Periferik Sinir Arayüzü için Kablosuz, Pilsiz Sistemlerin İmplantasyonu ve Kontrolü

Travmatik periferik sinir yaralanmaları (PNI'ler) ABD'de yıllık yaklaşık 200.000 insidansı ile ortaya çıkar¹. PNI'lardan muzdarip hastaların çoğu kalıcı fonksiyonel bozukluklarla kalır. En kötüsü, bu kas felci ile sonuçlanabilir ve tedaviye dirençli nöropatik ağrıyı tetikleyebilir ve hastalar tedavi olarak uzuv amputasyonuna girmeye istekli olacak kadar şiddetli olabilir². PNI sonuçlarını iyileştirmenin önündeki en büyük engel, akson rejenerasyonunun, yeniden büyümeleri gereken mesafelere göre çok yavaş olmasıdır. Örneğin, yetişkin bir insan aksonu günde 1 mm büyür, ancak proksimal bir uzuvda bir lezyon olması durumunda >1000 mm'lik mesafelerde yenilenmesi gerekebilir.

Mevcut klinik uygulamada, PNI'lerin ~%50'si cerrahi onarım gerektirir³. Başarılı bir sinir rejenerasyonu için, aksonlar (i) lezyon bölgesi boyunca büyümeli (yani, boşluk geçişi) ve daha sonra (ii) bir son organ hedefine ulaşmak için sinir yolunda rejenere olmalıdır (yani, distal yeniden büyüme) (Şekil 1). Sinir yenilenmesini hızlandırdığı kanıtlanmış FDA onaylı bir ilaç yoktur. PNI klinik yönetiminin statükosu yalnızca son birkaç on yılda kademeli olarak değişmiştir ve rejenere aksonların seyahat etmesi gereken mesafeyi azaltmak için distal motor sinir transferleri gibi cerrahi yöntemlere yönelik teknik iyileştirmelerle^{sınırlıdır 4} veya proksimal sinirin geri çekildiği ve doğrudan tekrar dikilemediği durumlar için "kullanıma hazır" sentetik sinir kanalları⁵. Bununla birlikte, Alberta Üniversitesi'nden Dr. K. Ming Chan tarafından yönetilen ve kas ^6,7,8 veya cildin^{reinnervasyonunu} önemli ölçüde iyileştirdiğini gösteren tek merkezli çalışmalar olan, ameliyat sonrası sinirlere uygulanan terapötik elektrik stimülasyonu üzerine dört randomize klinik çalışma yapılmıştır 9. Bu elektriksel stimülasyon protokolünün temel çalışması kemirgenlerde^10,11 gerçekleştirildi, burada elektriksel stimülasyonun özellikle boşluk geçişini artırarak (Şekil 1) çalıştığı, ancak distal yeniden büyümeyi^(12,13,14,15) artırmadığı gösterilmiştir.

Dört elektriksel stimülasyon randomize klinik çalışmanın hepsinde kullanılan transkutanöz tel elektrotların cerrahi olarak yerleştirilmesi gerekliydi, çünkü etkileri, nöron hücre gövdesini 1 saat¹¹ boyunca sürekli olarak 20 Hz'de depolarize etmek için yeterli akımın verilmesine bağlıydı. Klinik uygulamada, bu elektriksel stimülasyon protokolü, ağrı nedeniyle cilt üzerinde yüzey uyarıcı elektrotlar aracılığıyla gereken yoğunluklarda çoğu hasta için tolere edilemez. Ameliyat sonrası transkutanöz elektrotların çalıştırılmasıyla ilişkili, derin yara enfeksiyonu veya ameliyathaneden (OR) hasta nakli sırasında tellerin yanlışlıkla sinirlerden yer değiştirmesi gibi önemsiz olmayan riskler vardır. Ek olarak, ameliyathane zamanının yüksek maliyeti, akut postoperatif iyileşme sırasında değil, bu ortamda denemeye karşı caydırıcıdır. Mevcut periferik sinir arayüzlerinin bu eksikliğini gidermek için yeni bir kablosuz, pilsiz ve tamamen implante edilebilir periferik sinir arayüzleri sınıfı ortaya çıkıyor.

