Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Summary

Diyabetik retinopati körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Histoloji, kan-retinal bariyer parçalanma testi ve floresan anjiyografi, retinanın patofizyolojisini anlamak için değerli tekniklerdir ve bu da diyabetik retinopatiye karşı etkili ilaç taramasını daha da artırabilir.

Abstract

Diyabetik retinopati gibi bir arka segment göz hastalığı retinanın fizyolojisini değiştirir. Diyabetik retinopati retina dekolmanı, kan-retina bariyerinin (BRB) parçalanması ve retinal anjiyogenez ile karakterizedir. Bir in vivo sıçan modeli, retinanın yapısındaki ve işlevindeki değişiklikleri incelemek için değerli bir deneysel araçtır. Sıçan modelinde retina hücrelerinin, retina vaskülatürünün ve hasar görmüş BRB’nin morfolojik değişikliklerini tanımlamak için üç farklı deneysel teknik öneriyoruz. Retinal histoloji, çeşitli retina hücrelerinin morfolojisini incelemek için kullanılır. Ayrıca retina hücre sayımı ve farklı retina tabakalarının kalınlık ölçümü ile kantitatif ölçüm yapılır. BRB’nin parçalanması nedeniyle ekstraoküler proteinlerin plazmadan vitreus dokusuna sızmasını belirlemek için BRB parçalanma testi kullanılır. Floresan anjiyografi, FITC-dextran boyası kullanarak retinal vaskülatürü görselleştirerek anjiyogenezi ve kan damarlarının sızıntısını incelemek için kullanılır.

Introduction

Diyabetik retinopati (DR), diabetes mellitusun en karmaşık sekonder komplikasyonlarından biridir. Aynı zamanda dünya çapında çalışma çağındaki nüfusta önlenebilir körlüğün önde gelen nedenidir. 32.4 milyon kör insanın yakın tarihli bir meta-analizinde, 830.000 (% 2.6) kişi ^DR1 nedeniyle kördü. Diyabete atfedilen görme kaybı oranı, 2015 yılında dünya çapında %1,06 (0,15-2,38) ile yedinci sırada yer ^{almıştır2,3}.

Diyabetik retinopati tanısı arka oküler dokulardaki vasküler anormallikler ile konur. Klinik olarak, retinadaki vaskülarizasyona bağlı olarak Proliferatif Olmayan DR (NPDR) ve Proliferatif DR (PDR) olmak üzere iki aşamaya ayrılır. Hiperglisemi, retinada nörodejenerasyon4,5, ^{inflamasyon6,7} ve mikrovaskülatür8 ile ilgili çeşitli yolları içerdiği için DR’nin güçlü düzenleyicisi olarak kabul edilir. Hiperglisemiye bağlı olarak indüklenen çoklu metabolik komplikasyonlar arasında ileri glikasyon son ürünlerinin (AGE’ler), polyol yolunun, hekzozamin yolunun ve protein kinaz-C yolunun birikmesi sayılabilir. Bu yollar, diyabetik retinopatinin farklı evrelerine bağlı olarak hücre proliferasyonu (endotel hücreleri), migrasyon (perisitler) ve apoptozdan (nöral retina hücreleri, perisitler ve endotel hücreleri) sorumludur. Bu metabolik değişiklikler retina dekolmanı, retina hücrelerinin kaybı, kan-retina bariyerinin (BRB) parçalanması, anevrizmalar ve anjiyogenez gibi fizyolojik değişikliklere yol ^açabilir9.

Streptozotosin (STZ) ile indüklenen tip-1 diyabet, diyabet patogenezini ve komplikasyonlarını değerlendirmek için sıçanlarda iyi bilinen ve iyi kabul görmüş bir uygulamadır. STZ’nin diyabetojenik etkileri, pankreas adacığının seçici yıkımına bağlıdır β ^hücreler10. Sonuç olarak, hayvanlar insülin eksikliği, hiperglisemi, polidipsi ve poliüriye maruz kalacaktır ve bunların hepsi insan tipi-1 diabetes ^{mellitusun karakteristiğidir11}. Şiddetli diyabet indüksiyonu için STZ, yetişkinlik döneminde intravenöz veya intraperitoneal olarak 40-65 mg / kg vücut ağırlığında uygulanır. Yaklaşık 72 saat sonra, bu hayvanlar 250 mg / ^{dL10,12’den} daha yüksek kan şekeri seviyeleri ^sunar.

Retinanın nörodejenerasyon, inflamasyon ve anjiyogeneze bağlı fizyolojik değişikliklerini anlamak için, deneysel hayvan modellerinde farklı teknikler optimize edilmelidir. Retina hücreleri ve retina damarlarındaki yapısal ve fonksiyonel değişiklikler histoloji, BRB yıkım testi, floresan anjiyografi gibi çeşitli tekniklerle incelenebilir.

