Yöntem makalesi

Alkolsüz Steatohepatitin Bir Fare Modelinde Karaciğer Hücre Dışı Matriksin 3D Görüntülenmesi

2.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63106

⸱

25 Şubat 2022

 ,  ,  , 
1Gastroenterology and Hepatology, Stanford University

Bu makalede

Özet

Mevcut protokol, alkolsüz steatohepatit (NASH) sırasında hücre dışı matriks (ECM) yeniden şekillenmesinin dinamiklerini görselleştirmek için güvenilir bir platform oluşturmak üzere karaciğer in situ perfüzyon / desellülarizasyon ve iki foton mikroskopi yöntemlerini optimize etmektedir.

Özet

Alkolsüz steatohepatit (NASH), Amerika Birleşik Devletleri'nde 70 milyondan fazla Amerikalıyı etkileyen en yaygın kronik karaciğer hastalığıdır. NASH, fibrozise ve nihayetinde hepatosellüler karsinom için önemli bir risk faktörü olan siroza ilerleyebilir. Hücre dışı matriks (ECM) yapısal destek sağlar ve matrisellüler sinyaller yoluyla karaciğer homeostazını korur. Karaciğer fibrozisi, dinamik ECM yeniden şekillenme sürecindeki bir dengesizlikten kaynaklanır ve yapısal elementlerin aşırı birikimi ve glikozaminoglikanlarda ilişkili değişiklikler ile karakterizedir. NASH'ın tipik fibroz paterni, Masson'un trikrom boyası ve Picrosirius Kırmızı lekeleri tarafından gözlemlenen özelliklere dayanarak, genellikle bölge 3 perisinüzoidal / perisellüler fibrozdan oluşan "tavuk teli" olarak adlandırılır. Bununla birlikte, bu geleneksel ince iki boyutlu (2D) doku slaytına dayalı görüntüleme teknikleri, ayrıntılı üç boyutlu (3D) ECM yapısal değişikliklerini gösteremez ve karaciğer fibrozunda dinamik ECM yeniden şekillenmesinin anlaşılmasını sınırlar.

Mevcut çalışma, yukarıdaki zorlukları ele almak için desellülarizasyon yoluyla karaciğerdeki doğal ECM yapısını görüntülemek için hızlı ve verimli bir protokolü optimize etti. Fareler 14 hafta boyunca chow veya fast-food diyeti ile beslendi. Desellülarizasyon in situ portal ven perfüzyonundan sonra yapıldı ve iki fotonlu mikroskopi teknikleri doğal ECM'deki değişiklikleri görüntülemek ve analiz etmek için uygulandı. Normal ve NASH karaciğerlerinin 3D görüntüleri yeniden oluşturuldu ve analiz edildi. İn situ perfüzyon desellülarizasyonunun yapılması ve iskelenin iki foton mikroskobu ile analiz edilmesi, karaciğerdeki dinamik ECM yeniden şekillenmesini görselleştirmek için pratik ve güvenilir bir platform sağlamıştır.

Giriş

Non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD), yetişkin popülasyonun% 20-25'ini etkileyen en yaygın karaciğer hastalığıdır. NAFLD hastalarının% 25'i siroz, karaciğer yetmezliği ve hepatosellüler karsinom riskinin arttığı alkolsüz steatohepatite (NASH) ilerler1. Önümüzdeki 20 yıl içinde, NASH'ın ABD 2'de2 milyon karaciğere bağlı ölümden sorumlu olacağı tahmin edilmektedir. Onaylanmış tedavileri olmadığından, NASH hastalarında karaciğer fibrozuna neden olan mekanizmaların deşifre edilmesine ve hedefe yönelik tedavinin geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır3.

Hücre dışı matriks (ECM), doku homeostazını düzenlemek için hücrelerle çift yönlü iletişim kuran dinamik, karmaşık bir mikro ortamdır4. Karaciğer ECM, fiziksel ve yapısal destek sağlamak için proteoglikanlar, kollajenler, fibronektin, elastin ve diğer yapısal olmayan proteinler (örneğin, olfaktomedin ve trombozpondin) gibi yapısal elemanlardan oluşur4.

