC koordinatları, 300-350 g'lık erkek lister kapüşonlu sıçanlar için uygundur; sıçan suşundaki değişiklikler, boyut bu koordinatlarda değişiklikler gerektirebilir (bkz.
   11. İğneyi kafatası yüzeyinden kaldırın ve bu noktayı ince uçlu kalıcı bir işaretleyici kalemle işaretleyin. Bu noktada stereotaksik kola monte edilmiş bir mikro matkap kullanarak bir çapak deliği açın.
   12. İğneyi önceden belirlenmiş dorsoventral koordinatta beyne yerleştirin ve önceden belirlenmiş bir hacim aşılayın (mPFC için: 300 nL). Bolusun difüzyonuna izin vermek için iğneyi yerinde 10 dakika bekletin. İğnenin çıkarılmasından sonra, iğnenin tıkanmadığından emin olmak için pompayı çalıştırın.
       NOT: Beyin dokusuna verilen hasarı ve virüsün iğne sistemine geri akışını en aza indirmek için iğneyi yavaşça (~ 3 mm / dak) takın ve çıkarın.
   13. Hidrasyonu korumak için 2.5 mL ısıtılmış sodyum klorür (% 0.9 w / v) ve glikoz (% 5 w / v) çözeltisini deri altından uygulayın.
   14. 1.4.12 adımını yineleyin. ikinci yarımküre için.
   15. Kafa derisi insizyonunu dikin ve prosedürün tamamlanmasından sonra, 2.5 mL sodyum klorür ve glikoz çözeltisi ve ağrı yönetimi için uygun, kurumsal olarak önerilen, analjezik (örneğin, buprenorfin veya meloksikam) uygulayın. Bilinçsizken hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Sıçanı, bilincini tamamen geri kazanana kadar ısıtılmış bir kurtarma kutusuna yerleştirin. Sadece tamamen iyileştikten sonra diğer hayvanlarla ev kafesine dönün.
   16. Viral transfekte kemirgenler için ameliyat sonrası bakım ve barınma prosedürleri için kurumsal yönergeleri izleyin. Deneye başlamadan önce opsin transgeninin yeterince ifade etmesi için en az 2 hafta bekleyin.
       NOT: Transdüksiyon için gereken süre, sinaptik öncesi ve sonrası bölgeler arasındaki bağlantının mesafesine ve gücüne bağlıdır. mPFC'den LEC'ye 4-6 hafta gereklidir.

2. Akut beyin dilimlerinin hazırlanması

NOT: Burada, elimizde yetişkin farelerden ve sıçanlardan yüksek kaliteli kortikal, hipokampal ve talamik dilimler elde etmek için yeterli olan beyin dilimlerinin hazırlanması için basit bir yöntem açıklıyoruz.

1. Diseksiyon için çözeltileri hazırlayın.
   1. 250 mL'lik bir beheri, 25 mL sıcaklıkta 18,2 MΩ cm dirençliliğe sahip ultra saf suda (UPW) üretilen ~200 mL buz gibi soğuk sakkaroz kesme çözeltisi (189 mM sakaroz, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glukoz, 5 mM MgSO₄,₃ mM KCl, 1,25 mM NaH 2 PO₄ ve 0,2 mM CaCl₂ile doldurun ve₂₅ °C'de 18,2 MΩ cm direnç gösterin veya yeterli hacim elde edin. Karbojenli kabarcık (% 95 O 2,% 5 CO₂) ve buz üzerinde tutun.
   2. Bir dilim toplama odasını, karbojenle kabarcıklanmış oda sıcaklığında yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF; 124 mM NaCl, 26 mM NaHCO 3, 10 mM D-glukoz, 3 mM KCl, 2 mM CaCl_{2, 1.25}mM NaH₂ PO₄ ve 1 mM MgSO₄) ile doldurun. Dilim toplama odası¹⁴, bir naylon ağ tabakasına yapıştırılmış ve aCSF'ye batırıldığı bir beher içine yerleştirilmiş bir mikrosantrifüj tüp rafından özel olarak yapılmıştır (Şekil 2A).
   3. 50 mL'lik bir tüpü fosfat tamponunda %4 paraformaldehit (PFA) ile doldurun (PB; 75,4 mM Na 2 HPO 4,7H 2 O ve 24,6 mM NaH₂PO₄). H₂O).
