Method Article

Sıçan Modelinde Retinal Patofizyolojik Değerlendirme

DOI:

10.3791/63111

⸱

May 6th, 2022

 , 
1Translational Pharmaceutics Research Laboratory (TPRL), Department of Pharmacy, Birla Institute of Technology & Science — Pilani, Hyderabad Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyabetik retinopati körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Histoloji, kan-retinal bariyer parçalanma testi ve floresan anjiyografi, retinanın patofizyolojisini anlamak için değerli tekniklerdir ve bu da diyabetik retinopatiye karşı etkili ilaç taramasını daha da artırabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyabetik retinopati gibi bir arka segment göz hastalığı retinanın fizyolojisini değiştirir. Diyabetik retinopati retina dekolmanı, kan-retina bariyerinin (BRB) parçalanması ve retinal anjiyogenez ile karakterizedir. Bir in vivo sıçan modeli, retinanın yapısındaki ve işlevindeki değişiklikleri incelemek için değerli bir deneysel araçtır. Sıçan modelinde retina hücrelerinin, retina vaskülatürünün ve hasar görmüş BRB'nin morfolojik değişikliklerini tanımlamak için üç farklı deneysel teknik öneriyoruz. Retinal histoloji, çeşitli retina hücrelerinin morfolojisini incelemek için kullanılır. Ayrıca retina hücre sayımı ve farklı retina tabakalarının kalınlık ölçümü ile kantitatif ölçüm yapılır. BRB'nin parçalanması nedeniyle ekstraoküler proteinlerin plazmadan vitreus dokusuna sızmasını belirlemek için BRB parçalanma testi kullanılır. Floresan anjiyografi, FITC-dextran boyası kullanarak retinal vaskülatürü görselleştirerek anjiyogenezi ve kan damarlarının sızıntısını incelemek için kullanılır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyabetik retinopati (DR), diabetes mellitusun en karmaşık sekonder komplikasyonlarından biridir. Aynı zamanda dünya çapında çalışma çağındaki nüfusta önlenebilir körlüğün önde gelen nedenidir. 32.4 milyon kör insanın yakın tarihli bir meta-analizinde, 830.000 (% 2.6) kişi DR1 nedeniyle kördü. Diyabete atfedilen görme kaybı oranı, 2015 yılında dünya çapında %1,06 (0,15-2,38) ile yedinci sırada yer almıştır2,3.

Diyabetik retinopati tanısı arka oküler dokulardaki vasküler anormallikler ile konur. Klinik olarak, retinadaki vaskülarizasyona bağlı olarak Prolifera....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Kurumsal Hayvan Etiği Komitesi, BITS-Pilani, Haydarabad kampüsü tarafından sağlanan tüm hayvan bakım kılavuzlarını takip etmektedir.

1. Retina histolojisi

  1. Gözün enükleasyonu ve fiksasyonu
    1. 2 ila 3 aylık diyabetik Wistar erkek sıçanını, intraperitoneal yoldan enjekte edilen yüksek dozda pentobarbital (150 mg / kg) kullanarak yaşa uygun kontrol (14 ila 15 haftalık) ile birlikte ötenazileştirin. Tespit edilebilir hiçbir kalp atışı 2-5 dakika içinde ölümü doğrulamaz.
    2. Gözün burun ve temporal bölgelerinde neşter bıçağı kullanarak kesi yaparak gözü enüklee edin. Daha sonra gözü orbital soke....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retina histolojisi
Diyabetik retinada, retina hücreleri dejenerasyona uğrar. Ayrıca ödem nedeniyle retina tabakalarının kalınlığı da artar22. Hematoksilin ve Eozin boyama işleminden sonra elde edilen görüntüler, ImageJ kullanılarak Şekil 2'de gösterildiği gibi, hücre sayımı ve farklı katmanların kalınlığının ölçülmesi için kullanılabilir.