Karaciğer fibrozisi, NASH3 dahil olmak üzere çeşitli etiyolojilerin karaciğer hasarına karşı kronik yara iyileşmesi yanıtıdır. Dinamik ECM matriks yeniden şekillendirme sürecindeki bir dengesizlikten kaynaklanır ve yaralı karaciğerde aşırı yapısal proteinler ile karakterizedir4. Fibrogenez, farklı hepatik hücre tipleri arasındaki dinamik hücre-hücre iletişimine bağlıdır. Hepatik yıldız hücreleri (HSC'ler), aktive edildiğinde, Düz Kas Alfa 2 Aktin eksprese eden, göç eden ve çoğalan miyofibroblast benzeri hücrelere farklılaşır ve ECM proteinlerini yara kapatma eylemi olarak sentezler. Aktive HSC'ler karaciğerdeki merkezi kollajen üreten hücrelerdir1.

ECM yeniden şekillenmesinin moleküler mekanizması, fibrozis paternleri ve hücresel olaylarla ilişkisi açık değildir. Kütle spektrometresi teknikleri ECM protein bileşimi4'ün analiz edilmesine yardımcı olsa da, üç boyutlu (3D) ECM yapısının daha iyi anlaşılması hala gereklidir. Geleneksel olarak, Masson'un trikrom boyası, Picro Sirius Kırmızı lekeleri ve ikinci harmonik nesil (SHG) görüntüleme iki boyutlu (2D) ince karaciğer kesitlerinde gerçekleştirilmiştir. NASH'ın tipik fibroz paterni, bölge 3'e uzanan ve perisinüzoidal / perisellüler fibroz 5,6 olan "tavuk teli" olarak adlandırılır. Bununla birlikte, doğal karaciğerin 3D yapısına, özellikle de doku bölümlemesini içermeyenlere odaklanan çalışmaların eksikliği olmuştur. Karaciğer fibrozisinde dinamik ECM yeniden şekillenmesi sırasında fibrozisin paternlerini ve özelliklerini tanımlamak için sağlam görüntüleme yaklaşımları, NASH mekanizmalarının anlaşılmasını ve yeni terapötik hedeflerin belirlenmesini önemli ölçüde güçlendirecektir.

Bu zorlukların üstesinden gelmek için, doğal karaciğer ECM'sini hücre desellülarizasyonu yoluyla görüntülemek için hızlı ve verimli bir protokol optimize edilmiştir7. Tüm karaciğer desellülarizasyonu, deterjan perfüzyonu yoluyla doğal 3D ECM ağını korurken hepatik hücresel içeriği uzaklaştırmak için bir yaklaşımdır. Fareler 14 hafta boyunca chow veya fast-food diyeti (FFD) ile beslendi. Üçlü helisel ve doğal fibriller kollajen yapılarını korumak için hafif deterjan ve düşük akış hızı ile in situ portal ven perfüzyonu sonrası desellülarizasyon yapıldı. ECM'de kollajen yapılarındaki değişiklikleri analiz etmek için iki foton mikroskobu uygulandı. Normal ve NASH karaciğerlerindeki doğal ECM yapısının 3D görüntüleri yeniden oluşturuldu ve analiz edildi. İn situ perfüzyon desellülarizasyonunun yapılması ve iskelenin iki foton mikroskobu ile analiz edilmesi, karaciğerdeki dinamik ECM yeniden şekillenmesini görselleştirmek için pratik ve uygun fiyatlı bir platform sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan deneyleri, Stanford Üniversitesi'nin kurumsal hayvan bakım ve kullanım komiteleri (IACUC'ler) ve Palo Alto'daki Gazi İşleri Hastanesi tarafından onaylanan deneysel prosedürlere göre gerçekleştirilir. 6-8 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri, 14 hafta boyunca içme suyunda% 4.2 yüksek fruktozlu mısır şurubu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile desteklenmiş bir chow veya fast-food diyeti ile beslendi5. Fareler 12 saatlik bir karanlık / aydınlık döngüsünde standart kafeslerde tutuldu.