      DİKKAT: PFA toksiktir. Duman davlumbazında kullanın.
2. Beynin diseksiyonu.
   1. Solunum yavaş ve düzenli olana kadar (~ 1 Hz) sıçanı% 5 izofluran kullanarak bir indüksiyon odasında anestezi yapın. Pedal ve kornea reflekslerinin yokluğu için yeterli düzeyde anestezi testi sağlamak.
   2. Bir giyotin kullanarak hayvanın kafasını kesin.
   3. Daha önce tarif edildiği gibi tüm beyni hızla diseke edin¹⁵ ve sakkaroz kesme çözeltisine aktarın. İyi dilim kalitesi ve başarılı tüm hücre kaydı için 90 saniyelik kafa kesme adımını tamamlayın.
   4. Metal bir çay kaşığı kullanarak beyni alın, fazla kesme solüsyonunu atın ve tezgahın üstündeki bir filtre kağıdına yerleştirin.
   5. Bir neşter veya tıraş bıçağı kullanarak, beyinciği hızla çıkarın ve koronal düzlemdeki beyinciği uzunluğu boyunca yaklaşık olarak yarıya kadar kesin; arka yarısı LEC doku bloğudur. Sonraki adımlar için dilimlenecek bölgeye ek olarak bazı fazla dokuları da eklediğinizden emin olun. Hem bu doku bloğunu hem de beynin geri kalanını sakkaroz kesme çözeltisine geri döndürün.
   6. Bir vibratom doku aşamasına bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin. Önceki adımda oluşturulan doku bloğundan biraz daha büyük bir alana sahip ince bir tabakaya yayın.
   7. Bir çay kaşığı kullanarak LEC doku bloğunu alın, fazla çözeltiyi atın ve ön koronal kesim yapışacak şekilde tutkal yamasına aktarın.
   8. Aşamayı vibratom doku odasına takın ve dokuyu batırmak için hızlı bir şekilde yeterli miktarda sakkaroz kesme çözeltisi dökün; Bu çözeltiyi karbojenle kabarcıklayın. LEC doku bloğunu ventral yüzeyle bıçağa doğru yönlendirin. Ortam odası aydınlatması opsini'yi aktive etmek için yetersiz olsa da, vibratomda bulunabilecek ek ışık kaynaklarını kullanmaktan kaçının.
   9. Yüksek bıçak salınım hızı (100 Hz) ve yavaş bıçak ilerleme hızı (0,06 mm/s) kullanarak ventralden sırta 350 μm kalınlığındaki dilimleri kesin. Tipik olarak, yarımküre başına yedi LEC dilimi elde edilebilir.
   10. Dilimleri dilim toplama odasına aktarın. Dilim toplama işleminin tamamlanmasının ardından, oda sıcaklığına dönmeden önce toplama odasını 1 saat boyunca 34 °C'lik bir su banyosuna aktarın. Sürekli karbojenli kabarcık. Dilimler en az 6 saat boyunca kayıt için yeterince sağlıklı olacaktır.
   11. Enjeksiyon bölgesinin post-hoc muayenesi için beynin geri kalanını 48 saat PFA'ya yerleştirin (bkz. bölüm 4).

3. Elektrofizyoloji ve optogenetik stimülasyon

1. Hedef hücrenin tanımlanması.
   1. Dilimi, peristaltik bir pompa tarafından 2 mL/dak hızında aCSF ile perfüze edilmiş 34 °C'de batık bir kayıt odasına yerleştirin. Bir dilim ankrajı kullanarak dilimi hareketsiz hale getirin.
   2. Eğik kızılötesi aydınlatma kullanan geniş alan mikroskobunun düşük büyütme (4x) hedefi altında, LEC katman 5'e gidin. Pial yüzeyden gerekli katmana olan mesafeyi ölçün.
      NOT: Eğik kızılötesi aydınlatma, kayıt odası kapak kaymasının yaklaşık 3 mm altında, kapak kaymasının düzlemine ~55°'lik bir açıyla yakın kızılötesi bir LED konumlandırılarak elde edilmiştir (Şekil 2B). Diferansiyel girişim kontrastı, dilim elektrofizyolojisi için alternatif ve yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme tekniğidir.
