Yöntem makalesi

Sıçan Modelinde Retinal Patofizyolojik Değerlendirme

DOI:

10.3791/63111

⸱

6 Mayıs 2022

 , 
1Translational Pharmaceutics Research Laboratory (TPRL), Department of Pharmacy, Birla Institute of Technology & Science — Pilani, Hyderabad Campus

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyabetik retinopati körlüğün önde gelen nedenlerinden biridir. Histoloji, kan-retinal bariyer parçalanma testi ve floresan anjiyografi, retinanın patofizyolojisini anlamak için değerli tekniklerdir ve bu da diyabetik retinopatiye karşı etkili ilaç taramasını daha da artırabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyabetik retinopati gibi bir arka segment göz hastalığı retinanın fizyolojisini değiştirir. Diyabetik retinopati retina dekolmanı, kan-retina bariyerinin (BRB) parçalanması ve retinal anjiyogenez ile karakterizedir. Bir in vivo sıçan modeli, retinanın yapısındaki ve işlevindeki değişiklikleri incelemek için değerli bir deneysel araçtır. Sıçan modelinde retina hücrelerinin, retina vaskülatürünün ve hasar görmüş BRB'nin morfolojik değişikliklerini tanımlamak için üç farklı deneysel teknik öneriyoruz. Retinal histoloji, çeşitli retina hücrelerinin morfolojisini incelemek için kullanılır. Ayrıca retina hücre sayımı ve farklı retina tabakalarının kalınlık ölçümü ile kantitatif ölçüm yapılır. BRB'nin parçalanması nedeniyle ekstraoküler proteinlerin plazmadan vitreus dokusuna sızmasını belirlemek için BRB parçalanma testi kullanılır. Floresan anjiyografi, FITC-dextran boyası kullanarak retinal vaskülatürü görselleştirerek anjiyogenezi ve kan damarlarının sızıntısını incelemek için kullanılır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyabetik retinopati (DR), diabetes mellitusun en karmaşık sekonder komplikasyonlarından biridir. Aynı zamanda dünya çapında çalışma çağındaki nüfusta önlenebilir körlüğün önde gelen nedenidir. 32.4 milyon kör insanın yakın tarihli bir meta-analizinde, 830.000 (% 2.6) kişi DR1 nedeniyle kördü. Diyabete atfedilen görme kaybı oranı, 2015 yılında dünya çapında %1,06 (0,15-2,38) ile yedinci sırada yer almıştır2,3.

Diyabetik retinopati tanısı arka oküler dokulardaki vasküler anormallikler ile konur. Klinik olarak, retinadaki vaskülarizasyona bağlı olarak Proliferatif Olmayan DR (NPDR) ve Proliferatif DR (PDR) olmak üzere iki aşamaya ayrılır. Hiperglisemi, retinada nörodejenerasyon4,5, inflamasyon6,7 ve mikrovaskülatür8 ile ilgili çeşitli yolları içerdiği için DR'nin güçlü düzenleyicisi olarak kabul edilir. Hiperglisemiye bağlı olarak indüklenen çoklu metabolik komplikasyonlar arasında ileri glikasyon son ürünlerinin (AGE'ler), polyol yolunun, hekzozamin yolunun ve protein kinaz-C yolunun birikmesi sayılabilir. Bu yollar, diyabetik retinopatinin farklı evrelerine bağlı olarak hücre proliferasyonu (endotel hücreleri), migrasyon (perisitler) ve apoptozdan (nöral retina hücreleri, perisitler ve endotel hücreleri) sorumludur. Bu metabolik değişiklikler retina dekolmanı, retina hücrelerinin kaybı, kan-retina bariyerinin (BRB) parçalanması, anevrizmalar ve anjiyogenez gibi fizyolojik değişikliklere yol açabilir9.

