Method Article

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerde Multipl Mitokondriyal Parametrelerin ve Nöral ve Glial Türevlerinin Akış Sitometrik Analizi

DOI:

10.3791/63116

⸱

November 8th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, mitokondriyal hacim, mitokondriyal membran potansiyeli, reaktif oksijen türleri seviyesi, mitokondriyal solunum zinciri bileşimi ve mitokondriyal DNA'daki değişiklikleri tespit etmek için iki floresan muhabir veya antikor ile akış sitometrisine ve çift boyamaya dayalı çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametreleri ölçmek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri birçok nörodejeneratif hastalığın patofizyolojisinde önemlidir. Mitokondriyal hacimdeki değişiklikler, mitokondriyal membran potansiyeli (MMP), reaktif oksijen türlerinin mitokondriyal üretimi (ROS) ve mitokondriyal DNA (mtDNA) kopya sayısı genellikle bu süreçlerin özellikleridir. Bu rapor, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) ve iPSC kaynaklı nöral ve glial hücreler de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinde çoklu mitokondriyal parametreleri ölçmek için yeni bir akış sitometrisine dayalı yaklaşımı detaylandırmaktadır. Bu akış tabanlı strateji, mitokondriyal hacim, MMP ve ROS seviyelerini ölçmek için canlı hücrelerin yanı sıra mitokondriyal solunum zincirinin (MRC) bileşenlerini ve mitokondriyal transkripsiyon faktörü A (TFAM) gibi mtDNA ile ilişkili proteinleri tahmin etmek için sabit hücreleri kullanır.

MitoTracker Green (MTG), tetrametilrodamin etil ester (TMRE) ve MitoSox Red dahil olmak üzere floresan muhabirlerle birlikte boyanarak, mitokondriyal hacim, MMP ve mitokondriyal ROS'taki değişiklikler ölçülebilir ve mitokondriyal içerikle ilişkilendirilebilir. MRC kompleks alt birimlerine ve dış mitokondriyal membran 20 (TOMM20) translokazına karşı antikorlarla çift boyama, MRC alt birim ekspresyonunun değerlendirilmesine izin verir. TFAM miktarı mtDNA kopya sayısı ile orantılı olduğundan, TOMM20 başına TFAM ölçümü, mitokondriyal hacim başına mtDNA'nın dolaylı bir ölçümünü verir. Tüm protokol 2-3 saat içinde gerçekleştirilebilir. Önemli olarak, bu protokoller, akış sitometrisi kullanılarak mitokondriyal parametrelerin hem toplam seviyede hem de mitokondriyal hacim başına spesifik seviyede ölçülmesine izin verir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri, hemen hemen tüm ökaryotik hücrelerde bulunan esansiyel organellerdir. Mitokondri, oksidatif fosforilasyon yoluyla adenozin trifosfat (ATP) üreterek enerji tedarikinden sorumludur ve biyosentez ve metabolizma için metabolik aracılar olarak işlev görür. Mitokondri, ROS üretimi, hücre ölümü ve hücre içi Ca2 + regülasyon gibi diğer birçok önemli hücresel süreçte derinden rol oynar. Mitokondriyal disfonksiyon, Parkinson hastalığı (PD), Alzheimer hastalığı (AD), Huntington hastalığı (HD), Friedreich ataksi (FRDA) ve amiyotrofik lateral skleroz (ALS)1 dahil olmak üzere çeşitli nörodejeneratif hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Artmış mitokondriyal disfonksiyon ve mtDNA anormalliğinin de insan yaşlanmasına katkıda bulunduğu düşünülmektedir 2,3.