   3. Yüksek büyütmeli suya daldırma hedefine (40x) geçin ve piramidal nöronları tanımlayın. Bilgisayar monitöründeki hücrenin konumunu bantla işaretleyin.
      NOT: Piramidal nöronlar, dilimin pial yüzeyine doğru çıkıntı yapan belirgin apikal dendritlerle kabaca üçgen bir morfolojiye sahiptir (Şekil 3A). Hücre sağlığı, yoğunlaşmış, görünür bir çekirdeğin yokluğu ve pürüzsüz görünmesi gereken plazma zarının incelenmesi ile değerlendirilebilir. Aksonların opsin-florofor füzyon proteini tarafından net floresan etiketlemesinin, geniş alan floresan mikroskobu kullanıldığında görünür olması muhtemel değildir. Aksonal projeksiyonları görselleştirmek için, opsin floroforuna karşı birincil bir antikor kullanarak post-hoc immünohistokimya yapın ve aynı veya benzer dalga boyundaki bir florofora konjuge edilmiş ikincil bir antikor ile yükseltin.
2. Tüm hücre yama kelepçesinin oluşumu.
   1. Bir pipet çektirici kullanarak bir borosilikat cam mikropipet imal edin ve filtrelenmiş hücre içi kayıt çözeltisi (120 mM k-glukonat, 40 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM NaCl, 2 mM MgATP, 1 mM MgCl, 0,3 mM NaGTP, 0,2 mM EGTA ve UPW'de yapılan %0,25 biyositin, pH 7,25, 285-300 mOsm) ile doldurun. Doldurulmuş mikropipeti, elektrot telinin hücre içi çözelti ile temas halinde olmasını sağlamak için yama kelepçeli amplifikatör baş tarafındaki elektrot tutucusuna yerleştirin.
   2. Elektrot tutucu yan portuna boru ile bağlanmış bir ağızlığa (piston çıkarılmış 1 mL'lik bir şırınga gibi) sert bir şekilde üfleyerek ağız yoluyla pozitif basınç uygulayın ve sıralı üç bir valfi kapatarak basıncı koruyun. Mikroskop hedefini bir menisküs oluşturacak şekilde yükseltin ve elektrodu mikroskopta görülene kadar menisküsün içine yerleştirin.
   3. WinLTP^16'da (veya başka bir edinme yazılımı/osiloskopta) Sızdırmazlık Testi penceresini açın ve amplifikatör voltaj kelepçesi modundayken, pipet direncinin 3-6 MΩ olup olmadığını belirlemek için 5 mV'luk bir kare darbe uygulayın.
   4. Pipet ucu ile tanımlanan hücreye yaklaşın ve dokunun; bu, hücre zarında bir girinti (Şekil 3A; sağ panel) ve pipet direncinde küçük bir artışa (0.1 MΩ) neden olmalıdır.
   5. Pozitif basıncı serbest bırakın ve ağızlığa orta derecede emme uygulayarak negatif basınç uygulayın; bu, pipet direncinde büyük bir artışa neden olmalıdır (>1000 MΩ). Basınç artık nötr bırakılabilir. Hücre zarı yırtılana kadar kademeli olarak artan bir rampada, tüm hücre kapasitans geçicileri ile sonuçlanan negatif basınç uygulayın.