Streptozotosin (STZ) ile indüklenen tip-1 diyabet, diyabet patogenezini ve komplikasyonlarını değerlendirmek için sıçanlarda iyi bilinen ve iyi kabul görmüş bir uygulamadır. STZ'nin diyabetojenik etkileri, pankreas adacığının seçici yıkımına bağlıdır β hücreler10. Sonuç olarak, hayvanlar insülin eksikliği, hiperglisemi, polidipsi ve poliüriye maruz kalacaktır ve bunların hepsi insan tipi-1 diabetes mellitusun karakteristiğidir11. Şiddetli diyabet indüksiyonu için STZ, yetişkinlik döneminde intravenöz veya intraperitoneal olarak 40-65 mg / kg vücut ağırlığında uygulanır. Yaklaşık 72 saat sonra, bu hayvanlar 250 mg / dL10,12'den daha yüksek kan şekeri seviyeleri sunar.

Retinanın nörodejenerasyon, inflamasyon ve anjiyogeneze bağlı fizyolojik değişikliklerini anlamak için, deneysel hayvan modellerinde farklı teknikler optimize edilmelidir. Retina hücreleri ve retina damarlarındaki yapısal ve fonksiyonel değişiklikler histoloji, BRB yıkım testi, floresan anjiyografi gibi çeşitli tekniklerle incelenebilir.

Histoloji, hücrelerin, dokuların ve organların anatomisinin mikroskobik düzeyde incelenmesini içerir. Hücrelerin/dokunun yapısı ve işlevi arasında bir korelasyon kurar. Doku yapısındaki mikroskobik değişiklikleri görselleştirmek ve tanımlamak, böylece sağlıklı ve hastalıklı meslektaşları karşılaştırmak için birkaç adım gerçekleştirilir13. Bu nedenle, histolojinin her adımını titizlikle standartlaştırmak esastır. Retinal histolojide yer alan çeşitli adımlar numunenin fiksasyonu, numunenin kesilmesi, dehidrasyon, temizleme, parafin ile emprenye etme, parafin gömme, kesitleme ve boyama (Hematoksilin ve Eozin boyama)13,14.

Sağlıklı bir retinada, moleküllerin retina boyunca taşınması, iç tarafta endotel hücreleri ve perisitlerden ve dış tarafta retinal pigment epitel hücrelerinden oluşan BRB tarafından kontrol edilir. Bununla birlikte, iç BRB endotel hücreleri ve perisitler hastalıklı durum sırasında dejenere olmaya başlar ve BRB de tehlikeye girer15. Bu BRB parçalanması nedeniyle, birçok düşük molekül ağırlıklı molekül vitreus ve retina dokusuna sızmaktadır16. Hastalık ilerledikçe, diğer birçok protein molekülü (düşük ve yüksek moleküler ağırlık) da homeostaz bozukluğu nedeniyle vitreus ve retina dokusuna sızmaktadır17. Çeşitli diğer komplikasyonlara ve sonuçta makula ödemi ve körlüğe yol açar. Bu nedenle, vitreustaki protein seviyelerinin ölçülmesi ve sağlıklı ve diyabetik durumların karşılaştırılması, BRB'nin tehlikeye atıldığını ölçer.

Floresan anjiyografi, floresan boya kullanarak retina ve koroidin kan dolaşımını incelemek için kullanılan bir tekniktir. İntravenöz yolla veya kardiyak enjeksiyon yoluyla floresein boyası enjekte edilerek retina ve koroid vaskülatürünü görselleştirmek için kullanılır18. Boya enjekte edildikten sonra, önce retinal arterlere, ardından retinal damarlara ulaşır. Bu boya sirkülasyonu genellikle boya enjeksiyonundan itibaren 5 ila 10 dakika içinde tamamlanır19. Diyabetik retinopati ve koroidal neovaskülarizasyon dahil olmak üzere çeşitli posterior segment oküler hastalıkların tanısında önemli bir tekniktir20. Normal ve hastalıklı durumlarda majör ve minör vaskülatür değişikliklerini tespit etmeye yardımcı olur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Kurumsal Hayvan Etiği Komitesi, BITS-Pilani, Haydarabad kampüsü tarafından sağlanan tüm hayvan bakım kılavuzlarını takip etmektedir.