Nörodejeneratif hastalıklarda çeşitli mitokondriyal disfonksiyon tipleri ortaya çıkar ve mitokondriyal hacimdeki değişiklikler, MMP depolarizasyonu, ROS üretimi ve mtDNA kopya sayısındaki değişiklikler yaygındır 4,5,6,7. Bu nedenle, bu ve diğer mitokondriyal fonksiyonları ölçme yeteneği, hastalık mekanizmalarını incelerken ve potansiyel terapötik ajanları test ederken büyük önem taşımaktadır. Ayrıca, insan nörodejeneratif hastalıklarını sadık bir şekilde kopyalayan hayvan modellerinin eksikliği göz önüne alındığında, beyin hücrelerinde insan hastalığını özetleyen uygun in vitro model sistemlerin kurulması, bu hastalıkların daha iyi anlaşılması ve yeni tedavilerin geliştirilmesi için önemli bir adımdır 2,3,8,9.

İnsan iPSC'leri, nöronal ve nöronal olmayan hücreler (yani, glial hücreler) dahil olmak üzere çeşitli beyin hücreleri üretmek için kullanılabilir ve nörodejeneratif hastalıkla ilişkili mitokondriyal hasar her iki hücre tipinde debulunmuştur 3,10,11,12,13. Nöral ve glial soylara iPSC farklılaşması için uygun yöntemler mevcuttur14,15,16. Bu hücreler, in vitro hastalık modellemesi ve ilaç taraması için benzersiz bir insan / hasta platformu sağlar. Ayrıca, bunlar hastalardan türetildiğinden, iPSC kaynaklı nöronlar ve glial hücreler, insanlarda neler olup bittiğini daha doğru yansıtan hastalık modelleri sağlar.

Bugüne kadar, iPSC'lerde, özellikle canlı nöronlarda ve glial hücrelerde çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametreleri ölçmek için birkaç uygun ve güvenilir yöntem mevcuttur. Akış sitometrisinin kullanımı, bilim adamına mitokondriyal fonksiyon da dahil olmak üzere biyolojik parametreleri tek hücrelerde ölçmek için güçlü bir araç sağlar. Bu protokol, iPSC'lerden nöral kök hücreler (NSC'ler), nöronlar ve glial astrositler dahil olmak üzere farklı tipte beyin hücrelerinin yanı sıra iPSC'ler ve iPSC türevi nöral ve glial hücreler de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinde çoklu mitokondriyal parametreleri ölçmek için yeni akış sitometrisine dayalı yaklaşımlar için ayrıntılar sağlar. Protokol ayrıca mitokondriyal hacmi, MMP'yi, mitokondriyal ROS seviyesini, MRC komplekslerini ve TFAM'yi ölçmek için akış sitometrisini kullanmak için bir ortak boyama stratejisi sağlar. Mitokondriyal hacim veya kütle ölçümlerini içererek, bu protokoller mitokondriyal birim başına hem toplam seviyenin hem de spesifik seviyenin ölçülmesine izin verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm ortam ve çözümlerin tarifleri için Malzeme Tablosuna ve Ek Tablo S1'e bakınız.

1. İnsan iPSC'lerinin NCS'lere, dopaminerjik (DA) nöronlara ve astrositlere farklılaşması