3. Optogenetik olarak uyarılmış sinaptik olayları kaydedin.
   1. Akım kelepçesi yapılandırmasını girin.
      NOT: Çoğu durumda uzun menzilli sinaptik iletim glutamaterjiktir, bu nedenle klorür ters çevirme potansiyeline yakın membran potansiyellerinde kayıt yapmak, AMPA reseptörü (AMPAR) aracılı iletimi en iyi şekilde izole edecek ve uyarılan herhangi bir ileri besleme inhibisyonunun (FFI) ölçümünü en aza indirecektir. Klorür tersine çevrilmesi, hücre içi kayıt çözeltisinin ve aCSF'nin bileşimine bağlıdır ve Goldman-Hodgkin-Katz denklemi kullanılarak hesaplanabilir; Yukarıdaki çözümler için bu -61.3 mV idi. Katman 5 LEC piramidal nöronları ortalama dinlenme zarı potansiyeli -62 mV'a sahipti ve gerektiğinde sabit akım enjeksiyonu ile bu potansiyelde tutuldu. Alternatif olarak, hücreler istenen potansiyele voltajla kenetlenebilir. Uzun menzilli inhibitör projeksiyonları kaydetmek için¹⁶ veya FFI'yı kaydetmek için, GABAerjik klorür iletkenliğini izole etmek için katyon ters çevirme potansiyelinde voltaj kelepçesi. Membran potansiyellerinde aksiyon potansiyeli eşiğinin üzerindeki voltaj sıkıştırıcı nöronlar kullanıldığında, voltaj kelepçesini iyileştirmek ve aksiyon potansiyellerinin başlatılmasını önlemek için voltaj kapılı sodyum kanal blokerleri içeren sezyum bazlı bir hücre içi çözelti kullanılır (130 mM CsMeSO 4, 10 mM HEPES, 8 mM NaCl, 5 mM QX 314 klorür,₄ mM MgATP, 0.5 mM EGTA, 0.3 mM NaGTP, UPW'de yapılan% 0.25 biyositin, pH 7.25, 285-300 mOsm).
   2. Veri toplama yazılımını kullanarak, monte edilmiş 470 nm LED'i etkinleştirmek için transistör-transistör mantığı (TTL) sinyallerini bir LED sürücüsüne gönderin. Monte edilmiş LED, optogenetik uyarıcı post-sinaptik potansiyelleri (oEPSP'ler) uyandırmak için 40x hedefi aracılığıyla dilime ışık darbeleri uygulamak için filtre küpleri ve uygun optikler (Şekil 2B) kullanılarak mikroskop ışık yoluna yönlendirilir.
      NOT: Işık darbeleri perizomatik / dendritlerin üzerine uygulanabilir, bu da aksonlar ve presinaptik boutondaki opsinlerin aktivasyonu ile sonuçlanır veya araştırmacı, aşırı bukton stimülasyonunu önlemek için hedefi kaydedilen hücreden aksonlara hareket ettirebilir (bkz. Maksimum oEPSP genliği, sinaptik projeksiyonun gücüne, viral enjeksiyonların etkinliğine ve kullanılan opsin'e bağlıdır. oEPSP'ler, değişen ışık yoğunluğu ve / veya süresi¹⁸ ile istenen genliğe titre edilebilir; Işık darbelerinin süresini değiştirmek (maksimum LED güç çıkışında 0,2-5 ms arasında tipik süre, 4,4 mW / mm ışık yoğunluğu¹⁹ ile sonuçlanır), LED'in güç çıkışını değiştirmekten daha tutarlı oEPSP genlikleri sağlar.
   3. Farklı uyaranlar arası aralıklara sahip çoklu ışık darbelerinin trenlerini ileterek presinaptik salınım özelliklerini (voltajdaki değişim) araştırın (Şekil 3E); Optogenetik olarak uyarılmış iletimi yorumlarken dikkatli olunmalıdır (bkz.
   4. Uzun süreli plastisiteyi oEPSPs^19'u tekrar tekrar uyandırarak veya ligandların uygulanmasıyla araştırın. Plastisite indüksiyonundan önce stabiliteyi sağlamak için oEPSP genliğini 5-10 dakika boyunca izleyin ve ardından kararlı bir genliğe ulaşılana kadar (tipik olarak 30-40 dakika) izleyin.
      NOT: Mevcut opsinlerin çoğu, LTP'yi indüklemek için tipik olarak kullanıldığı gibi, yüksek frekanslarda çoklu aksiyon potansiyellerini, örneğin 100 Hz'de verilen 100 uyaranı güvenilir bir şekilde uyandıramaz.
   5. OEPSP'lerin monosinaptik olduğunu doğrulamak için, hedefi dendritik çardak üzerine konumlandırarak ve 0.5 μM tetrodotoksin ve 100 μM aminopiridin varlığında uyararak dönüştürülmüş yolun aşırı bukon aktivasyonunu gerçekleştirin. Tetrodotoksin uygulaması, yanıtlar aksiyon potansiyeline bağımlıysa iletimi ortadan kaldıracak ve daha sonra aminopiridin dahil edilmesi, oEPSP'ler monosinaptik olarak^19,20 üretilirse iletimi kısmen geri yükleyecektir.