Histoloji, hücrelerin, dokuların ve organların anatomisinin mikroskobik düzeyde incelenmesini içerir. Hücrelerin/dokunun yapısı ve işlevi arasında bir korelasyon kurar. Doku yapısındaki mikroskobik değişiklikleri görselleştirmek ve tanımlamak, böylece sağlıklı ve hastalıklı meslektaşları karşılaştırmak için birkaç adım ^{gerçekleştirilir13}. Bu nedenle, histolojinin her adımını titizlikle standartlaştırmak esastır. Retinal histolojide yer alan çeşitli adımlar numunenin fiksasyonu, numunenin kesilmesi, dehidrasyon, temizleme, parafin ile emprenye etme, parafin gömme, kesitleme ve boyama (Hematoksilin ve Eozin boyama)^13,14.

Sağlıklı bir retinada, moleküllerin retina boyunca taşınması, iç tarafta endotel hücreleri ve perisitlerden ve dış tarafta retinal pigment epitel hücrelerinden oluşan BRB tarafından kontrol edilir. Bununla birlikte, iç BRB endotel hücreleri ve perisitler hastalıklı durum sırasında dejenere olmaya başlar ve BRB de tehlikeye ^girer15. Bu BRB parçalanması nedeniyle, birçok düşük molekül ağırlıklı molekül vitreus ve retina dokusuna ^{sızmaktadır16}. Hastalık ilerledikçe, diğer birçok protein molekülü (düşük ve yüksek moleküler ağırlık) da homeostaz bozukluğu nedeniyle vitreus ve retina dokusuna ^{sızmaktadır17}. Çeşitli diğer komplikasyonlara ve sonuçta makula ödemi ve körlüğe yol açar. Bu nedenle, vitreustaki protein seviyelerinin ölçülmesi ve sağlıklı ve diyabetik durumların karşılaştırılması, BRB’nin tehlikeye atıldığını ölçer.

Floresan anjiyografi, floresan boya kullanarak retina ve koroidin kan dolaşımını incelemek için kullanılan bir tekniktir. İntravenöz yolla veya kardiyak enjeksiyon yoluyla floresein boyası enjekte edilerek retina ve koroid vaskülatürünü görselleştirmek için ^{kullanılır18}. Boya enjekte edildikten sonra, önce retinal arterlere, ardından retinal damarlara ulaşır. Bu boya sirkülasyonu genellikle boya enjeksiyonundan itibaren 5 ila 10 dakika içinde ^{tamamlanır19}. Diyabetik retinopati ve koroidal neovaskülarizasyon dahil olmak üzere çeşitli posterior segment oküler hastalıkların tanısında önemli bir ^tekniktir20. Normal ve hastalıklı durumlarda majör ve minör vaskülatür değişikliklerini tespit etmeye yardımcı olur.

Protocol

Bu protokol, Kurumsal Hayvan Etiği Komitesi, BITS-Pilani, Haydarabad kampüsü tarafından sağlanan tüm hayvan bakım kılavuzlarını takip etmektedir.