  1. Matris kaplı plakalar hazırlayın.
    1. Bir gecede buz üzerinde 5 mL'lik bir matris şişesi çözün. 1 mL matrisi 99 mL soğuk Advanced Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium/Ham'ın F-12'si (Advanced DMEM/F12) (% 1 nihai konsantrasyon) ile seyreltin. 1 mL aliquots yapın ve -20 ° C'de saklayın.
    2. Matris çözeltisini 4 ° C'de çözün (soğuk tutun) ve 6 kuyucuğu kaplayın (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 1 mL).
    3. Matris kaplı plakayı nemlendirilmiş %5 CO2/%95 hava inkübatörüne 37 °C'de 1 saat boyunca yerleştirin. Plakayı inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına (RT) dengelenmesini sağlayın.
      NOT: Plakanın kaplamadan sonraki 3 gün içinde kullanılması önerilir. Bununla birlikte, kaplanmış plaka 4 ° C'de 2 haftaya kadar saklanabilir. Sadece çıkarmayı ve kullanmadan önce RT'ye ısınmasına izin vermeyi unutmayın. Uzun süreli depolama için, matrisin kurumasını önlemek için kaplanmış plakaya 1 mL iPSC kültür ortamı ekleyin.
  2. iPSC'leri çözme
    1. Matris kaplı plakaları RT'de veya inkübatörde 37 ° C'de 20-30 dakika boyunca önceden ısıtın. RT'de gerekli miktarda iPSC kültür ortamını önceden ısıtın.
    2. 10 μM'lik nihai bir konsantrasyon elde etmek için 6 mL önceden ısıtılmış iPSC kültür ortamını 12 μL Y-27632 ROCK inhibitörü ile karıştırın.
    3. iPSC'lerin donmuş şişesini 37 ° C'de bir su banyosunda küçük bir buz parçası kalana kadar kısmen çözün.
    4. Hücrelere damla damla 12 μL ROCK inhibitörü ile yavaşça 1 mL önceden ısıtılmış iPSC kültür ortamı ekleyin. Şişenin sıvı içeriğini iPSC'lerle damla damla 5 mL'lik bir pipet kullanarak 6 delikli önceden kaplanmış bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın.
    5. Kuyu içeriğini karıştırmak ve plakayı inkübatöre geri döndürmek için plakayı dik yönlerde hareket ettirin. Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) (1x) (Ca 2+/Mg 2+-içermeyen) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile yıkadıktan sonra24 saat sonra iPSC kültür ortamını değiştirin.
      NOT: Sonraki beslemelere ROCK inhibitörü eklemeyin. iPSC kültür ortamını günlük olarak değiştirin.
  3. iPSC'lerin alt kültürlenmesi
    1. Matris kaplı plakaları RT'de veya inkübatörde 37 ° C'de 20-30 dakika boyunca önceden ısıtın. RT'de gerekli miktarda iPSC kültür ortamını önceden ısıtın.
    2. Kültür ortamını hücreleri içeren plakalardan aspire edin. iPSC'leri DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile durulayın.
    3. EDTA (0,5 mM) ekleyin (6 delikli bir plakada kuyu başına 1 mL). Kolonilerin kenarları kuyudan kalkmaya başlayana kadar plakaları 37 ° C'de kuluçkaya yatırın (genellikle 3-5 dakika). EDTA'yı aspire edin.
    4. Önceden ısıtılmış iPSC kültür ortamı ekleyin (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ve 10 mL'lik steril pipet kullanarak iPSC kolonilerini bir kez zorla ayırın. Hücre kümelerini tek hücrelere ayırabileceğinden yukarı ve aşağı pipet yapmayın.
    5. Her bir kuyucuğun içeriğini matris kaplı 6 delikli bir plakada (6 delikli bir plakada kuyu başına 2 mL) iki ayrı kuyucuğa aktarın ve 37 ° C'de inkübe edin. Pipetleme sırasında süspansiyonda kabarcıklar oluşturmayın.
      NOT: İnkübatörde tutmadan önce plakayı hafifçe sallayın. Bölünme oranı 1: 2 (bir kuyudan 2 yeni kuyuya) ila 1: 4 (bir kuyudan 4 yeni kuyuya) kadar olabilir.
    6. Koloniler iyi boyut ve bağlantılarla birleştiğinde% 60 birleşene kadar ortamı günlük olarak değiştirin.
  4. Nöral indüksiyon ve nöral progenitör üretimi