Bu yeni kablosuz implante edilebilir elektronik sistemler sınıfı, elektriksel stimülasyon dozlama için kolaylık ve esnekliği artırmaya ve daha geniş klinik uygulamasını engelleyen engelleri yıkmaya hazırdır. Bu yazıda, erişkin sıçan siyatik ve frenik sinir modellerinde (i) cerrahi olarak implant ve (ii) bu sisteme kablosuz olarak güç sağlama ve kontrol etme yöntemleri açıklanmaktadır. Periferik sinir arayüzünün CMAP'leri nasıl uyandırabileceğini, terapötik bir elektriksel stimülasyon protokolü sunabileceğini ve hatta periferik sinirlerin onarımı için bir kanal görevi görebileceğini gösterir. Buradaki protokoller, optogenetik aracılı nöromodülasyon 16, kontrollü ilaç salınımı¹⁷ veya zaman içinde tekrarlanan elektriksel stimülasyon nöbetleri^18,19 için ışık darbeleri verebilen bu teknolojinin diğer varyantları için uyarlanabilir.

Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütülür ve Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu protokol, Northwestern Üniversitesi Karşılaştırmalı Tıp Merkezi ve IACUC'un hayvan bakımı yönergelerini takip eder. Protokolleri uyarlarken IACUC'a danışmak gerekir.

1. Kablosuz elektronik stimülatör imalatı (Şekil 2)

1. Radyo frekansı güç hasat bobini (yani kablosuz alıcı anteni) için bir alt tabaka olarak bakır/poliimid/bakır (18 μm kalınlığında üst ve alt bakır, 75 μm kalınlığında poliimid) kullanın.
2. Üst ve alt bakır katmanlardaki elektrotlar için delikler açmak ve cihazı şekillendirmek için doğrudan lazer ablasyon kullanın. Deliklerden gümüş macun kullanarak üst ve alt katmanları elektriksel olarak bağlayın.
3. Elektronik bileşenleri diyot ve kapasitör gibi ticari ambalajlarla lehimleme yoluyla takın.
4. Gerilebilir uzatma elektrotları olarak biyolojik olarak emilebilir dinamik kovalent poliüretan (b-DCPU; 200 μm kalınlığında) kapsüllenmiş molibden (Mo; 15 μm kalınlığında; serpantin yapısı) kullanın¹⁹.
5. Poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) film (300 μm kalınlığında) kullanarak cihaz ve sinir arasındaki arayüz için manşet elektrodunu oluşturun.
6. Kablosuz alıcı antenini ve gerilebilir uzatma elektrodunu bağladıktan sonra, kablosuz alıcı antenini ve bağlantıyı ticarileştirilmiş su geçirmez epoksi veya polidimetililoksan (PDMS) ile kapsülleyin. Tamamen monte edilmiş cihaz için Şekil 2'ye (sağda) bakın.
7. Birincil bobin (yani iletim bobini) aracılığıyla monofazik elektriksel darbeler üretmek için bir dalga biçimi üreteci kullanarak cihazın kablosuz çalışmasını onaylayın.
   NOT: Monofazik ve bifazik uyaranlarla periferik aksonların alımını ve aksonal rejenerasyonun indüksiyonunu inceleyen önceki çalışmalar, dalga formu karakteristiğindeki²⁰ farklılıklar nedeniyle ihmal edilebilir bir etki bildirmiştir ve bu grup, farelerde²¹ ve sıçanlarda¹⁸ aynı monofazik akım parametreleriyle terapötik elektriksel stimülasyon artışı elde edebilmiştir. Ayrıca, önceki çalışmalar biyouyumluluğu in vivo ve in vitro olarak incelemiş ve ısıtma etkilerinden veya malzemelerin kendisinden kaynaklanan doku hasarına dair herhangi bir kanıt bulamamıştır. Bu bulgular ve bu çalışmada terapötik elektriksel stimülasyon süresinin sınırlı olması nedeniyle, bu protokolde bifazik uyaranlardan ziyade monofazik uyaranlar kullanılmıştır.
8. Elde edilen doğru akım çıkış voltajını manşet elektroduna bağlı bir osiloskopla ölçün.

2. İmplantasyon için cihaz hazırlığı

1. İmplant cihazlarını steril bir Petri kabına yerleştirin ve parafilm ile kapatın.
2. Cihazları her iki tarafta 30 dakika boyunca UV ışığı ile ışınlayın.