1. Retina histolojisi

  1. Gözün enükleasyonu ve fiksasyonu
    1. 2 ila 3 aylık diyabetik Wistar erkek sıçanını, intraperitoneal yoldan enjekte edilen yüksek dozda pentobarbital (150 mg / kg) kullanarak yaşa uygun kontrol (14 ila 15 haftalık) ile birlikte ötenazileştirin. Tespit edilebilir hiçbir kalp atışı 2-5 dakika içinde ölümü doğrulamaz.
    2. Gözün burun ve temporal bölgelerinde neşter bıçağı kullanarak kesi yaparak gözü enüklee edin. Daha sonra gözü orbital soketten çıkarmak için forseps ve mikro makas kullanarak kenarları boyunca kesin.
      NOT: Sıçanları feda etmeden önce, fiksatif çözeltileri hazır bulundurun.
      DİKKAT: Formaldehit cildi, gözü, burnu ve solunum yollarını tahriş eder. Güçlü bir cilt hassaslaştırıcı olduğu için kansere de neden olabilir. Eldiven giyin ve kaputun altında tutun21.
    3. Kanı çıkarmak için gözü bir Petri kabında 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi ile iyice yıkayın. Fiksatif çözeltinin kolay nüfuz etmesi için gözü çevreleyen fazla yağı çıkarın.
    4. Gözü hemen forseps yardımıyla 5 mL fiksatif çözeltiye yerleştirin ve cam şişelerin duvarlarına yapışmadığından emin olun. Birkaç saniye hafifçe karıştırın ve kapağı uygun etiketleme ile değiştirin. Oda sıcaklığında karanlık koşullarda 24 ila 48 saat boyunca fiksatif çözeltide gözü inkübe edin.
  2. Doku kırpma
    1. Fiksasyondan sonra, gözü fiksatif çözeltiden çıkarın, 10 mL PBS ile yıkayın ve 4 ° C'de soğutulmuş 10 mL PBS içeren bir Petri kabına yerleştirin.
    2. Mikro forseps kullanarak, gözü optik sinir ile tutun ve mikro makas yardımıyla pars plana'da bir nick yapın. Bir gözün ön fincanını ayırmak için korneanın tüm kenar boşluğunu kesin. Forseps kullanarak, lensi nazikçe seçin, atın ve optik siniri kesin.
    3. Kavisli mikro makas kullanarak, optik diskten geçerek arka vizör adaptörünün uzunlamasına bir bölümünü iki yarıya bölün. Kasetin tabanına yerleştirin ve dokuya herhangi bir rahatsızlık vermeden kapağı düzgün bir şekilde kapatın. Kasetleri doku numunesi adı ve tarihi ile etiketleyin.
  3. Dokunun dehidrasyonu, temizlenmesi ve parafin emprenye edilmesi
    1. Kesilen dokuyu% 50,% 70,% 90 ve% 100 etanolün 80 mL'sinde kademeli olarak transfer ederek kurutun. Kasetleri bir konsantrasyondan diğerine aktarırken, kontaminasyonu en aza indirmek için temiz kağıt mendil üzerine bastığınızdan emin olun.
      NOT: Dokunun her transferde 30 dakika (iki kez) bekletin. Bu adım için harcanan toplam süre yaklaşık 4 saattir.
    2. Dehidrasyon üzerine, etanolün ksilen ile değiştirilmesi için kasetleri 30 dakika (iki kez) boyunca 80 mL ksilene aktarın.
      NOT: Ksilen ile inkübasyondan sonra, doku yarı saydam hale gelir.
      DİKKAT: Ksilen, benzen halkalı aromatik bir bileşiktir. Göz ve mukoza zarını tahriş eder ve ayrıca depresyonlara neden olabilir.
    3. Son olarak, dokudaki ksilenin yerini almak için dokuyu 60 ° C'de önceden ısıtılmış parafin ile emprenye edin. Ksilen içeriğini en aza indirmek için kasetleri kağıt mendil üzerine birkaç kez darpın ve 2 saat (1 h x 2) boyunca 200 mL parafin (60 ° C'de sıvı) içine yerleştirin.
      DİKKAT: Erimiş parafini solumaktan kaçının, çünkü solunum rahatsızlığına neden olabilecek küçük lipit damlacıkları üretir.