    1. 500 mL Kimyasal Olarak Tanımlanmış Ortam (CDM), 500 mL Nöral İndüksiyon Ortamı (NIM) ve 500 mL Nöral Kök Hücre Serumsuz (NSC SF) ortamı hazırlayın.
    2. Hücreleri DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile durulayın ve NIM (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 3 mL) ekleyin. Gün 0 olarak ayarlayın.
    3. NIM'i (6 delikli bir plakada kuyu başına 3 mL) 1. Gün, 3. Gün ve 4. Gün'de değiştirin ve günlük mikroskopi altında gözlemleyin.
    4. 5. Günde, nöral rozetleri aşağıda açıklandığı gibi süspansiyon kültürüne ayırın.
      1. DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile bir kez nazikçe yıkayın. Kollajenaz IV ekleyin (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 1 mL) ve 1 dakika boyunca bir inkübatörde tutun. Kollajenaz IV'ü aspire edin ve DPBS (1x) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile bir kez yavaşça yıkayın.
      2. 6 delikli bir plakaya kuyucuk başına 2 mL NSC SF Medium ekleyin. 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak ızgaralar çizerek kuyucukların tabanlarını kazıyarak hücreleri ayırın.
      3. Hücre süspansiyonunu 6 delikli plakadan 10 cm'lik yapışmaz bir kaba toplayın. NSC SF Medium ile ses seviyesini 12 mL'ye kadar yükseltin.
      4. Yapışkan olmayan çanağı, birikmeyi önlemek için bir inkübatördeki yörüngesel çalkalayıcıda 65-85 rpm'de çalkalayın.
  5. DA nöron farklılaşması
    1. 7. Günde, 100 ng / mL fibroblast büyüme faktörü-8b (FGF-8b) ile desteklenmiş 12 mL CDM ekleyin ve çanağı inkübatördeki orbital çalkalayıcıya yerleştirin.
    2. 8-13. günlerde, ortamı her 2 günde bir değiştirin ve günlük mikroskopi altında gözlemleyin.
    3. 14. Günde, 100 ng / mL FGF-8b ve 1 μM purmorfamin (PM) ile desteklenmiş 12 mL CDM ekleyin. Çanağı inkübatördeki yörüngesel çalkalayıcıya yerleştirin.
    4. 15-20. günlerde, ortamı her 2 günde bir değiştirin ve mikroskopi altındaki hücreleri günlük olarak gözlemleyin.
    5. Daha büyük küreleri parçalamak için 1000 μL uçları kullanarak küreleri mekanik olarak geçirin.
      NOT: Oran 1: 2 olabilir (bir tabak 2 yeni tabağa dönüşür).
  6. Farklılaşmanın sonlandırılması
    1. Aşağıda açıklandığı gibi 6 delikli bir plakayı veya kapak kapaklarını Poli-L-Ornitin (PLO) ve laminin ile kaplayın.
      1. 6 delikli bir plakayı kuyu başına 1 mL PLO ile kaplayın ve plakayı 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. FKÖ çözümünü aspire edin.
      2. Plakayı UV altında 20 dakika sterilize edin. Kuyucukları DPBS (1x) ile iki kez durulayın (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL).
      3. Kuyuya 5 μg / mL laminin çözeltisi (6 delikli bir plakada kuyu başına 1 mL) ekleyin ve 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Laminini aspire edin ve kaplamadan önce kuyucukları DPBS (1x) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile bir kez kısaca yıkayın.
    2. Tüm küreleri (adım 1.5.5'ten itibaren) 50 mL tüplerde toplayın ve DPBS (1x) ile doldurun. 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Süper natantı aspire edin.
    3. Bir su banyosunda 37 °C'de 10 dakika boyunca 2 mL hücre ayrışma reaktifi ile inkübe edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ardından 200 μL'lik bir pipetle nazik tritürasyon yapın (kürelerin boyutuna bağlı olarak 20-50 kez, kabarcık oluşumunu önleyin).
    4. Hücre ayrışma reaktifini% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile 2 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile nötralize edin ve hücreleri içeren 50 mL konik tüpü RT'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin.