1. Retina histolojisi

1. Gözün enükleasyonu ve fiksasyonu
   1. 2 ila 3 aylık diyabetik Wistar erkek sıçanını, intraperitoneal yoldan enjekte edilen yüksek dozda pentobarbital (150 mg / kg) kullanarak yaşa uygun kontrol (14 ila 15 haftalık) ile birlikte ötenazileştirin. Tespit edilebilir hiçbir kalp atışı 2-5 dakika içinde ölümü doğrulamaz.
   2. Gözün burun ve temporal bölgelerinde neşter bıçağı kullanarak kesi yaparak gözü enüklee edin. Daha sonra gözü orbital soketten çıkarmak için forseps ve mikro makas kullanarak kenarları boyunca kesin.
      NOT: Sıçanları feda etmeden önce, fiksatif çözeltileri hazır bulundurun.
      DİKKAT: Formaldehit cildi, gözü, burnu ve solunum yollarını tahriş eder. Güçlü bir cilt hassaslaştırıcı olduğu için kansere de neden olabilir. Eldiven giyin ve kaputun altında ^tutun21.
   3. Kanı çıkarmak için gözü bir Petri kabında 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi ile iyice yıkayın. Fiksatif çözeltinin kolay nüfuz etmesi için gözü çevreleyen fazla yağı çıkarın.
   4. Gözü hemen forseps yardımıyla 5 mL fiksatif çözeltiye yerleştirin ve cam şişelerin duvarlarına yapışmadığından emin olun. Birkaç saniye hafifçe karıştırın ve kapağı uygun etiketleme ile değiştirin. Oda sıcaklığında karanlık koşullarda 24 ila 48 saat boyunca fiksatif çözeltide gözü inkübe edin.
2. Doku kırpma
   1. Fiksasyondan sonra, gözü fiksatif çözeltiden çıkarın, 10 mL PBS ile yıkayın ve 4 ° C’de soğutulmuş 10 mL PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
   2. Mikro forseps kullanarak, gözü optik sinir ile tutun ve mikro makas yardımıyla pars plana’da bir nick yapın. Bir gözün ön fincanını ayırmak için korneanın tüm kenar boşluğunu kesin. Forseps kullanarak, lensi nazikçe seçin, atın ve optik siniri kesin.
   3. Kavisli mikro makas kullanarak, optik diskten geçerek arka vizör adaptörünün uzunlamasına bir bölümünü iki yarıya bölün. Kasetin tabanına yerleştirin ve dokuya herhangi bir rahatsızlık vermeden kapağı düzgün bir şekilde kapatın. Kasetleri doku numunesi adı ve tarihi ile etiketleyin.
3. Dokunun dehidrasyonu, temizlenmesi ve parafin emprenye edilmesi
   1. Kesilen dokuyu% 50,% 70,% 90 ve% 100 etanolün 80 mL’sinde kademeli olarak transfer ederek kurutun. Kasetleri bir konsantrasyondan diğerine aktarırken, kontaminasyonu en aza indirmek için temiz kağıt mendil üzerine bastığınızdan emin olun.
      NOT: Dokunun her transferde 30 dakika (iki kez) bekletin. Bu adım için harcanan toplam süre yaklaşık 4 saattir.
   2. Dehidrasyon üzerine, etanolün ksilen ile değiştirilmesi için kasetleri 30 dakika (iki kez) boyunca 80 mL ksilene aktarın.
      NOT: Ksilen ile inkübasyondan sonra, doku yarı saydam hale gelir.
      DİKKAT: Ksilen, benzen halkalı aromatik bir bileşiktir. Göz ve mukoza zarını tahriş eder ve ayrıca depresyonlara neden olabilir.
   3. Son olarak, dokudaki ksilenin yerini almak için dokuyu 60 ° C’de önceden ısıtılmış parafin ile emprenye edin. Ksilen içeriğini en aza indirmek için kasetleri kağıt mendil üzerine birkaç kez darpın ve 2 saat (1 h x 2) boyunca 200 mL parafin (60 ° C’de sıvı) içine yerleştirin.
      DİKKAT: Erimiş parafini solumaktan kaçının, çünkü solunum rahatsızlığına neden olabilecek küçük lipit damlacıkları üretir.
4. Parafin gömme
   1. Parafin gömme makinesini, parafini eritmek ve istasyonların istenen sıcaklıklara ulaşması için kullanmadan en az 1 saat önce açın. Çelik bir kalıbı sıcak bir yüzeye yerleştirerek erimiş parafin mumu ile doldurun, ardından parafin kabından bir seferde bir kaseti çıkarın.
   2. Çelik kalıbı sıcak bir yüzeyden soğuk bir yüzeye (4 ° C) taşıyın. Bu noktada, kalıptaki balmumu katılaşmaya başlayacaktır. Tamamen katılaşmadan önce, forseps yardımıyla dokuyu balmumuna yerleştirin ve dokuyu, arka kabın optik disk kısmı kalıbın tabanına bakacak şekilde yönlendirin.
      NOT: Dokunun hareket etmediğinden ve istenen oryantasyonunu koruduğundan emin olun. Değilse, tüm parafin sıvılaşana kadar kalıbı tekrar ılık çalışma yüzeyine koyun, ardından adım 1.4.2 ile tekrar başlayın.
   3. Kalıptaki balmumu katılaşmaya başladığında, kaset tabanını hemen kalıbın üzerine yerleştirin. Kalıbı kasetin üst kenarının üstündeki parafin ile dikkatlice doldurun ve hızlı katılaşma için yavaşça soğuk bir yüzeye (-20 ° C’ye yakın) aktarın. Katılaşana kadar, işlemi adım 1.4.2’deki diğer kasetlerle tekrarlayın.
   4. Tüm kalıplar katılaştıktan sonra, çelik kalıbı kasetten ayırın. Zorsa, biraz daha bekleyin ve tekrar deneyin (zorla çıkarmayın). Tam katılaşma ile separasyon daha kolay hale gelir. Şimdi kaset, mikrotom tarafından bölümleme sırasında tutulacak parafin bloğunun tabanı haline gelir.
      NOT: Bu blok daha fazla kullanım için oda sıcaklığında saklanabilir. Bu noktada, işlem durdurulabilir ve daha sonra (gerekirse) devam ettirilebilir.
5. Bölümleme
   1. Bıçak tutucuya tek kullanımlık bir mikrotom bıçağı takın. Kasetlerin etrafındaki fazla parafin mumunu çıkarın, böylece blokların hem üst hem de alt kısımları bıçağa paralel kalır. Bloğu kaset tutucuya takın.
   2. Bloğun yüzeyi bıçağın kenarıyla temas edene kadar ilerletmek için el çarkının kilidini açın. Doku bloğun yüzeyinde görselleştirilinceye kadar blok üzerindeki fazla parafin mumunu kesin. Bölüm kalınlığını 5 μm’ye ayarlayın ve beş ila altı bölümden oluşan bir şerit kesin.
   3. Forseps kullanarak, şeridi açmak için şeridi önceden ısıtılmış su banyosunun yüzeyine (yaklaşık 50 ° C) yavaşça aktarın. Mayer’in albüminiyle kaplı cam bir slayttaki bölümleri, slaytı bölümün altında tutarak toplayın. Bölümleri yavaşça kaldırın ve kızakların 37 ° C’de gece boyunca yatay olarak kurumasını bekleyin.
      NOT: Slaytlar oda sıcaklığında kuru kutularda birkaç ay saklanabilir. Bu adımda, işlem durdurulabilir ve daha sonra devam ettirilebilir.
6. Boy -ama
   1. Parafinin erimesi için kullanmadan önce 60 °C’de sıcak hava fırınında lekelenecek kızakları 1 saat ısıtın ve Tablo 1’de belirtilen adımları izleyin.
      DİKKAT: Hematoksilin ve Eozin lekeleri solunduğunda veya yutulduğunda toksiktir. Kanserojen oldukları bildirilmiştir.