  4. Parafin gömme
    1. Parafin gömme makinesini, parafini eritmek ve istasyonların istenen sıcaklıklara ulaşması için kullanmadan en az 1 saat önce açın. Çelik bir kalıbı sıcak bir yüzeye yerleştirerek erimiş parafin mumu ile doldurun, ardından parafin kabından bir seferde bir kaseti çıkarın.
    2. Çelik kalıbı sıcak bir yüzeyden soğuk bir yüzeye (4 ° C) taşıyın. Bu noktada, kalıptaki balmumu katılaşmaya başlayacaktır. Tamamen katılaşmadan önce, forseps yardımıyla dokuyu balmumuna yerleştirin ve dokuyu, arka kabın optik disk kısmı kalıbın tabanına bakacak şekilde yönlendirin.
      NOT: Dokunun hareket etmediğinden ve istenen oryantasyonunu koruduğundan emin olun. Değilse, tüm parafin sıvılaşana kadar kalıbı tekrar ılık çalışma yüzeyine koyun, ardından adım 1.4.2 ile tekrar başlayın.
    3. Kalıptaki balmumu katılaşmaya başladığında, kaset tabanını hemen kalıbın üzerine yerleştirin. Kalıbı kasetin üst kenarının üstündeki parafin ile dikkatlice doldurun ve hızlı katılaşma için yavaşça soğuk bir yüzeye (-20 ° C'ye yakın) aktarın. Katılaşana kadar, işlemi adım 1.4.2'deki diğer kasetlerle tekrarlayın.
    4. Tüm kalıplar katılaştıktan sonra, çelik kalıbı kasetten ayırın. Zorsa, biraz daha bekleyin ve tekrar deneyin (zorla çıkarmayın). Tam katılaşma ile separasyon daha kolay hale gelir. Şimdi kaset, mikrotom tarafından bölümleme sırasında tutulacak parafin bloğunun tabanı haline gelir.
      NOT: Bu blok daha fazla kullanım için oda sıcaklığında saklanabilir. Bu noktada, işlem durdurulabilir ve daha sonra (gerekirse) devam ettirilebilir.
  5. Bölümleme
    1. Bıçak tutucuya tek kullanımlık bir mikrotom bıçağı takın. Kasetlerin etrafındaki fazla parafin mumunu çıkarın, böylece blokların hem üst hem de alt kısımları bıçağa paralel kalır. Bloğu kaset tutucuya takın.
    2. Bloğun yüzeyi bıçağın kenarıyla temas edene kadar ilerletmek için el çarkının kilidini açın. Doku bloğun yüzeyinde görselleştirilinceye kadar blok üzerindeki fazla parafin mumunu kesin. Bölüm kalınlığını 5 μm'ye ayarlayın ve beş ila altı bölümden oluşan bir şerit kesin.
    3. Forseps kullanarak, şeridi açmak için şeridi önceden ısıtılmış su banyosunun yüzeyine (yaklaşık 50 ° C) yavaşça aktarın. Mayer'in albüminiyle kaplı cam bir slayttaki bölümleri, slaytı bölümün altında tutarak toplayın. Bölümleri yavaşça kaldırın ve kızakların 37 ° C'de gece boyunca yatay olarak kurumasını bekleyin.
      NOT: Slaytlar oda sıcaklığında kuru kutularda birkaç ay saklanabilir. Bu adımda, işlem durdurulabilir ve daha sonra devam ettirilebilir.
  6. Boy -ama
    1. Parafinin erimesi için kullanmadan önce 60 °C'de sıcak hava fırınında lekelenecek kızakları 1 saat ısıtın ve Tablo 1'de belirtilen adımları izleyin.
      DİKKAT: Hematoksilin ve Eozin lekeleri solunduğunda veya yutulduğunda toksiktir. Kanserojen oldukları bildirilmiştir.
ReaktifAyakta Durma SüresiTekrarlama (Kaç kez)
Ksilen5 dk2
%100 Etanol5 dk2
%90 Etanol5 dk2
%70 Etanol5 dk2
%50 Etanol5 dk2
Su5 dk2
Hematoksilen4 dk1
Su ile yıkama
%1 %70 Etanol içinde asit alkol30 Saniye1
Su ile yıkama
Scott'ın suyu1 dk1
Su ile yıkama
%50 Etanol1 dk1
%95 Etanol1 dk1
% 0.25 Eozin5 sn.1
Su ile yıkama
Su2 dk1
%95 Etanol1 dk1
%100 Etanol1 dk1
Ksilen5 dk2
Montaj ve kapak kaydırma