1. Karaciğer perfüzyonunun cerrahi hazırlığı ve prosedürleri

  1. İşlemden önce fareyi tartın.
  2. İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla Ketamin (90 mg / kg) ve Xylazine (10 mg / kg) (bkz. Bir sonraki adıma geçmeden önce farenin ayak parmağıyla kıstırma ile tamamen uyuşturulduğundan emin olun.
    NOT: Burada izofluran'a gerek yoktur, çünkü bu hayatta kalmayan bir ameliyattır.
  3. Ventral bölgeyi bir saç kesme makinesi kullanarak tıraş edin ve cildi% 70 etanol ile dezenfekte edin. Fareyi sırtına yerleştirin ve ameliyat tahtasındaki bacakları bantla hareketsiz hale getirin.
  4. Anestezinin derinliğini bir ayak parmağı sıkışmasıyla tekrar doğruladıktan sonra, alt karın bölgesinde lateral olarak 3 cm'lik bir kesi yapmak için Mayo makası ve Adson forseps kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve daha sonra alt karın bölgesinden ksifoid sürece dikey olarak 5 cm'lik bir kesi yapın. Göğüs boşluğunu açmamaya dikkat edin.
  5. Peritonu açtıktan sonra, bağırsakları yavaşça hayvanın soluna yerleştirin ve portal damarı ortaya çıkarmak için karaciğerin sağ lobunu Rayon uçlu bir aplikatör ile yükseltin (bkz.
  6. Portal veni 24 G IV kateter kullanarak kateterize edin. Kateteri portal venin distal ucuna sokun. Kateter ucunu portal ven dalları hepatik loblara dallanmadan önce yerleştirin.
  7. Kateter damara girdiğinde iğneyi hemen çekin. Kateter yoluyla 1mL'lik bir şırınga kullanarak karaciğeri PBS ile perfüze ederek kateterin damar içine doğru şekilde yerleştirildiğini kontrol edin.
    NOT: PBS perfüzyonu üzerine, tüm loblar hemen ağartmalıdır. Kateter doğru yerleştirilirse, venöz kan kateterden hızla akacaktır.
  8. Portal venin dallanmasının altına bir dikiş ve kateteri sabitlemek için 1 cm aşağıya ikinci bir dikiş yerleştirmek için Dumont mikro forseps, Castroviejo mikroiğne tutucu ve 4-0 sütür (bkz.

2. Doku desellülarizasyonu

  1. Kateteri bir Luer konektörü ile bir silikon boruya (~ 1 m uzunluk, 3 mm iç çap ve 4,1 mm dış çap) bağlayın. Silikon boruyu peristaltik bir pompaya ve deiyonize su içeren bir rezervuara bağlayın (bkz.
  2. Tüpün içindeki hava kabarcıklarını dikkatlice çıkarın ve perfüzyon sırasında yeni kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Peristaltik pompayı 0,2 mL/dak (yani 288 mL/24 saat) akış çıkışına ayarlayın.
  3. İlk önce 2 saat boyunca deiyonize su (~ 50 mL / fare) ile perfüze edin. Perfüzyon sırasında karaciğerin rengi kırmızıdan sarıya değişecektir.
    NOT: Hayvanın süresi 10 dakikalık perfüzyondan sonra sona erecektir.
  4. Perfüzyon çözeltisini %0,5 (ağırlık/hacim) sodyum deoksikolata (DOC, bakınız Malzeme Tablosu) değiştirin ve gece boyunca devam edin (18 saat, ~250mL/fare). Perfüzyon sonunda karaciğer beyazlaşır (Şekil 1).
  5. Perfüzyon çözeltisini deiyonize suya (~ 50 mL / fare) değiştirin ve 2 saat boyunca perfüze edin.
  6. Dumont mikro forseps ve mikro yaylı makas kullanın (bkz. Malzeme Tablosu) ve hücreden arındırılmış karaciğeri toplamak ve PBS ile Petri kabında dikkatlice yıkayın.
  7. Hücreden arındırılmış dokuyu anında görüntüleme için küçük parçalara ayırın veya tandem kütle spektrometrisi, ELISA veya batı lekesi gibi daha ileri biyokimyasal analizler için -80 ° C'de dondurun.