Reaktif	Ayakta Durma Süresi	Tekrarlama (Kaç kez)
Ksilen	5 dk	2
%100 Etanol	5 dk	2
%90 Etanol	5 dk	2
%70 Etanol	5 dk	2
%50 Etanol	5 dk	2
Su	5 dk	2
Hematoksilen	4 dk	1
Su ile yıkama
%1 %70 Etanol içinde asit alkol	30 Saniye	1
Su ile yıkama
Scott’ın suyu	1 dk	1
Su ile yıkama
%50 Etanol	1 dk	1
%95 Etanol	1 dk	1
% 0.25 Eozin	5 sn.	1
Su ile yıkama
Su	2 dk	1
%95 Etanol	1 dk	1
%100 Etanol	1 dk	1
Ksilen	5 dk	2
Montaj ve kapak kaydırma

Tablo 1. Hematoksilin ve Eozin boyama prosedürü

2. Kan-beyin bariyeri parçalanma testi

1. Kan ve vitreus toplanması
   1. 2 ila 3 aylık diyabetik Wistar erkek sıçanını, ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (8 mg / kg) kullanarak yaşa uygun kontrol (14 ila 15 hafta) ile birlikte anestezi uygulayın. Anestezik durumu pedal çekme refleksi (ayak parmağı sıkışması) ile onaylayın. Plazmayı tam kandan ayırmak için hemen etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kaplı bir tüpe kardiyak ponksiyon yoluyla 1 mL kan toplayın.
   2. İntraperitoneal yoldan enjekte edilen yüksek dozda pentobarbital (150 mg / kg) kullanarak sıçanı ötenazileştirin. Tespit edilebilir hiçbir kalp atışı 2-5 dakika içinde ölümü doğrulamaz. Gözü enüklee edin ve hemen kuru buz üzerine yerleştirin.
   3. Gözü kuru buzun üzerinde temiz bir Petri kabına yerleştirin (önerilir) ve adım 1.2.2’de belirtildiği gibi gözü diseke etmeye başlayın.
   4. Lensi çıkarın, vitriosu mikro forseps kullanarak arka bardaktan dikkatlice çekin ve üç ila dört cam boncuk (2-4 mm) içeren bir homojenizasyon tüpüne yerleştirin.
      NOT: Dondurucu koşullar altında lensin ve vitreusun çıkarılması daha kolay olduğu için kuru buz üzerinde diseksiyon yapılması önerilir.
2. Numunelerin hazırlanması
   1. Vitröz mizahı bir boncuk homojenizatöründe 10 sn boyunca orta hızda homojenize edin.
   2. Kan (1 mL) ve vitreus numunelerini (10-20 μL) mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve her iki numuneyi de 4 ° C’de 10 dakika boyunca 5200 x g’de santrifüj edin.
      NOT: Başarılı homojenizasyon durumunda, vitreus santrifüjlemeden sonra homojen bir kıvama sahiptir. Bununla birlikte, vitreusun homojen olmayan kıvamında olması durumunda, artan homojenizasyon süresi ile adım 2.2.1’den itibaren tekrarlayın.
   3. Her iki numuneden de süpernatant toplayın ve PBS ile vitreus mizah ve plazma örneklerini sırasıyla 1:10 ve 1:20 oranında seyreltin.
3. Protein miktarı ve vitreus-plazma protein oranı
   1. Vitröz mizah ve plazma numunelerinde protein konsantrasyonunu ölçmek için, 250 μL Bradford reaktifine 5 μL seyreltilmiş numune ekleyin, iyice karıştırın ve 40 dakika içinde 590 nm’de absorbansı okuyun.
      NOT: Numunelerin absorpsiyon değeri 1.0’ın üzerindeyse, numuneleri daha fazla seyreltin ve adım 2.2.3’teki prosedürü tekrarlayın.
   2. Vitröz protein seviyesini aynı sıçandan plazma protein seviyesine normalleştirin ve sağlıklı ve diyabetik sıçanlar arasındaki kıvrım farkını ölçün.