Tablo 1. Hematoksilin ve Eozin boyama prosedürü

2. Kan-beyin bariyeri parçalanma testi

  1. Kan ve vitreus toplanması
    1. 2 ila 3 aylık diyabetik Wistar erkek sıçanını, ketamin (80 mg / kg) ve ksilazin (8 mg / kg) kullanarak yaşa uygun kontrol (14 ila 15 hafta) ile birlikte anestezi uygulayın. Anestezik durumu pedal çekme refleksi (ayak parmağı sıkışması) ile onaylayın. Plazmayı tam kandan ayırmak için hemen etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kaplı bir tüpe kardiyak ponksiyon yoluyla 1 mL kan toplayın.
    2. İntraperitoneal yoldan enjekte edilen yüksek dozda pentobarbital (150 mg / kg) kullanarak sıçanı ötenazileştirin. Tespit edilebilir hiçbir kalp atışı 2-5 dakika içinde ölümü doğrulamaz. Gözü enüklee edin ve hemen kuru buz üzerine yerleştirin.
    3. Gözü kuru buzun üzerinde temiz bir Petri kabına yerleştirin (önerilir) ve adım 1.2.2'de belirtildiği gibi gözü diseke etmeye başlayın.
    4. Lensi çıkarın, vitriosu mikro forseps kullanarak arka bardaktan dikkatlice çekin ve üç ila dört cam boncuk (2-4 mm) içeren bir homojenizasyon tüpüne yerleştirin.
      NOT: Dondurucu koşullar altında lensin ve vitreusun çıkarılması daha kolay olduğu için kuru buz üzerinde diseksiyon yapılması önerilir.
  2. Numunelerin hazırlanması
    1. Vitröz mizahı bir boncuk homojenizatöründe 10 sn boyunca orta hızda homojenize edin.
    2. Kan (1 mL) ve vitreus numunelerini (10-20 μL) mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve her iki numuneyi de 4 ° C'de 10 dakika boyunca 5200 x g'de santrifüj edin.
      NOT: Başarılı homojenizasyon durumunda, vitreus santrifüjlemeden sonra homojen bir kıvama sahiptir. Bununla birlikte, vitreusun homojen olmayan kıvamında olması durumunda, artan homojenizasyon süresi ile adım 2.2.1'den itibaren tekrarlayın.
    3. Her iki numuneden de süpernatant toplayın ve PBS ile vitreus mizah ve plazma örneklerini sırasıyla 1:10 ve 1:20 oranında seyreltin.
  3. Protein miktarı ve vitreus-plazma protein oranı
    1. Vitröz mizah ve plazma numunelerinde protein konsantrasyonunu ölçmek için, 250 μL Bradford reaktifine 5 μL seyreltilmiş numune ekleyin, iyice karıştırın ve 40 dakika içinde 590 nm'de absorbansı okuyun.
      NOT: Numunelerin absorpsiyon değeri 1.0'ın üzerindeyse, numuneleri daha fazla seyreltin ve adım 2.2.3'teki prosedürü tekrarlayın.
    2. Vitröz protein seviyesini aynı sıçandan plazma protein seviyesine normalleştirin ve sağlıklı ve diyabetik sıçanlar arasındaki kıvrım farkını ölçün.