   6. Biyositinin nöronu doldurmasına izin vermek için, tüm hücre konfigürasyonuna girdikten sonra en az 15 dakika bekleyin. Voltaj kelepçesinde, membran kapasitansını ve giriş direncini izleyin.
   7. Pipetin yaklaşma açısı boyunca yavaşça hücrenin soma'sından uzağa çekilmesi, kapasitans geçicilerinin ve membran akımının yavaş yavaş kaybolduğunu gözlemleyerek hücre zarının yeniden sızdırmazlığını ve pipet ucunda bir dış-dış yama oluşumunu gözlemleyin. Dilimin yönünü ve dilim içindeki hücrelerin konumunu not edin. Dilimi 24 delikli bir plakada PFA'ya koyun ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin ve ardından 0,1 M PB'ye aktarın.
      NOT: Dilimler bir haftaya kadar saklanabilir. Daha uzun süre depolama gerekiyorsa, PB'yi düzenli olarak değiştirin veya sodyum azid içeren PB kullanın (sodyum azidin% 0.02 -% 0.2'si).

4. Histoloji

1. Dilimleme enjeksiyon bölgesi
   1. Fiksasyonu takiben, dokuyu batana kadar PB'de% 30 sakkarozda (w / v) kriyoprotezde korur (başlangıçta sakkaroz çözeltisinde yüzer), genellikle oda sıcaklığında gece boyunca veya 4 ° C'de 24-48 saat.
   2. Optimum kesme sıcaklığı (OCT) ortamını kullanarak, kriyostat numune diskine bir doku bloğu takın. 4.1.3 ila 4.1.4 arasındaki adımları izleyerek doku bloğunu dondurun.
   3. İzopentanı uygun bir kaba koyun. Sadece numune diskini batırın ve dokunun isopentan seviyesinin üzerinde olmasını sağlayın. İzopentan kabını sıvı azota (veya kuru buza) indirin ve dokunun donmasına izin verin.
   4. Tamamen dondurulduktan sonra (tüm doku bloğu soluk ve sertleşir), bloğun sıcaklığının dengelenmesine izin vermek için doku bloğunu kriyostat odasında -20 ° C'de 30 dakika bekletin.
   5. Kriyostattaki 40 μm kalınlığındaki kesitleri -20 °C'de kesin. Bölümleri bıçaktan çıkarmak için ince bir boya fırçası kullanın. Dondurulmuş kesitleri oda sıcaklığında, poli-L-lizin kaplı, cam mikroskopla kaydırılan bölümlere kaydırarak yapıştırın.
   6. Her slayta yaklaşık 150 μL montaj ortamı ekleyin ve bir kapak kayması ile örtün; Kapak kapağına hafifçe bastırarak hava kabarcıklarını çıkarın. Fotobeyazlatmaya karşı korumak için kızakları örtün ve oda sıcaklığında en az 12 saat (veya gece boyunca) hava ile kurutun. Bir floresan mikroskobu kullanarak, viral enjeksiyon bölgesinin yerini inceleyin.
2. Biyositin boyama protokolü
   NOT: Bu protokol kalın bölümlere uygulanabilir; dilimlerin yeniden bölümlenmesine gerek yoktur.
   1. Beyin dilimlerini fosfat tamponlu salin (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 ve 1.8 mM KH₂PO₄) ile yıkama başına 10 dakika boyunca altı kez yıkayın. Her adımdan sonra kuyucukları boşaltmak için bir transfer pipeti kullanın.
   2. Herhangi bir endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için dilimleri PBS'de%_{3 H 2}O₂ (w / v) içinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Bu oksijen kabarcıkları oluşturur.
   3. Beyin dilimlerini PBS ile yıkama başına 10 dakika boyunca veya daha fazla oksijen kabarcığı görünmeyene kadar altı kez yıkayın. Beyin dilimlerini, 3 saat boyunca oda sıcaklığında% 0.1 (v / v) Triton X-100 içeren% 1 (v / v) avidin-biyotinile HRP kompleksi (ABC) çözeltisinde inkübe edin.