3. Elektriksel stimülasyon için kablosuz, pilsiz periferik sinir arayüzünün sıçan sağ siyatik sinir implantasyonunun cerrahi prosedürü (Şekil 3)

NOT: Steril koşulları koruyun. Bir hayvan prosedür odasının belirlenmiş cerrahi alanı içinde ameliyatlar gerçekleştirin. Cerrah ameliyat sırasında yüz maskesi, palto, şapka ve steril eldiven takacaktır. Birden fazla ameliyat yapılırsa, hayvanlar arasında steril eldivenleri değiştirin ve her ameliyat için temiz, steril cerrahi aletler kullanın. Ameliyatlar arasında aletleri ısı sterilizasyonu (otoklav veya cam boncuk sterilizatörü) ile sterilize edin. 200-250 g ağırlığındaki yetişkin Sprague-Dawley sıçanlarını kullanın.

1. Oksijende (2 L / dak) izofluran gaz anestezisi (% 3 indüksiyon,% 1-3 idame) kullanarak, deri altı meloksikam (1-2 mg / kg) uygulaması ile anesteziyi indükleyin. Kurumayı önlemek için sıçanların gözlerini belirlenmiş oftalmik merhem ile örtün.
2. Sonraki prosedürler için fareleri dezenfekte edilmiş cerrahi masalara yüzüstü pozisyonda yerleştirin. Kalan cerrahi süre boyunca, solunum hızını (~ 2 / s olmalıdır), doku rengini ve anestezi derinliğini her 15 dakikada bir en az olacak şekilde değerlendirin ve buna göre izofluran seviyelerini koruyun. Pedal refleksini kontrol ederek uygun anestezi derinliğini onaylayın (sert bir ayak parmağı sıkışmasına yanıt eksikliği). Pembe ve nemli kalması gereken mukoza zarlarını izleyin.
3. Sağ bacak ve sırtın alt yarısı da dahil olmak üzere ameliyat bölgesini tıraş edin. Tıraşlı cerrahi bölgeyi bir betadin pedi ve ardından %70 tıbbi etanol çubuğu ile ovalayın ve cilt dezenfeksiyonu için bu fırçalama işlemini üç kez tekrarlayın.
4. Doku makası kullanarak sağ femur kemiğine paralel ciltte 1,5 – 2 cm'lik bir kesi yapın, ardından alıcı bobin için bir deri altı cebi temizlemek için arkadaki deri altı bağ dokusunun (doğrudan insizyonun medialin) künt olarak ayrılması (Şekil 4A). Cilt kesisine paralel olarak sağ gluteal kas üzerinde daha sonra bir kesi (1.2-1.5 cm) yapın.
5. Siyatik siniri künt uçlu metal diseksiyon probları ile nazikçe izole edin (Şekil 4B).
   NOT: Siyatik sinir, biseps femoris'in derinliklerinde bulunur ve femura paralel uzanır. Bir diseksiyon kapsamı önerilmektedir.
6. Siniri gerdirmeden veya yolunu bozmadan manşeti izole sağ siyatik sinirin etrafına sararak kablosuz, pilsiz cihazı siyatik sinire implante edin (Şekil 4C) 18,19,20. Daha fazla elektriksel stimülasyon için alıcı bobinin yerleştirildiği cilt üzerinde işaretleyin.
7. Emilebilir sütürler kullanarak gluteal kas insizyonunu dikin (Şekil 4D).
   NOT: Alıcı bobinin üst yarısı, gluteal kasın ve altındaki manşet arayüzünün üzerine oturur.
8. Cilt insizyonunu yara klipsleri (veya gömülü dikiş; Şekil 4E). Cilt kenarlarını eşleştirin.
9. Anestezi altında 200 μs darbe genişliği ile 1 saat sürekli ameliyat sonrası 20 Hz elektrik stimülasyonu sağlayın (Şekil 4F). Anesteziden tamamen kurtulduktan sonra hayvanları ev kafeslerine geri getirin.
   NOT: Ayrıntılı protokol aşağıda açıklanmıştır. Alıcı bobin, Şekil 4F'de derinin üzerinde gösterilmiştir.
10. Ameliyat sonrası tedavi
    1. Fareyi, kafesin yarısı uygun bir sıcaklık ayarlı ısı kaynağına (onaylı ısıtma yastığı) yerleştirilmiş, kağıt havlularla kaplı, yataksız bir kurtarma kafesine yerleştirin.
    2. Sıçanı ambulatuvar olana kadar dikkatlice izleyin. Ambulatuvar ve stabil olduğu değerlendirildikten sonra, fareyi ev kafesine geri koyun ve sosyal yeniden bütünleşmeyi izleyin.
    3. Akut iyileşmeden sonra, sıçanları insizyon bölgesi enfeksiyonu ve koruma, kıvranma, kaşıma ve kendini yaralama dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere nörojenik ağrı semptomları açısından izleyin. Cerrahi sonrası 5 günlük iyileşme süresi boyunca sıçanları günlük olarak izleyin ve sıçanlar 5. günde feda edilmezse bundan sonra en az üç günde bir izleyin.
    4. Meloksikam (1-2 mg / kg), hayvanın görüntülenen ağrı / rahatsızlık seviyesine bağlı olarak, ameliyattan sonra iki ila üç gün boyunca günde bir kez deri altından uygulayın. Kalıcı ağrıdan şüpheleniliyorsa, ameliyat sonrası bu sürenin ötesinde meloksikam devam edin ve refrakter olduğu kanıtlanırsa, veteriner ekibine danışarak fareyi erkenden ötenazi yapın.
    5. Ameliyattan 10-12 gün sonra cilt dikişlerini veya yara klipslerini çıkarın.