3. Floresan anjiyografi

  1. FITC-dextran70000 boya enjeksiyonu
    1. 2 ila 3 aylık diyabetik Wistar erkek sıçanını% 3 izofluran kullanarak yaşa uygun kontrol (14 ila 15 hafta) ile birlikte anestezi uygulayın ve pedal çekilme refleksini (ayak parmağı sıkışması) onaylayın. Kuyruğu ılık su (37-40 ° C) içeren bir beherin içine batırın. Boyayı enjekte etmeden önce kuyruğu% 70 etanol ile temizleyin. Kuyruğun yanal damarını bulun ve kuyruğun alt kısmındaki enjeksiyon pozisyonunu işaretleyin.
      NOT: İğnenin yerleştirilmesi başarısız olursa, geçerli konumun üzerinde başka bir yere yerleştirmeyi deneyin (ucu kuyruğun tabanına kadar). Bununla birlikte, tekrarlanan iğneleme, sıçanda stres gelişimine yol açabileceğinden, vazokonstriksiyona neden olabileceğinden, bir kez enjekte edilmesi tavsiye edilir.
    2. Kuyruk damarından 1 mL 50 mg/mL FITC-dextran70000 boya çözeltisi enjekte edin ve boyanın 5 dakika boyunca dolaşmasına izin verin. Sıçanı, intraperitoneal yoldan enjekte edilen yüksek dozda pentobarbital (150mg / kg) ile ötenazileştirin. Tespit edilebilir hiçbir kalp atışı 2-5 dakika içinde ölümü doğrulamaz. Adım 1.1.1'de belirtildiği gibi gözü enüklee edin.
      NOT: Gerekirse, göz en fazla 30 dakika boyunca %4 formaldehit çözeltisine sabitlenebilir.
  2. Düz montaj hazırlığı
    1. Düz montajlar hazırlamak için, diseksiyon aletlerini slaytlar ve kapak kaymaları ile birlikte hazır bulundurun. Gözü soğutulmuş PBS ile dolu bir Petri kabına yerleştirin ve adım 1.2.2'de belirtildiği gibi gözü diseke etmeye başlayın.
    2. Şimdi sivri uçlu bir forsepilin ucunu sklera ve retina arasına yerleştirin. Retinanın herhangi bir noktada skleraya bağlı olmadığından emin olarak bardağın kenarı boyunca yavaşça hareket ettirin. Herhangi bir tıkanıklık varsa, kavisli mikro makas kullanarak jant boyunca bu kısmı yavaşça kesin.
    3. Retinanın skleraya herhangi bir taraftan bağlanmadığı doğrulandıktan sonra, optik diskin yakınında kesin, retinanın skleradan tamamen ayrılacağı şekilde küçük bir delik açın. Retinayı yavaşça PBS çözeltisine itin ve spatula veya forseps yardımıyla temiz ve düz bir slayta yerleştirin.
    4. Mikro makas veya neşter bıçakları kullanarak, retina dokusunda küçük kesikler yapın ve dört kadrana bölün. Kesiklerin, Şekil 1'de gösterildiği gibi, optik diskin merkezde bıraktığı delikten en az 2 mm uzakta olduğundan emin olun.
    5. Düz montajı bozmadan 0,2 mL uçlar kullanarak fazla PBS'yi dokunun kenarlarından çıkarın.
    6. Düz bir montaj üzerine bir damla solmaya karşı montaj ortamı (50 μL ila 100 μL) yerleştirin, bir kapak kayması ile örtün ve hemen bir konfokal mikroskop altında görselleştirin.
      NOT: Tüm prosedür boyunca minimum ışığı koruyun.
  3. Düz montajın görselleştirilmesi
    1. Düz montajı, bir konfokal mikroskobun 10x hedefi altında görselleştirin. Tüm düz montajı tek bir görüntü olarak yakalamak için karo taraması gerçekleştirin. Fayans sayısı, retinal düz montajın boyutuna bağlıdır. Ayrıca, damarları ve arterleri farklı odaklarda görselleştirmek için Z-istifleme yapın (Z-yığını için tercih edilen boyut, hangisine bağlı olarak, Z-yığını adımlarının sayısının değiştiğine bağlı olarak 5 μm'dir).
    2. PMT ve HyD dedektörünü sırasıyla 700-900 ve 100-150 olarak % kazançta kullanın. FITC-dextran boyası için 510-530 nm arasındaki emisyon aralığını seçin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retina histolojisi
Diyabetik retinada, retina hücreleri dejenerasyona uğrar. Ayrıca ödem nedeniyle retina tabakalarının kalınlığı da artar22. Hematoksilin ve Eozin boyama işleminden sonra elde edilen görüntüler, ImageJ kullanılarak Şekil 2'de gösterildiği gibi, hücre sayımı ve farklı katmanların kalınlığının ölçülmesi için kullanılabilir.