    5. 10 ng / mL Beyin Türetilmiş Nörotrofik Faktör (BDNF) ve 10 ng / mL Glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) ile desteklenmiş 1 mL CDM ekleyin ve tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletlerini yeniden askıya alın.
    6. Laminin çözeltisini plakadan aspire edin (adım 1.6.1.3), DPBS (1x) ile kısaca yıkayın (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ve hücreleri (adım 1.6.5'ten itibaren) önceden kaplanmış plakalarda veya kapaklarda, 10 ng / mL BDNF ve 10 ng / mL GDNF ile desteklenmiş 3 mL CDM'de tohumlayın. Hücreleri her 4 günde bir besleyin.
      NOT: Farklılaşan kültürler 3 aya kadar haftalarca korunabilir. Nöral morfoloji genellikle 2 haftalık terminasyondan sonra ortaya çıkar ve bu noktadan itibaren aşağı akış analizleri için kullanılabilir. BDNF ve GDNF, daha uzun bakım (2 aya kadar) için kültürleme için gerekli değildir.
  7. NSC üretimi
    1. Ceket matris plakaları.
    2. Tüm nöral küreleri (adım 1.4'ten üretilen) 50 mL tüplerde toplayın ve DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) ile doldurun. 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün. Süpernatanları aspire edin.
    3. Peletleri bir su banyosunda 37 °C'de 10 dakika boyunca 2 mL hücre ayrışma reaktifi ile inkübe edin, ardından 200 μL'lik bir pipetle nazik tritürasyon (kürelerin boyutuna bağlı olarak 20-50 kez, kabarcık oluşumunu önleyin).
    4. % 10 FBS ile 2 mL DMEM ile nötralize edin ve RT'de 5 dakika boyunca 300 × g'de hücreleri içeren 50 mL konik tüpleri santrifüj edin. Tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için hücre peletlerini hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın.
    5. Matris çözeltisini önceden kaplanmış bir plakadan aspire edin ve önceden kaplanmış plakalardaki hücreleri NSC SF Medium'da tohumlayın (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 3 mL). Hücreleri her 2-3 günde bir besleyin ve birleştiğinde hücreleri bölün.
      NOT: Bu aşamadan itibaren, NSC'ler genişletilebilir ve dondurulabilir.
  8. Glia astrosit farklılaşması
    1. NSC'lerden astrosit farklılaşması
      1. 500 mL Astrosit Farklılaşma Ortamı hazırlayın.
      2. NSC SF Medium ile Poli-D-Lizin (PDL) kaplı plakalar/kapaklar üzerinde tohum NSC'leri.
      3. Ertesi gün, hücreleri DPBS (1x) (Ca2 + / Mg2 + içermeyen) (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 4 mL) ile durulayın ve Astrosit Farklılaşma Ortamı (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 3 mL) ekleyin. Gün 0 olarak ayarlayın.
      4. NSC'leri mikroskop altında günlük olarak gözlemleyin ve Astrosit Farklılaşma Ortamını (6 delikli bir plakada kuyu başına 3 mL) 1. Günden 27. Güne kadar her 2 günde bir değiştirin.
    2. Astrosit olgunlaşması
      1. Astrosit olgunlaşma ortamı hazırlayın.
      2. 28. Günde, hücreleri DPBS (1x) (6 kuyucuklu bir plakada kuyu başına 4 mL) ile durulayın ve Astrosit Olgunlaşma Ortamı (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 3 mL) ekleyin.
      3. 29. gün ve sonrasında, hücreleri mikroskop altında günlük olarak gözlemleyin ve her 2 günde bir Astrosit Olgunlaşma Ortamını (6 delikli bir plakada kuyu başına 3 mL) değiştirin.
      4. Bir aylık olgunlaşmadan sonra, hücreleri genişletin ve bu aşamadan itibaren kriyoproteksiyon.
        NOT: Bu aşamada, hücre sayısı artacaktır. Hücreleri bölerken, PDL kaplı kapaklar kültürleme için gerekli değildir.

