Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.
Beyindeki belirli sinapsların fizyolojik özelliklerini ve plastik değişikliklere nasıl maruz kaldıklarını incelemek, modern sinirbilimde önemli bir zorluktur. Geleneksel in vitro elektrofizyolojik teknikler, sinaptik iletimi uyandırmak için elektriksel stimülasyon kullanır. Bu yöntemin en büyük dezavantajı, spesifik olmayan doğasıdır; uyarıcı elektrot bölgesindeki tüm aksonlar aktive edilecek ve bu da belirli bir afferent bağlantıya bir etki atfetmeyi zorlaştıracaktır. Bu sorun, elektriksel stimülasyonun optogenetik temelli stimülasyonla değiştirilmesiyle aşılabilir. Optogenetiği in vitro yama-kelepçe kayıtlarıyla birleştirmek için bir yöntem tanımladık. Bu, anatomik olarak tanımlanmış hassas sinaptik bağlantıların hem bazal sinaptik iletiminin hem de sinaptik plastisitesinin incelenmesi için güçlü bir araçtır ve beyindeki hemen hemen her yola uygulanabilir. Burada, kemirgen beynindeki pre-sinaptik bir bölgeye (medial prefrontal korteks) cerrahi enjeksiyon için kanalrodopsin proteinini kodlayan bir viral vektörün hazırlanmasını ve işlenmesini ve aşağı akış hedef bölgelerinin (lateral entorinal korteks) akut dilimlerinin oluşturulmasını açıklıyoruz. Kısa ve uzun süreli sinaptik plastisiteyi incelemek için yama-kelepçe kayıtlarını ışık stimülasyonu ile sinaptik aktivasyonla birleştirmek için ayrıntılı bir prosedür de sunulmaktadır. Optogenetik ve Cre-bağımlı hücre etiketlemesini birleştirerek yol ve hücre özgüllüğünü sağlayan deney örneklerini tartışıyoruz. Son olarak, ilgilenilen sinaptik öncesi bölgenin histolojik doğrulaması, kesin konumun ve hücre tipinin daha fazla tanımlanmasına izin vermek için post-sinaptik hücrenin biyositin etiketlemesi ile birlikte açıklanmaktadır.
Sinapsların fizyolojisini ve plastik değişikliklere nasıl uğradıklarını anlamak, beyin ağlarının sağlıklı beyinde nasıl çalıştığını anlamak için esastır1 ve beyin bozukluklarında nasıl arızalandıklarını anlamak için temeldir. Akut ex vivo beyin dilimlerinin kullanılması, tüm hücre yama-kelepçe kayıtları kullanılarak tek nöronlardan sinapsların elektriksel aktivitesinin yüksek sinyal-gürültü oranıyla kaydedilmesini sağlar. Membran potansiyelinin kontrolü ve basit farmakolojik manipülasyon, reseptör alt tiplerinin izolasyonuna izin verir. Bu kayıtlar, laminer ve alt bölgesel pozisyon2, hücresel morfoloji3, moleküler belirteçlerin varlığı4, afferent projeksiyonları5 veya yakın zamanda aktif olsa bile6 dahil olmak üzere post-sinaptik nöronu tanımlamak için mükemmel bir özgüllükle yapılabilir.