Kan-retina bariyeri parçalanma testi
BRB diyabetik sıçanlarda t...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histoloji
Retina histolojisi, retina hücrelerinin ve tabakalarının morfolojik değişikliklerini görselleştirmek için yapılır. Fiksatif çözelti seçimi, fiksasyon süresi, dehidrasyon ve parafin emprenye etme dahil olmak üzere çeşitli adımların optimize edilmesi gerekir. Fiksatif penetrasyon yavaşladığı için doku boyutu 3 mm'yi geçmemelidir. Yaygın olarak kullanılan %4'lük paraformaldehit, çözeltinin sulu mizah ve vitreus mizahına kıyasla nispeten yüksek ozmolaritesi nedeniyle sağlıklı gözde bile retina d...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Hindistan Tıbbi Araştırma Konseyi'ne (ICMR; ITR-2020-2882) Dr. Nirmal J.'ye finansman desteği için Ayrıca, Manisha Malani'ye ve Merkezi Analitik Laboratuvar Tesisi, BITS-Pilani, Haydarabad kampüsüne altyapı tesisi sağladığı için Junior Research Fellowship sağladığı için Üniversite Komisyon Hibesine teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
histoloji< / güçlü >
< güçlü > Reaktifler< / güçlü >
İzofluranAbbottAnestezi ajanı
hidroklorürTroikaa İlaçAnestezi ajanı
KsilazinHint İmmünolojisi SınırlıAnestezi ajanı
Pentobarbital sodyumZora PharmaEuthanesia
Fiksatif çözelti (% 1 formaldehit,% 1.25 GlutaraldehitHiMedia, AvraMB059, ASG2529Hazırlanan kurum içi
EtanolHaymanF204325Dehidrasyon
KsilenHiMediaMB-180Etanol veya parafin Parafin
mumuHiMediaGRM10702doku gömmek için kullanılır
GlycerolHiMediaTC503Albümin kaplı slaytlar hazırlamak için. Gliserol ve yumurta albümini, slaytları kaplamak için 1: 1 oranında karıştırılır
Hidroklorik asitSisco Araştırma laboratuvarları Pvt. Ltd.65955% 1 asit alkol hazırlanması için
Asetik asitHiMediaAS119Eozin
Scotts suyununLeica3802900Bluing reaktifi
Papanicolaou'nun çözeltisi 1b Hematoksilen çözeltisiSigma1.09254.0500Çekirdeklerin boyanması
EozinHiMediaGRM115Sitoplazmanın boyanması,% 0.25 çözelti hazırlandı kurum içi
DPX Mountant ortamıSigma6522Retina bölümlerinin görselleştirilmesi ve korunması
Ekipmanlar
ZüccaciyeBorosil
Kornea forsepStephens AletleriS5-1200Diseksiyon
Colibri forsepStephens AletleriS5-1135Diseksiyon
Kavisli mikro makasStephens AletleriS7-1311Diseksiyon
Vannas makasStephens AletleriS7-1387Diseksiyon
İris makasStephens AletleriS7-1015Diseksiyon
KasetleriHiMediaPW1292Histoloji işleme sırasında dokuyu tutmak için
Su banyosuGT SonicGT Sonic-D9Sıcaklık bakımı
Parafin gömme istasyonuMyrEC 350Parafin bloklarının hazırlanması
MikrotomZhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.YD-335AKesit
BıçaklarıLeicaLeica 818Kesit
SlaytlarıHiMediaBG005Parafin doku bölümlerini tutma
LamellerHiMediaBG014CMontaj ortamı ekledikten sonra dokuyu kaplamak için
Kan Retina Bariyeri bozulması
Reaktifler
İzofluranAbbottB506Anestezi
Kuru buzUygulanamaz UygulanamazDiseksiyon
Bradford reaktifiSigmaB6916Protein miktar tayini
Ekipmanlar< / güçlü >
Kornea forsepStephens InstrumentsS5-1200Diseksiyon
Colibri forsepStephens AletleriS5-1135Diseksiyon
Kavisli mikro makasStephens AletleriS7-1311Diseksiyon
Vannas makasStephens AletleriS7-1387Diseksiyon
İris makasStephens AletleriS7-1015Diseksiyon
ZüccaciyeBorosilUygulanamaz