3. Görüntüleme için slayt hazırlama (multifoton/konfokal floresan mikroskobu ile)

  1. Küçük bir desellülarize karaciğer parçasını (<3 x 3 x 3 mm) mikroskop slaytına aktarın ve dokuyu ortasına yerleştirin.
  2. Dokunun kurumasını önlemek için bir pipetle dokuya 10 μL antifade montaj ortamı (bkz. Malzeme Tablosu) ekleyin.
  3. Dokuyu bir kapak camıyla örtün ve numuneyi düzleştirmek için küçük bir kuvvet uygulayın. Kapak camının kenarlarını renksiz ve şeffaf oje ile kapatın (Şekil 2).
    NOT: Dik iki fotonun mikroskoptan ayarlanması nedeniyle, numune üzerinde bir kapak camı kullanılmıştır. Bununla birlikte, ters çevrilmiş bir mikroskop kullanıldığında örnekler farklı şekilde yerleştirilebilir.

4. Görüntü alma

  1. Kapak camının üstüne bir damla daldırma yağı yerleştirin ve slaytı mikroskop slayt tutucusuna yerleştirin. 20x yağ objektif lensini, daldırma yağına temas edene kadar indirin.
  2. Mor (405 nm) kanala geçin, deklanşörü açın ve örneğe odaklanın. Görüntüleme için ilgi alanında gezinin ve konumlandırın. Lazer ışığını kullanarak görüntü yakalamaya geçmeden önce deklanşörü kapatın.
  3. Bilgisayar kontrolüne geçin ve iki fotonlu lazeri başlatın. Önce iki fotonlu lazeri açın (Şekil 3A), ardından iki fotonlu lazer kontrol cihazını (bkz. Malzeme Tablosu) ve deklanşörü (Şekil 3B, C) açın. Çıkış gücünün 2,5 W'tan yüksek olduğundan emin olun.
    Floresan söndürmeyi önlemek için lazer gücünü azaltın. Seçilen floroforları barındırmak için dedektörleri (hem fotoçarpanlar hem de hibrit) seçin ve ayarlayın.
    NOT: İki fotonlu görüntüleme, 860 nm'lik bir uyarma dalga boyunda gerçekleştirildi. Kollajen SHG ve iki foton uyarılmış floresan (TPEF) görüntüleri için sırasıyla iki kanal seçildi. 415-445 nm dalga boyu aralığına karşılık gelen bir kanal, SHG sinyallerinden kollajenin ayrıntılı yapısını tespit etti. Başka bir kanal, TPEF sinyallerini toplamak için 465-669 nm aralığını kapsıyordu.
  4. Eşzamanlı veya sıralı görüntü alımlarını seçin. İğne deliğini en yüksek değere ayarlayın. Lazer dalga boylarını, kazancı, gücü ve ofseti ayarlayın. Piksel bekleme süresini, piksel boyutunu, ortalamasını ve yakınlaştırmayı ayarlayın (Şekil 4A).
  5. Bilgisayar z-denetleyicisini kaydırın ve z-boyutlarını ayarlayın, başlangıç ve bitiş noktalarını tanımlayın ve bir birim (z-yığını) içinde verilen görüntü sayısını seçin. Görüntüleri alın.
    NOT: Burada 20 μm Z hacim ve 1 μm Z-adım boyutu seçilmiştir (Şekil 4B).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Kollajen lifleri ikinci harmonik jenerasyon ve iki foton mikroskobu ile tespit edildi. Sinyal, kırılabilir üçlü sarmal ve doğal fibriller kollajen yapılarından gelir. Kollajen alt tiplerini analiz etmek için spesifik antikorlar kullanılmadı; Bununla birlikte, bu görüntüleme tekniğine eklenebilir.