3. Floresan anjiyografi

1. _{FITC-dextran70000} boya enjeksiyonu
   1. 2 ila 3 aylık diyabetik Wistar erkek sıçanını% 3 izofluran kullanarak yaşa uygun kontrol (14 ila 15 hafta) ile birlikte anestezi uygulayın ve pedal çekilme refleksini (ayak parmağı sıkışması) onaylayın. Kuyruğu ılık su (37-40 ° C) içeren bir beherin içine batırın. Boyayı enjekte etmeden önce kuyruğu% 70 etanol ile temizleyin. Kuyruğun yanal damarını bulun ve kuyruğun alt kısmındaki enjeksiyon pozisyonunu işaretleyin.
      NOT: İğnenin yerleştirilmesi başarısız olursa, geçerli konumun üzerinde başka bir yere yerleştirmeyi deneyin (ucu kuyruğun tabanına kadar). Bununla birlikte, tekrarlanan iğneleme, sıçanda stres gelişimine yol açabileceğinden, vazokonstriksiyona neden olabileceğinden, bir kez enjekte edilmesi tavsiye edilir.
   2. Kuyruk damarından 1 mL 50 mg/mL _{FITC-dextran70000} boya çözeltisi enjekte edin ve boyanın 5 dakika boyunca dolaşmasına izin verin. Sıçanı, intraperitoneal yoldan enjekte edilen yüksek dozda pentobarbital (150mg / kg) ile ötenazileştirin. Tespit edilebilir hiçbir kalp atışı 2-5 dakika içinde ölümü doğrulamaz. Adım 1.1.1’de belirtildiği gibi gözü enüklee edin.
      NOT: Gerekirse, göz en fazla 30 dakika boyunca %4 formaldehit çözeltisine sabitlenebilir.
2. Düz montaj hazırlığı
   1. Düz montajlar hazırlamak için, diseksiyon aletlerini slaytlar ve kapak kaymaları ile birlikte hazır bulundurun. Gözü soğutulmuş PBS ile dolu bir Petri kabına yerleştirin ve adım 1.2.2’de belirtildiği gibi gözü diseke etmeye başlayın.
   2. Şimdi sivri uçlu bir forsepilin ucunu sklera ve retina arasına yerleştirin. Retinanın herhangi bir noktada skleraya bağlı olmadığından emin olarak bardağın kenarı boyunca yavaşça hareket ettirin. Herhangi bir tıkanıklık varsa, kavisli mikro makas kullanarak jant boyunca bu kısmı yavaşça kesin.
   3. Retinanın skleraya herhangi bir taraftan bağlanmadığı doğrulandıktan sonra, optik diskin yakınında kesin, retinanın skleradan tamamen ayrılacağı şekilde küçük bir delik açın. Retinayı yavaşça PBS çözeltisine itin ve spatula veya forseps yardımıyla temiz ve düz bir slayta yerleştirin.
   4. Mikro makas veya neşter bıçakları kullanarak, retina dokusunda küçük kesikler yapın ve dört kadrana bölün. Kesiklerin, Şekil 1’de gösterildiği gibi, optik diskin merkezde bıraktığı delikten en az 2 mm uzakta olduğundan emin olun.
   5. Düz montajı bozmadan 0,2 mL uçlar kullanarak fazla PBS’yi dokunun kenarlarından çıkarın.
   6. Düz bir montaj üzerine bir damla solmaya karşı montaj ortamı (50 μL ila 100 μL) yerleştirin, bir kapak kayması ile örtün ve hemen bir konfokal mikroskop altında görselleştirin.
      NOT: Tüm prosedür boyunca minimum ışığı koruyun.
3. Düz montajın görselleştirilmesi
   1. Düz montajı, bir konfokal mikroskobun 10x hedefi altında görselleştirin. Tüm düz montajı tek bir görüntü olarak yakalamak için karo taraması gerçekleştirin. Fayans sayısı, retinal düz montajın boyutuna bağlıdır. Ayrıca, damarları ve arterleri farklı odaklarda görselleştirmek için Z-istifleme yapın (Z-yığını için tercih edilen boyut, hangisine bağlı olarak, Z-yığını adımlarının sayısının değiştiğine bağlı olarak 5 μm’dir).
   2. PMT ve HyD dedektörünü sırasıyla 700-900 ve 100-150 olarak % kazançta kullanın. FITC-dextran boyası için 510-530 nm arasındaki emisyon aralığını seçin.