2. İmmünositokimya ve immünofloresan boyama ile hücre karakterizasyonu

  1. Kültür döneminin sonunda, kapakları hücrelerle birlikte 12 delikli bir plakaya aktarın.
    Hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) (1x) ile iki kez durulayın ve RT'de% 4 Paraformaldehit (PFA) (12 delikli bir plakada kuyucuk başına 0.5 mL) içinde 10 dakika boyunca inkübe edin.
    NOT: Sabit numune 2 mL PBS (1x) ile kaplanabilir ve immün boyama için gerekli olana kadar 4 °C'de saklanabilir. PFA toksiktir ve kansere neden olduğundan şüphelenilmektedir. Cilt ve göze maruz kalmayı önleyin ve kimyasal bir duman başlığı altında çalışın.
  2. Hücreleri bloke edin ve geçirgenleştirin ve RT'de 1 saat boyunca PBS (1x),% 0.3 Triton X-100 ve% 10 normal keçi serumu içeren bloke edici tamponla inkübe edin.
  3. 4 °C'de gece boyunca bloke edici tamponda birincil antikorlarla inkübe edin: anti-oktamer bağlayıcı transkripsiyon faktörü 4 (Ekim4) ve anti-evreye özgü embriyonik antijen-4 (SSEA4) ile leke iPSC'ler, anti-cinsiyet belirleyici bölge Y kutusu-2 (Sox2) ve anti-Nestin içeren NSC'ler, anti-eşleştirilmiş kutu-6 (Pax6) ve anti-Nestin içeren nöral küreler, anti-glial fibriler asidik protein (GFAP) ve anti-S100 kalsiyum bağlayıcı protein β (S100β) içeren DA nöronları, anti-β III Tubulin (Tuj 1), anti-Sinaptofizin ve anti-PSD-95 (12 delikli bir plakada kuyucuk başına 0,5 mL birincil antikor çözeltisi; ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. Numuneleri PBS (1x) ile her biri 10 dakika boyunca üç kez hafifçe sallayarak yıkayın.
  5. İkincil antikor çözeltisi (bloke edici tamponda 1:800, 12 delikli bir plakada kuyucuk başına 0,5 mL Alexa Fluor sekonder antikor çözeltisi) ile RT'de 1 saat boyunca hafifçe sallanarak inkübe edin.
  6. Çekirdekleri etiketlemek için hücreleri PBS'de (1x) Hoechst 33342 (1:5.000, 12 delikli bir plakada kuyu başına 0,5 mL) ile RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  7. Karanlıkta floresan mikroskobu altında görüntüleme için hücreleri montaj ortamıyla monte edin ve RT'de gece boyunca kurutun. Mikroskop ayarları ve parametreleri için Ek Şekil S1'e bakınız.