   4. Beyin dilimlerini PBS ile yıkama başına 10 dakika boyunca altı kez yıkayın.
   5. Her dilimi 3,3′-Diaminobenzidin (DAB) çözeltisinde, nöronal yapıların biyositin boyaması görünür hale gelene kadar birkaç dakika boyunca inkübe edin (yaklaşık 5-10 dakika sürer).
      DİKKAT: DAB toksiktir. Duman davlumbazında kullanın.
      NOT: DAB inkübasyon süreleri tahmin edilemez olabilir, renk geliştikçe dokuyu yakından izleyin.
   6. Dilimleri soğuk (4 °C) PBS'ye aktararak reaksiyonu durdurun. Beyin dilimlerini PBS ile yıkama başına 10 dakika boyunca altı kez yıkayın. Beyin dilimlerini poli-L-lizin kaplı cam mikroskop slaytlarına monte etmek için bir fırça kullanın.
   7. Tüm fazla PBS'yi temiz bir doku ile çıkarın. Her dilimi yaklaşık 200 μL montaj ortamı ile örtün; kapak kapaklarıyla örtün ve hava kabarcıklarını dışarı itmek için kapak kapağına hafifçe bastırın. Oda sıcaklığında en az 12 saat (veya gece boyunca) hava ile kurulayın. Bir ışık mikroskobu kullanarak, hücrelerin yerini ve morfolojik ayrıntılarını inceleyin.
      NOT: Biyositin alternatif olarak florofor konjuge streptavidin kullanılarak görselleştirilebilir; Bununla birlikte, görüntüleme rezeksiyon veya konfokal mikroskop kullanımı gerektirebilir²¹.

Sonuçlar

Bu protokolde, optogenetik yapıların viral iletimini kullanarak uzun menzilli sinaptik fizyoloji ve plastisitenin nasıl çalışılacağını açıklıyoruz. Protokol, beyindeki hemen hemen her türlü uzun menzilli bağlantıyı incelemek için çok kolay bir şekilde uyarlanabilir. Örnek olarak, bir opsini sıçan mPFC'sine kodlayan AAV'lerin enjeksiyonunu, LEC'den akut dilimlerin hazırlanmasını, katman 5 LEC piramidal nöronlarından yama-kelepçe kayıtlarını ve LEC'deki mPFC terminallerinin ışıkla uyarılmış aktivasyonunu açıklıyoruz (

Tartışma

Burada sunulan protokol, optogenetik yapıları kodlayan AAV'leri ve akut beyin dilimlerinde elektrofizyolojiyi sunmak için stereotaksik cerrahinin bir kombinasyonunu kullanarak oldukça spesifik uzun menzilli sinaptik projeksiyonları keşfetmek için bir yöntemi açıklamaktadır (Şekil 1). Bu teknikler birlikte, daha önce geleneksel, spesifik olmayan, elektriksel stimülasyon kullanılarak erişilemeyen uzun menzilli ve anatomik olarak dağınık yollarda beyin devresinin fizyolojisini ve plastisitesini...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.2 mL tüp	Fisher Scientific Ltd	12134102
10 & mikro; L pipet	Gilson	FD10001
24 oyuklu plaka	SARSTEDT	83.3922
3 luer valf	Cole-Parmer	WZ-30600-02
3,3′-Diaminobenzidin (DAB) substrat	Vektör Laboratuvarları	SK-4105
40x objektif	Olympus	LUMPLFLN40XW
4-aminopiridin	Merhaba Biyo	HB1073
4x objektif	Olympus	PLN4X/0.1
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry	Addgene	35512	Viral titre: 3.3x1013 GC/ml
Akromatik lens	Edmund Optics	49363	Görsel spektrumu ve yakın IR'yi odaklar
Masaüstü mikrosantrifüj	Benchmark Scientific	C1005*
Biyosit	Sigma-Aldrich	B4261
Borosilikat cam kılcal	Warner Instruments	G150F-6
Burr	Güzel bilim araçları	19008-07
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
Kamera - Qimaging Retiga Elektro	Fotometri	01-ELECTRO-M-14-C
Carbachol	Tocris	2810
Klorheksidin cerrahi ovma	Vetasept	XHG008