Representative Results

Discussion

Histoloji
Retina histolojisi, retina hücrelerinin ve tabakalarının morfolojik değişikliklerini görselleştirmek için yapılır. Fiksatif çözelti seçimi, fiksasyon süresi, dehidrasyon ve parafin emprenye etme dahil olmak üzere çeşitli adımların optimize edilmesi gerekir. Fiksatif penetrasyon yavaşladığı için doku boyutu 3 mm’yi geçmemelidir. Yaygın olarak kullanılan %4’lük paraformaldehit, çözeltinin sulu mizah ve vitreus mizahına kıyasla nispeten yüksek ozmolaritesi nedeniyle sağlıklı gözde bile retina dekolmanı ile sonuçlanır ve bu da yanlış pozitif sonuçlara yol ^açar23. Çözeltinin yüksek ozmolaritesi hacim daralmasına neden olur ve dokuların büzülmesine neden olur. Bu protokolde kullanılan fiksatif çözelti,% 1.25 glutaraldehit ile% 1.25 formaldehittir, bu da nispeten daha az ozmolariteye sahiptir, doku bozulmasını azaltır, retina pigmenti epitel tabakasından retina dekolmanı en aza indirir ve ayrıca yapıyı doğal haliyle korur. Fiksatif çözeltinin bir başka seçeneği de asetik asit ve formaldehit içeren etanoldür. Fiksatif çözeltinin asidik durumu, dokunun hızlı bir şekilde sabitlenmesine yardımcı olabilirken, etanol fiksatif çözeltinin penetrasyonunu arttırır. Bununla birlikte, etanol ve asetik asit oranının optimize edilmesi esastır, çünkü aşırı konsantrasyon sırasıyla dokunun büzülmesine veya şişmesine neden ^olabilir24. Başarılı doku fiksasyonu için değerlendirme parametreleri retinanın ayrılmasını, sağlam retina tabakalarını ve doku büzülmesini içerir. Fiksasyon yapılırken bir diğer kritik faktör, uygun fiksasyon için gözün boyutunun en az 20 ila 25 katı olması gereken fiksatif çözeltinin ^hacmidir25. Ek olarak, bir çözeltiden diğerine aktarıldığında göz küresini veya dokuyu döndürmek önemlidir, böylece kabın dibine veya duvarlarına yapışmaz.

Parafin ile dehidrasyon ve emprenye dahil olmak üzere tamamlanmamış doku işleme, bloğun yüzeyinde depresyon meydana geldiğinde görselleştirilebilen dokuyu küçültebilir ve kurutabilir. Ek olarak, zayıf doku işleme de suya maruz kaldığında bölümlerin beyaza dönüşmesine neden ^olur25. Doku doğru işlenmezse, parafini çıkarmak için ksilen yoluyla geri alınabilir, ardından etanolün indirgeninde rehidrasyon (yani,% 100 etanol,% 90 etanol ve% 70 etanol). Yine, parafin bloklarını başarıyla hazırlamak için 1.3’ten 1.4’e kadar olan adımları tekrarlayın.

Parafin blokları hazırlanırken dokunun her taraftan parafin ile çevrelendiğinden ve hava kabarcığı görülmediğinden emin olmak önemlidir. Bloğun hazırlanmasındaki herhangi bir hata, dokunun başarısız bir şekilde kesilmesine yol açacaktır. Bazen işlem sırasında arka fincan katlanır; Bu noktada, forseps (ısıtılmış parafin içinde) kullanılarak hafifçe ayrılabilir, ancak dokuya zarar verdiği ölçüde değil. Parafin katılaşmaya başlarken çelik kalıptaki doku oryantasyonunun istenildiği gibi olmadığını varsayalım; Bu durumda, parafin blokları hazırlamak için dokuyu yeniden yönlendirmek için erimiş parafin ve dokuya geri konulabilir. Ayrıca, dokuyu gömme kalıbına aktarırken, dokunun etrafındaki parafinin katılaşmadığından emin olun. Doku ile bloktaki gömme ortamı (parafin) arasında bir saç çizgisi ayrımı ^oluşturur25. Bu durumda, parafini sıcak parafine yerleştirerek ve tekrar çelik kalıba yerleştirerek dokunun etrafında eritin.

Bölümleme sırasında, bıçak katlanmamış doku şeritleri verecek kadar keskin olmalıdır. Bıçağın belirli bir bölümünü 30 defadan fazla kullanmayın. Blok düzgün bir şekilde kesişmezse, bıçağın kör olduğunu varsayalım ve bu nedenle değiştirin veya yeniden keskinleştirin. Bölümler uygun değilse, uygun olmayan parafin emprenye edilmesi veya blokları emprenye etmek ve hazırlamak için eski parafinin kullanılması da olabilir. Bloktaki parafin eritilebilir ve bloğu hazırlamak için taze parafin kullanılabilir. Düzensiz bölümlerden kaçınmak için, mikrotomun tekerleğini hızlı, sarsıntılı hareketler yerine eşit dönüşlerle yavaşça döndürün.

Hematoksilin ve Eozin boyama yaparken, Hematoksilin ve Eozin boyamasının zamanını optimize etmek, dokuların az veya aşırı boyanmasına yol açabileceği için kritik öneme sahiptir. Parafinin yanlış erimesi veya dokunun rehidrasyonu düzensiz lekelenmeye yol açacaktır. Slayttaki beyaz bölümler olarak görselleştirilebilir. Dokuyu kurutun ve parafini tekrar sıcak hava fırınında eritin, ardından Tablo 1’de belirtilen adımları izleyin. Ayrıca, H&E boyama sırasında yapılan yaygın hatalardan biri, Eozin boyasından sonra dehidrant olarak alkol kullanılmasıdır. Aşırı alkol kullanımı, sitoplazmanın ve inklüzyon cisimlerinin az boyanmasına neden olabilir ve bu da kötü boyanmış bölümlere yol ^açabilir25. Montaj ortamının kullanımı, fazla ksilenin çıkarılmasından hemen sonra yapılmalı ve dokunun bozulmasına neden olabileceğinden ksilenin kurumasından kaçınılmalıdır. Ayrıca, sulu bazlı mountant (PBS’deki gliserol gibi), doku susuz bir durumda olduğu için kaçınılmalıdır. Sulu bazlı mountant dokuya nüfuz etmez ve puslu görüntülere neden olur.