4. Kablosuz stimülatörlerin sıçan sol frenik sinir implantasyonunun cerrahi prosedürü (Şekil 5A)

NOT: Bölüm 3'teki gibi steril koşulları koruyun. 200-250 g ağırlığındaki yetişkin Sprague-Dawley sıçanlarını kullanın. Kullanmadan önce tüm cerrahi aletleri sterilize edin.

1. Oksijende (2 L / dak) izofluran gaz anestezisi (% 3 indüksiyon,% 1-3 idame) kullanarak, deri altı meloksikam (1-2 mg / kg) uygulaması ile anesteziyi indükleyin. Kurumayı önlemek için farenin gözlerini belirlenmiş oftalmik merhem ile örtün.
2. Sonraki prosedürler için sıçanları dezenfekte edilmiş ameliyat masalarına sırtüstü pozisyonda yerleştirin. Kalan cerrahi süre boyunca, solunum hızını, doku rengini ve anestezi derinliğini her 15 dakikada bir değerlendirin ve buna göre izofluran seviyelerini koruyun. Pedal refleksini kontrol ederek uygun anestezi derinliğini onaylayın (sert bir ayak parmağı sıkışmasına yanıt eksikliği). Pembe ve nemli kalması gereken mukoza zarlarını izleyin.
3. Boynun ventral tarafındaki cerrahi bölgeyi tıraş edin. Tıraşlı cerrahi bölgeyi bir betadin pedi ve ardından %70 tıbbi etanol çubuğu ile ovalayın ve cilt dezenfeksiyonu için bu fırçalama işlemini üç kez tekrarlayın.
4. Bupivakain (2 mg / kg, toplam hacim 0.5 mL'yi aşmayan salin içinde seyreltilmiş) boynun orta hattında deri altından uygulayın ve en yüzeysel tabakayı hedefleyin. Sternohyoid ve sternokleidomastoid kasları ortaya çıkarmak için cilt ve yüzeyel servikal fasyadan 3 cm'lik bir orta hat insizyonu yapın (Şekil 5B).
   NOT: Bir diseksiyon kapsamı önerilmektedir.
5. Bir prob ile hafif künt diseksiyon kullanarak sternokleidomastoidi yükseltin ve bir damar halkası kullanarak lateral olarak geri çekin (Şekil 5C). Omohyoid'i yavaşça serbest bırakın ve geri çekin. Daha sonra, vagus sinirini ve omohyoid kasın altındaki karotis demetini nazikçe serbest bırakın ve medial olarak geri çekin.
   NOT: Buradaki en büyük ayrım vagus siniri ile frenik sinir arasındadır. Alttaki yapıları ortaya çıkarmak gerekirse omohyoid'i kesin.
6. Frenik siniri izole edin (Şekil 5D).
   NOT: Frenik sinir, anterior skalen kasının yüzeyi boyunca uzanır ve brakiyal pleksusa dik olarak geçen oldukça küçük bir uzunlamasına sinir olarak çalışır. Siyatik sinirin aksine, boyundaki frenik sinirin etrafındaki anatomi daha karmaşıktır. En iyi sonuçlar için implantasyondan önce elektrofizyolojik doğrulama (adım 4.7) yapın.
7. Kayıt elektrodunu deri altına, sadece kaudal olarak göğüs kafesine, izole frenik sinire ipsilateral olarak yerleştirin (Şekil 5E). Stimülatörleri frenik sinire yerleştirin ve senkron sinyalleme ile onaylayın (Şekil 6).
   NOT: ~3-6 mA uyaran yoğunluğu ve 0.02 ms uyaran süresi ile maksimum yanıt uyandırmak tipiktir.
8. Transeksiyon bölgesine göre proksimal sinir ucuna bir elektriksel uyaran uygulandığında uyarılmış yanıtın tamamen ortadan kalktığını göstererek frenik sinirin tam transeksiyonunu doğrulayın (Şekil 6).
9. İmplante edilebilir cihazın alıcı bobinini, manşet frenik sinirin etrafında ve kontakt elektrotlar sinire dik olarak konumlandırılmış şekilde, bilateral sternokleidomastoid kaslara göre derin bir şekilde sternohyoid üzerine yerleştirerek frenik sinir üzerine kablosuz, pilsiz bir cihaz implante edin (Şekil 5F).
10. Yüzeyel servikal fasyayı basit çalışan emilebilir sütürlerle kapatın (Şekil 5G). Derin dermiste kesintili ters emilebilir dikişlerle cildi kapatın. Hayvanları ancak anesteziden tamamen kurtulduktan sonra ev kafeslerine geri koyun.
11. Ameliyat sonrası tedavi için adım 3.10'u izleyin.