Makas	Andis	22445	AGC Süper 2 Hızlı Çıkarılabilir Bıçak Kesme
Kolimasyon kondansatör lensi	ThorLabs	ACL2520-A
Lameller	Fisher Scientific Ltd	10011913
Kriyostat	Leica	CM3050 S
CsMeSO4	Sigma-Aldrich	C1426
Siyanoakrilat yapıştırıcı	Rapid Electronics Ltd	84-4557
Veri toplama cihazı	National Instruments	USB-6341 BNC
D-glikoz	Sigma-Aldrich	G8270
Dikroik ayna 500 nm uzun geçişli	Edmund Optics	69899
Dikroik ayna 600 nm uzun geçiren	Edmund Optics	69901
Dikroik ayna küpü	ThorLabs	CM1-DCH/M
EGTA	Millpore	324626
Yan portlu elektrot tutucu	HEKA	895150
Emisyon filtresi	Chroma	59022m
Uyarma filtresi	Chroma	ET570/20x
Göz jeli	Dechra	Lubrithal
İnce boya fırçası	Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri	BRU2052
Giyotin	Dünyası Hassas Aletler	DCAP
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hidrojen peroksit çözeltisi	Sigma-Aldrich	H1009	%30 (a/a)
İzofluran	Henry Schein	988-3245
İzopentan	Sigma-Aldrich	M32631
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
k-glukonat	Sigma-Aldrich	G4500
Kinematik floresan filtre küpü	ThorLabs	DFM1T1
LED sürücü	ThorLabs	LEDD1B
Lidokain merhem	Teva	80007150
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
MgCl	Sigma-Aldrich	M2670
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Mikro matkap	Harvard Cihazı	75-1887
Mikroelektrot çektirme	Sutter aletleri	P-87
Mikroenjeksiyon şırınga	Hamilton	7634-01/00
Mikroenjeksiyon şırınga iğnesi	Hamilton	7803-05	Özel özellikler: ölçer 33, uzunluk 15mm, nokta stili 4 - 12 derece;
Mikroenjeksiyon şırınga pompası	Dünya Hassas Aletler	UMP3T-1
Monte edilmiş mavi LED	ThorLabs	M470L5
Monte yeşil LED	ThorLabs	M565L3
Na2HPO4.7H2O	Sigma-Aldrich	S9390
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S0751
NaH2PO4.H2O	Sigma-Aldrich	S9638
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
NIR LED	OSRAM		SFH4550Dilimin kırılmalı IR görüntülemesi için kullanılan, diferansiyel girişim kontrastı (DIC) optikleri, yaygın olarak kullanılan başka bir yöntemdir
OCT ortamı	VWR Uluslararası	RAYLLAMB/OCT	Optimum kesme sıcaklığı ortamı
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	158127
Paraformaldehit	Sigma-Aldrich	P6148
Yama kelepçesi amplifikatörü	Moleküler Cihazlar	700A
Peristaltik pompa	Dünya Hassas Aletler	Ministar
Poli-L-lizin kaplı mikroskop slaytları	Fisher Scientific Ltd	23-769-310
Kayıt odası	Warner Instruments	RC-26G
Neşter bıçağı	Swann Morton	# 24
Dilim çapa	Warner Instruments	SHD-26-GH / 15
Stereotaksik çerçeve	Kopf	Model 902
Mikro matkap için stereotaksik tutucu	Harvard Aparatı	75-1874
Sükroz	Sigma-Aldrich	S0389
Cerrahi Mikroskop	Carl Zeiss	OPMI 1 FR pro
Sütür	Ethicon	W577H
Hücre içi kayıt için şırınga filtresi çözüm	Thermo Scientific Nalgene	171-0020
Tetrodotoksin sitrat	Hello Bio	HB1035
Transfer pipetleri	Fisher Scientific Ltd	10458842
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Dik floresan mikroskobu	Leica	DM6 B
VECTASHIELD DAPI ile Antifade Montaj Ortamı	Vektör Laboratuvarları	H-1200-10
VECTASTAIN ABC-HRP kiti	Vektör Laboratuvarları	PK-4000
Vibratom	Campden Instruments	7000smz-2
WinLTP	https://www.winltp.com/	Sürüm 2.32	Veri toplama yazılımı
Solution
aCSF
sükroz kesme çözeltisi
PFA
Hücre İçi?