Yukarıda belirtilen tüm adımları optimize ettikten sonra, araştırmacılar histolojiyi başarıyla gerçekleştirebileceklerdir. İstenilen fiksatif çözümü seçme ve diğer proses parametrelerini optimize etme girişimleri yaklaşık üç yıl sürer.

Kan-retina bariyeri parçalanması
Bu teknikteki en hassas adım, vitreusun gözden izole edilmesidir. En iyi taze bir göz üzerinde gerçekleştirilir. Vitreusun kolay izolasyonu için kuru buz kullanılması önerilir, özellikle de vitreus retinaya bağlı kalırsa. Genellikle, vitreus ile lens veya retina karışımı, retinaya bağlı vitreusun bulanıklığı ile tanımlanabilir. Bu sorunlar genellikle donma koşulları kullanılarak önlenebilir. Bununla birlikte, vitreus etiketleri lensin yanındaysa, mikro makas kullanılarak lens ve vitreusun kesiştiği noktada kesilerek ayrılabilirler. Retina vitreus ile birlikte dışarı çekilirse, retina mikro forseps kullanılarak parça parça çıkarılabilir. Vitreusun lensten ve retinadan kolay izolasyonu için filtre santrifüjleme kullanımı da ^{önerilmektedir26}. Vitröz jel benzeri bir yapı olduğundan, homojen bir protein karışımı için homojenizasyona ihtiyaç duyar. Genellikle, adım 2.2.1’de belirtildiği gibi, santrifüjleme üzerine vitreus mizahının sıvılaştırılmasıyla tanımlanabilen uygun homojenizasyon için tek bir homojenizasyon döngüsü yeterlidir. Santrifüjlemeden sonra vitreusun jel yapısı gözlenirse, homojenizasyonu tekrarlayın (adım 2.2.1). Protein niceliği herhangi bir kit yöntemi kullanılarak yapılabilir, ancak 2 μg / μL’ye kadar vitreustaki düşük protein seviyelerini tespit etmeye duyarlı olmalıdır.

Floresan anjiyografi
Bu teknik, retinanın vasküler ağını görselleştirmeyi amaçlamaktadır ve bu nedenle, boyanın retinal mikrodamarlarda eşit olarak ulaşması gerekir. Bunu sağlamak için enjeksiyon bölgesi ve dolaşım süresi gibi çeşitli adımlar optimize edilebilir. Kuyruk damarı enjeksiyonu veya kalp enjeksiyonu yoluyla bir boya enjekte edilebilir. Kardiyak enjeksiyon, iyi eğitilmemişse boyayı kalpten başka bir bölgeye enjekte etme riski; bu nedenle kuyruk damarı enjeksiyonu tercih edilir. Bununla birlikte, lateral venin tanımlanması ılık suya (37-40 ° C) batırıldığında ve% 70 etanol ile temizlendiğinde kolaydır. Etanol, damarın konumuna erişmede yardımcı olabilecek kan damarlarının genişlemesine yardımcı olur. Boyanın sadece damar içine enjekte edilmesi de önemlidir. Kuyruk damarına boya enjekte edilmemesi, boyanın enjekte edilmesi veya deri altı enjeksiyonu nedeniyle yakındaki bölgenin şişirilmesi sırasında dirençle hissedilebilir. İğne çıkarılabilir ve kuyruğun başka bir bölgesine tekrar yerleştirilebilir. Başarılı kuyruk damarı enjeksiyonu, sıçanın zorla idrara çıkmasıyla da görselleştirilebilir; boyanın rengi sıçan idrarında 30 ila 40 s arasında görülebilir.

Ayrıca, dolaşım süresi esastır; Genellikle, retina damarlarında boyayı başarılı bir şekilde dolaştırmak için 5 ila 10 dakika yeterlidir. Düz bir montaj taze bir gözle veya sabit bir gözle hazırlanabilir. Taze bir gözde düz bir montaj hazırlamak zor olabilir, ancak bir kez ustalaşıldığında, teknik en çok fiksasyon sırasında olduğu gibi tercih edilir, boya fiksatif çözeltide sızmaya ^başlar27. Bu nedenle, fiksasyon tüm göz için 30 dakikadan fazla uzatılmamalıdır. Taze retinayı ayırmakta zorluk çekmesi durumunda, arka kabı 15 ila 20 dakika boyunca ön kaptan ayırdıktan sonra fiksatif bir çözeltiye (% 4 formaldehit) bile sabitlenebilir. Boyanın sağlıklı retinada bile kan damarlarından çevre dokuya sızdığı sıklıkla görülür. Bunun nedeni aşırı fiksasyon olabilir; Bu nedenle, fiksasyon için gereken süre optimize edilmelidir. Sadece retinanın kolay izolasyonunu arttırır ve yapıyı gelecekte kullanmak üzere korur. Ayrıca, hayvandaki boyanın dolaşım süresinin artması, retina damarlarından çevre dokuya boya sızıntısına neden olabilir ve bu da optimize edilmesi gerekir.