5. Terapötik elektriksel stimülasyonun kablosuz iletimi

1. Genel anestezi altındaki sıçanlara 1 saat boyunca elektrik stimülasyonu uygulayın. Kablosuz stimülasyon için, harici bir endüktif bobine (yani iletim bobini) elektrik gücü sağlamak için hayvanın üzerine bir dalga formu/fonksiyon üreteci (voltaj: 1-15 Vpp) ve isteğe bağlı amplifikatör yerleştirin (5 turlu iki boyutlu spiral bobin; çap: 2 cm) implante edilmiş alıcı bobin ile iyi bir endüktif bağlantı sağlamak için. 1 saat süre boyunca 20 Hz'de monofazik, 200 μs darbeler verin.
2. Elektriksel stimülasyon iletimini doğrulamak ve ölçmek için, siyatik sinirin supramaksimal aktivasyonunu sağlamak için stimülasyon voltajını ayarlayarak tibial anterior kastan CMAP'leri kaydedin. Tüm kayıtlar için eşmerkezli iğne elektrotları kullanın.
   NOT: İşlev tarafından oluşturulan maksimum voltaj maksimum yanıtı uyandırmak için yetersizse, bir amplifikatör kullanın.

6. Ötenazi

1. Birincil yöntem
   1. Kafesi, 8-12 LPM hızına (veya hazne boyutuna göre uygun akış hızına) ayarlanmış bir CO₂ dağıtım haznesinin altına yerleştirin. Sıçanları bilinç kaybı açısından izleyin ve ardından en az 1 dakika solunumun kesilmesini sağlayın.
2. İkincil yöntem
   1. Servikal çıkık veya bilateral torakotomi yapın.

Siyatik sinir yaralanması modelinde, tibial sinir dalının uçtan uca onarımından önce implant sağ siyatik sinirin etrafına yerleştirilir (Şekil 3, Şekil 4A ve Şekil 7A). Maksimal yoğunlukta elektriksel stimülasyon için gerekli uyarı parametrelerini tanımlamak için sağ tibialis anterior kasına 30 G konsantrik iğne elektrodu yerleştirilir. Bu deneyler, stimülasyon yoğunluğunun, tepki büyüklüğü maksimumda platolara kadar yükseltilmesini içerir. Tibialis anterior, siyatik sinirin fibula dalı tarafından innerve edildiğinden, tibial sinir transeksiyon yaralanmasında korunur. Bu nedenle, tibialis anteriorundan kayıt, elektriksel stimülasyon tedavisinin sürekli izlenmesini sağlar.

Bir tel elektrot tarafından sağ siyatik sinire (5 mA, 0.02 ms) iletilen tek bir uyaran darbesi için, ipsilateral tibialis anteriorunda kaydedilen 5.4 mV negatif pik genliği ile maksimum bir CMAP yanıtı ortaya çıkar (Şekil 7B; siyah iz). Kablosuz, pilsiz implant tarafından sağlanan karşılaştırılabilir bir uyaran darbesi için, 4.6 mV negatif tepe genliği ile karşılaştırılabilir bir CMAP yanıtı ortaya çıkar (Şekil 7B; turuncu iz). Bu, kablosuz sinir stimülasyonunun, tel bazlı sinir stimülasyonundan21

Yazarların çıkar çatışması yoktur.