Bununla birlikte, sinaptik öncesi girdilerin özgüllüğünü elde etmek biraz daha zordur. Geleneksel yöntem, belirli bir laminada çalışan aksonları uyarmak için stimülasyon elektrotları kullanmıştır. Bunun bir örneği, stratum radiatumdaki lokal stimülasyonun, CA3’ten CA1 alt alanı7’ye yansıyan sinapsları aktive ettiği hipokampustadır. Bu örnekte, CA3 girişi, CA1 piramidal hücrelere8 yansıyan stratum radyatumunda bulunan tek uyarıcı girişi temsil ettiği için presinaptik özgüllük elde edilir. Bununla birlikte, CA3-CA1 eksenlerinin geleneksel elektriksel presinaptik aktivasyonu ile elde edilebilen bu yüksek giriş özgüllüğü derecesi, bu sinapsın maruz kaldığı yoğun çalışmaya yansıyan bir istisnadır. Diğer beyin bölgelerinde, çoklu afferent yollardan gelen aksonlar aynı laminada, örneğin neokorteks9’un 1. tabakasında bir arada bulunur, böylece geleneksel uyarıcı elektrotlarla girişe özgü presinaptik stimülasyonu imkansız hale getirir. Farklı sinaptik girdiler farklı fizyolojik özelliklere sahip olabileceğinden bu sorunludur; bu nedenle, birlikte stimülasyonları sinaptik fizyolojinin yanlış karakterize edilmesine yol açabilir.
Optogenetiğin ortaya çıkışı, channelrhodopsin-2 (ChR2) gibi ışığa duyarlı membran proteinlerinin (opsinler) genetik kodlaması, beyin bölgeleri10,11 arasındaki izole sinaptik projeksiyonları incelemek için olasılıkların geniş bir genişlemesine izin vermiştir. Burada, uzun menzilli sinaptik fizyoloji ve plastisiteyi incelemek için genelleştirilebilir ve düşük maliyetli bir çözümü açıklıyoruz. Optogenetik yapılar, ilgilenilen sinaptik öncesi bölgenin son derece hassas kontrolüne izin veren viral vektörler kullanılarak oldukça spesifik bir şekilde teslim edilir. Efferent projeksiyonları, bu liflerin bir hedef bölgede aktivasyonuna izin veren ışıkla aktive edilen kanalı ifade edecektir. Böylece, geleneksel, spesifik olmayan, elektriksel stimülasyon ile bağımsız olarak aktive edilemeyen uzun menzilli, anatomik olarak dağınık yollar incelenebilir.
Örnek bir yol olarak, medial prefrontal korteksin (mPFC) uyarıcı katyon kanallı opsinleri kodlayan adeno ilişkili virüslerle (AAV’ler) transdüksiyonunu tanımladık. Daha sonra lateral entorinal korteksten (LEC) akut dilimlerin hazırlanmasını, katman 5 LEC piramidal nöronlarından yama-kelepçe kayıtlarını ve glutamaterjik mPFC-LEC projeksiyonlarının ışıkla uyarılmış aktivasyonunu tanımladık (Şekil 1). Ayrıca, pre-sinaptik bölgenin yerini doğrulamak ve post-sinaptik hücre morfolojisinin tanımlanmasını doğrulamak için enjeksiyon bölgesinin histolojik değerlendirmesini de açıklayacağız.
Burada sunulan protokol, optogenetik yapıları kodlayan AAV’leri ve akut beyin dilimlerinde elektrofizyolojiyi sunmak için stereotaksik cerrahinin bir kombinasyonunu kullanarak oldukça spesifik uzun menzilli sinaptik projeksiyonları keşfetmek için bir yöntemi açıklamaktadır (Şekil 1). Bu teknikler birlikte, daha önce geleneksel, spesifik olmayan, elektriksel stimülasyon kullanılarak erişilemeyen uzun menzilli ve anatomik olarak dağınık yollarda beyin devresinin fizyolojisin…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Wellcome hibe 206401/Z/17/Z tarafından desteklenmektedir. Zafar Beşir’e uzman mentorluğu için ve Dr. Clair Booth’a teknik yardım ve makale hakkındaki yorumları için teşekkür ederiz.
0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3×1013 GC/ml |
Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Camera – Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
Carbachol | Tocris | 2810 | |
Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
EGTA | Millpore | 324626 | |
Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
Emission filter | Chroma | 59022m | |
Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12° |
Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
Suture | Ethicon | W577H | |
Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
Solution | |||
aCSF | |||
sucrose cutting solution | |||
PFA | |||
Intracellular? |