EDTA kaplı tüplerJ.K DiagnosticsUygulanamazTam kandan ayrı plazma
Homojenizasyon tüpleriMP BiomedicalsSKU: 115076200-CFCamsı homojenizasyonu
Homojenizasyon kapaklarıMP BiomedicalsSKU: 115063002-CFCamsı cam boncukların homojenizasyonu
MP BiomedicalsSKU: 116914801Vitreusun homojenizasyonu
HomojenizatörBertin InstrumentsP000673-MLYS0-ACamsı 96 oyuklu plakanın homojenizasyonu
- ŞeffafGrenierGN655101Protein miktar tayini
Plaka okuyucuMoleküler cihazlarSpectrMax M4Absorbans ölçümü
SantrifüjREMICPR240 PlusSantrifüj
Floresan Anjiyografi
Reagents
IsofluranAbbottB506Anestezi
FITC-dekstran 70 kD (Sigma'dan FITC, Dextran, Dibutylin dilaurate, DMSOFITC, Dextran ve Dibutylin dilaurat; HiMediaFITC-F3651, Dextran-31390, Dibutylin dilaurate -29123, DMSO-TC185'ten DMSOŞirket içi
FluoroshiedSigmaF6182Solma önleyici montaj ortamı
< güçlü > Ekipmanlar< / güçlü >
kornea forsepStephens AletleriS5-1200Diseksiyon
Colibri forsepStephens AletleriS5-1135Diseksiyon
Kavisli mikro makasStephens AletleriS7-1311Diseksiyon
Vannas makasStephens AletleriS7-1387Diseksiyon
İris makasStephens AletleriS7-1015Diseksiyon
ZüccaciyeBorosilUygulanamaz
SlaytlarHiMediaBG005Flatmount hazırlığı
LamellerHiMediaBG014CMontaj ortamı ekledikten sonra dokuyu kaplamak için
Konfokal mikroskopLeicaDMi8Flatmount'un görselleştirilmesi
Ketamin ajanı hazırlanması için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
  2. Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
  3. Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).
  4. Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
  5. El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
  6. Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81(1991).
  7. Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
  8. Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
  9. Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816(2018).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
  11. Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
  12. Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
  13. Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).
  14. Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
  15. Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
  16. do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
  17. Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
  18. D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
  19. Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
  20. Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
  21. Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php (2009).
  22. Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
  23. Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
  24. Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
  25. Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).
  26. Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795(2011).
  27. D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
  28. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Diabetic RetinopathyRetinal PathophysiologyBlood Retinal BarrierRetinal HistologyFluorescence AngiographyRetinal Cell CountRetinal Flat MountProtein Leakage AssayRetinal Angiogenesis

İlgili makaleler