FITC-dextran boyutu, daha yüksek moleküler ağırlıklı boya mikro vaskülatürlere girmeyeceği için esastır. Buna karşılık, daha düşük moleküler ağırlıklı boya, sağlıklı retinanın yeni damarlarından ^{sızacaktır28}. Bu nedenle, floresan anjiyografi yapmak, retinadaki sızıntı ve vaskülatürü görselleştirmek için 70 kD moleküler ağırlığa sahip FITC-dextran tercih edilir. Bununla birlikte, bu tekniğin önemli bir sınırlaması, diyabetik sıçanlarda neovaskülarizasyonun gelişim süresi ve gelecekte elektroretinogram, fundus ve diğer invaziv olmayan optik aletler gibi invaziv olmayan tekniklerle değiştirilebilecek olan çalışmanın invaziv prosedürüdür.

Materials

<strong>Histology</strong>
<strong>Reagents</strong>
Isoflurane	Abbott		Anesthesia agent
Ketamine hydrochloride	Troikaa Pharmaceuticals		Anesthesia agent
Xylazine	Indian Immunologicals Limited		Anesthesia agent
Pentobarbital sodium	Zora Pharma		Euthanesia agent
Fixative solution (1 % formaldehyde, 1.25 % Glutaraldehyde	HiMedia, Avra	MB059, ASG2529	Prepared in-house
Ethanol	Hayman	F204325	Dehydration
Xylene	HiMedia	MB-180	Clearing of ethanol or paraffin
Paraffin wax	HiMedia	GRM10702	used for embedding tissue
Glycerol	HiMedia	TC503	To prepare albumin coated slides. Glycerol and egg albumin is mixed in 1:1 ratio to coat on slides
Hydrochloric acid	Sisco Research laboratories Pvt. Ltd.	65955	For preparation of 1 % acid alcohol
Acetic acid	HiMedia	AS119	For preparation of eosin
Scotts water	Leica	3802900	Bluing reagent
Papanicolaou's solution 1b Hematoxylin solution	Sigma	1.09254.0500	Staining of nuclei
Eosin	HiMedia	GRM115	Staining of cytoplasm, 0.25 % solution was prepared in-house
DPX Mountant media	Sigma	6522	Visualization and protection of retinal sections
<strong>Equipments</strong>
Glassware	Borosil
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Cassettes	HiMedia	PW1292	To hold tissue during histology processing
Water bath	GT Sonic	GT Sonic-D9	Temperature maintenance
Paraffin embedding station	Myr	EC 350	Preparation of paraffin blocks
Microtome	Zhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.	YD-335A	Sectioning
Blades	Leica	Leica 818	Sectioning
Slides	HiMedia	BG005	Holding paraffin-tissue sections
Coverslips	HiMedia	BG014C	To cover tissue after adding mounting media
<strong>Blood Retinal Barrier breakdown</strong>
<strong>Reagents</strong>
Isoflurane	Abbott	B506	Anesthesia
Dry ice	Not applicable	Not applicable	Dissection
Bradford reagent	Sigma	B6916	Protein quantification
<strong>Equipments</strong>
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Glassware	Borosil	Not applicable
EDTA coated tubes	J.K Diagnostics	Not applicable	Separate plasma from whole blood
Homogenization tubes	MP Biomedicals	SKU: 115076200-CF	Homogenization of vitreous
Homogenization caps	MP Biomedicals	SKU: 115063002-CF	Homogenization of vitreous
Glass beads	MP Biomedicals	SKU: 116914801	Homogenization of vitreous
Homogeniser	Bertin Instruments	P000673-MLYS0-A	Homogenization of vitreous
96-well plate – Transparent	Grenier	GN655101	Protein quantification
Plate reader	Molecular devices	SpectrMax M4	Absorbance measurement
Centrifuge	REMI	CPR240 Plus	Centrifugation
<strong>Fluorescence Angiography</strong>
<strong>Reagents</strong>
Isoflurane	Abbott	B506	Anesthesia
FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSO	FITC, Dextran and Dibutylin dilaurate from Sigma; DMSO from HiMedia	FITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185	Prepared in-house
Fluoroshied	Sigma	F6182	Anti-fading mounting medium
<strong>Equipments</strong>
Corneal forcep	Stephens Instruments	S5-1200	Dissection
Colibri forcep	Stephens Instruments	S5-1135	Dissection
Curved micro scissor	Stephens Instruments	S7-1311	Dissection
Vannas scissor	Stephens Instruments	S7-1387	Dissection
Iris scissor	Stephens Instruments	S7-1015	Dissection
Glassware	Borosil	Not applicable
Slides	HiMedia	BG005	Flatmount preparation
Coverslips	HiMedia	BG014C	To cover tissue after adding mounting media
Confocal microscope	Leica	DMi8	Visualization of flatmount