Kan-retina bariyeri parçalanma testi
BRB diyabetik sıçanlarda t.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histoloji
Retina histolojisi, retina hücrelerinin ve tabakalarının morfolojik değişikliklerini görselleştirmek için yapılır. Fiksatif çözelti seçimi, fiksasyon süresi, dehidrasyon ve parafin emprenye etme dahil olmak üzere çeşitli adımların optimize edilmesi gerekir. Fiksatif penetrasyon yavaşladığı için doku boyutu 3 mm'yi geçmemelidir. Yaygın olarak kullanılan %4'lük paraformaldehit, çözeltinin sulu mizah ve vitreus mizahına kıyasla nispeten yüksek ozmolaritesi nedeniyle sağlıklı gözde bile retina d.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Hindistan Tıbbi Araştırma Konseyi'ne (ICMR; ITR-2020-2882) Dr. Nirmal J.'ye finansman desteği için Ayrıca, Manisha Malani'ye ve Merkezi Analitik Laboratuvar Tesisi, BITS-Pilani, Haydarabad kampüsüne altyapı tesisi sağladığı için Junior Research Fellowship sağladığı için Üniversite Komisyon Hibesine teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
histoloji< / güçlü >
< güçlü > Reaktifler< / güçlü >
İzofluranAbbottAnestezi ajanı
hidroklorürTroikaa İlaçAnestezi ajanı
KsilazinHint İmmünolojisi SınırlıAnestezi ajanı
Pentobarbital sodyumZora PharmaEuthanesia
Fiksatif çözelti (% 1 formaldehit,% 1.25 GlutaraldehitHiMedia, AvraMB059, ASG2529Hazırlanan kurum içi
EtanolHaymanF204325Dehidrasyon
KsilenHiMediaMB-180Etanol veya parafin Parafin
mumuHiMediaGRM10702doku gömmek için kullanılır
GlycerolHiMediaTC503Albümin kaplı slaytlar hazırlamak için. Gliserol ve yumurta albümini, slaytları kaplamak için 1: 1 oranında karıştırılır
Hidroklorik asitSisco Araştırma laboratuvarları Pvt. Ltd.65955% 1 asit alkol hazırlanması için
Asetik asitHiMediaAS119Eozin
Scotts suyununLeica3802900Bluing reaktifi
Papanicolaou'nun çözeltisi 1b Hematoksilen çözeltisiSigma1.09254.0500Çekirdeklerin boyanması
EozinHiMediaGRM115Sitoplazmanın boyanması,% 0.25 çözelti hazırlandı kurum içi
DPX Mountant ortamıSigma6522Retina bölümlerinin görselleştirilmesi ve korunması
Ekipmanlar
ZüccaciyeBorosil
Kornea forsepStephens AletleriS5-1200Diseksiyon
Colibri forsepStephens AletleriS5-1135Diseksiyon
Kavisli mikro makasStephens AletleriS7-1311Diseksiyon
Vannas makasStephens AletleriS7-1387Diseksiyon
İris makasStephens AletleriS7-1015Diseksiyon
KasetleriHiMediaPW1292Histoloji işleme sırasında dokuyu tutmak için
Su banyosuGT SonicGT Sonic-D9Sıcaklık bakımı
Parafin gömme istasyonuMyrEC 350Parafin bloklarının hazırlanması
MikrotomZhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.YD-335AKesit
BıçaklarıLeicaLeica 818Kesit
SlaytlarıHiMediaBG005Parafin doku bölümlerini tutma
LamellerHiMediaBG014CMontaj ortamı ekledikten sonra dokuyu kaplamak için
Kan Retina Bariyeri bozulması
Reaktifler
İzofluranAbbottB506Anestezi
Kuru buzUygulanamaz UygulanamazDiseksiyon
Bradford reaktifiSigmaB6916Protein miktar tayini
Ekipmanlar< / güçlü >
Kornea forsepStephens InstrumentsS5-1200Diseksiyon
Colibri forsepStephens AletleriS5-1135Diseksiyon
Kavisli mikro makasStephens AletleriS7-1311Diseksiyon
Vannas makasStephens AletleriS7-1387Diseksiyon
İris makasStephens AletleriS7-1015Diseksiyon
ZüccaciyeBorosilUygulanamaz
EDTA kaplı tüplerJ.K DiagnosticsUygulanamazTam kandan ayrı plazma
Homojenizasyon tüpleriMP BiomedicalsSKU: 115076200-CFCamsı homojenizasyonu
Homojenizasyon kapaklarıMP BiomedicalsSKU: 115063002-CFCamsı cam boncukların homojenizasyonu
MP BiomedicalsSKU: 116914801Vitreusun homojenizasyonu
HomojenizatörBertin InstrumentsP000673-MLYS0-ACamsı 96 oyuklu plakanın homojenizasyonu
- ŞeffafGrenierGN655101Protein miktar tayini
Plaka okuyucuMoleküler cihazlarSpectrMax M4Absorbans ölçümü
SantrifüjREMICPR240 PlusSantrifüj
Floresan Anjiyografi
Reagents
IsofluranAbbottB506Anestezi
FITC-dekstran 70 kD (Sigma'dan FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSOFITC, Dextran ve Dibutylin dilaurat; HiMediaFITC-F3651, Dextran-31390, Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185'ten DMSOŞirket içi
FluoroshiedSigmaF6182Solma önleyici montaj ortamı
< güçlü > Ekipmanlar< / güçlü >
kornea forsepStephens AletleriS5-1200Diseksiyon
Colibri forsepStephens AletleriS5-1135Diseksiyon
Kavisli mikro makasStephens AletleriS7-1311Diseksiyon
Vannas makasStephens AletleriS7-1387Diseksiyon
İris makasStephens AletleriS7-1015Diseksiyon
ZüccaciyeBorosilUygulanamaz
SlaytlarHiMediaBG005Flatmount hazırlığı
LamellerHiMediaBG014CMontaj ortamı ekledikten sonra dokuyu kaplamak için
Konfokal mikroskopLeicaDMi8Flatmount'un görselleştirilmesi
Ketamin ajanı hazırlanması için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
  2. Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
  3. Mokdad, A. H., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Diabetic RetinopathyRetinal PathophysiologyRat ModelBlood Retinal BarrierRetinal HistologyFluorescence AngiographyRetinal Cell CountRetinal Flat MountProtein Leakage AssayRetinal Angiogenesis

Related Articles