Karaciğer dokusu desellülarizasyon olmadan incelendiğinde, kollajen ağının yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek zordur (Şekil 5A). Hücresizleştir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut protokol, düşük akış hızına sahip DOC in situ perfüzyon yoluyla desellülarizasyonun, NASH karaciğer fibrozisinde dinamik ECM yeniden şekillenmesini yakalamak için güvenilir ve uygun maliyetli bir platform sağlayarak, kırılabilir üçlü sarmal ve doğal fibriller kollajen yapılarını koruduğunu göstermektedir. ECM bileşenlerini tanımlamadan veya hücre kültürü için biyolojik iskeleler oluşturmadan önce normal ve fibrotik karaciğerlerde desellülarizasyon yapılmasına rağmen, karaciğer fibrozisinde ECM yeniden şek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar bu makale ile ilgili çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Teknik yardım için Hyesuk Park'a teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, NJT'ye), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA), NIH (1R01AG060726, NJT'ye) tarafından finanse edilmiştir. Beckman Merkezi'ndeki Hücre Bilimleri Görüntüleme Tesisi'nden Jon Mulholland ve Kitty Lee'ye iki fotonlu mikroskopi görüntüleme ile ilgili teknik yardım için minnettarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4-0 MONOCRYL BOYASIZ 1 x 18 "P-3MONOCRYLY494G
4-0 sütürfisher scientific10-000-649https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true
AnaSed Enjeksiyonu (ksilazin)AnaSedNDC 59399-110-20bu ilaç lisanslı bir veteriner tarafından veya onun emriyle kullanılmak üzere.
BC TEKNOLOJİLİ BD INSYTE AUTOGUARD I.V. KATETERBD
Chow diyetiEnvigo# 2918Kontrol diyeti. Yüksek kaliteli malzemelerle üretilmiş ve gebeliği, emzirmeyi ve kemirgenlerin büyümesini desteklemek için tasarlanmış sabit formüllü, otoklavlanamayan bir diyet.
Fast-food diyeti (AIN76A Batı Diyeti)Test Diyeti1810060https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf
Hematoksilen ve Eozin Leke KitivectorlabsH-3502https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html
Kent Scientific Sıçan Cerrahi KitiFisher Scientific13-005-205https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit
KETAMİN HİDROKLORÜR ENJEKSİYONUVedcoNDC 50989-996-06 - 10 mL - şişe.KetaVed, Uygulama ve Dozaj altında listelenen türlere ek olarak insan altı primatlarda klinik olarak incelenmiştir.
Leica SP5 dik Konfokal, çok fotonluLeicaSP5
Luer konnektör (SPIN-LOCK® ile üç musluk)bbraunD300 https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html
Picrosirius Kırmızı Leke KitiPolysciences, Inc.24901https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771
Rayon uçlu aplikatörpüriten25-806 1PR
Sodyum deoksikolatsigmaaldrichD6750-100G
Şurupwww.target.com 24 fl ozhttps://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801
Değişken Hızlı Peristaltik PompaINTLLABBT100https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1
VECTASHIELD Antifade Montaj OrtamıvectorlabsH-1000-10https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html
382612

Kaynaklar

  1. Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
  2. Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
  3. Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
  4. Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome - looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115(2020).
  5. Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
  6. Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
  7. Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
  8. Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83(2019).
  9. Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398(2016).
  10. Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
  11. Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
  12. Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356(2020).
  13. Cox, T. R. The matrix in cancer. Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).
  14. Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
  15. Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079(2015).
  16. Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183(2020).
  17. Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ECM Yeniden ModellemeKaraci er FibrozisiDesell larizasyon Protokolki Foton MikroskopisiKollajen LiflerFare Karaci er G r nt lemePicrosirius Red BoyamaPortal Ven Perf zyonu

İlgili makaleler