3. Canlı hücrelerde mitokondriyal hacim, MMP ve mitokondriyal ROS'un akış sitometrisi ölçümü

  1. Hücreleri% 50 -% 60 akıcılığa ulaşana kadar 6 delikli bir plakada ayrı ayrı 4 kuyucuk halinde tohumlayın. Bu dört kuyuyu #1, #2, #3 ve #4 olarak etiketleyin.
  2. Kültür periyodunun sonunda, aşağıdaki gibi 5 ayrı boyama çözeltisi (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 500 μL) hazırlayın: # 1 sadece kültür ortamı (kontrol için sadece hücreleri içeren kuyu # 1'e); FCCP (100 μM) içeren #2-1; Kültür ortamında FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) içeren #2-2; Kültür ortamında TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) içeren #3; #4, %10 FBS ile PBS'de (1x) MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) içerir. Bu bileşikler ve akış sitometrisi kurulumu hakkında ayrıntılar için Şekil 1A, Ek Tablo S2 ve Malzeme Tablosu'na bakın.
    NOT: Boyama çözeltisini hazırlamak için kültür ortamını kullanın. Kullanmadan önce ortamı ve PBS'yi (1x) RT'de ısıtın. FCCP toksiktir; cilt ve göze maruz kalmayı önler ve kimyasal bir duman başlığı altında çalışır.
  3. Ortamı #2 kuyucuğundan aspire edin ve #2-1 çözeltisi ekleyin (yalnızca FCCP). Hücreleri 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Ortamı #2 ve #3 kuyularından aspire edin ve #2 kuyucuğuna #2-2 çözeltisi (FCCP + TMRE + MTG) ve #3 koduna #3 çözeltisi (TMRE + MTG) ekleyin. Hücreleri 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. Ortamı # 4 kuyusundan aspire edin ve # 4 çözeltisi ekleyin (MitoSox Kırmızı + MTG). Hücreleri 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  6. Ortamı tüm kuyucuklardan aspire edin. PBS (1x) ile yıkayın (6 delikli bir plakada kuyu başına 4 mL). 5 dakika boyunca 37 ° C'de 1 mL hücre ayrışma reaktifi (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 1 mL) kullanarak hücreleri ayırın. Hücre ayrışma reaktifini 1 mL DMEM'de% 10 FBS (6 delikli bir plakada kuyucuk başına 2 mL) ile nötralize edin.
  7. Tüm kuyuların içeriğini 15 mL konik tüplerde toplayın. Tüpleri 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın. Peletleri PBS (1x) ile bir veya iki kez yıkayın.
  8. Süpernatantları aspire edin, ancak tüplerde yaklaşık 100 μL bırakın. Hücre peletlerini 300 μL PBS (1x) içinde yeniden askıya alın. Hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. RT'de tüpleri karanlıkta tutun.
  9. Bir akış sitometresi kullanarak hücreleri analiz edin (3 mavi ve 1 kırmızı lazer konfigürasyonu ile). 530/30 bandpass filtresi kullanarak filtre 1'de (FL1) MTG'yi, 585/40 bandpass filtresini kullanarak filtre 2'de (FL2) TMRE'yi ve 510/580 bandpass filtresi kullanarak filtre 3'te (FL3) MitoSox Red'i algılayın.

4. Sabit hücrelerde MRC kompleks alt birimlerinin ve TFAM'nin akış sitometrisi ölçümü

  1. Kültür periyodunun sonunda, hücre ayrışma reaktifini ekleyerek hücreleri ayırın (~ 106); Daha sonra, hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve toplayın. PBS (1x) ile santrifüjleme yaparak hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj yaparak iki kez yıkayın.
  2. Hücreleri RT'de 10 dakika boyunca% 1.6 PFA'da (15 mL'lik bir tüpte 1 mL% 1.6 PFA'nın% 1 mL'si) sabitleyin. PBS (1x) ile santrifüjleme yaparak hücreleri 5 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj yaparak iki kez yıkayın.
  3. Hücreleri buz gibi soğuk% 90 metanol (15 mL'lik bir tüpte 1 mL% 90 metanol) ile -20 dakika boyunca -20 ° C'de geçirgenleştirin.
  4. Numuneleri 0.3 M glisin,% 5 keçi serumu ve% 1 sığır serumu albümini (BSA) içeren bloke tamponunda bloke edin - PBS'de Fraksiyon V (1x) (15 mL'lik bir tüpte 1 mL bloke tamponu). Hücreleri PBS (1x) ile iki kez santrifüjleme yaparak yıkayın (adım 3.7'de olduğu gibi).
  5. Hücreleri 30 dakika boyunca aşağıdaki birincil antikorlarla inkübe edin: kompleks I alt biriminin ölçümü için anti-NDUFB10 (1:1.000), kompleks II alt biriminin ölçümü için anti-süksinat dehidrogenaz kompleks flavoprotein alt birimi A (SDHA, 1:1.000) ve kompleks IV alt biriminin ölçümü için anti-COX IV (1:1.000) ve Alexa Fluor 488 (1:400) ile konjuge edilmiş anti-TFAM antikoru. Alexa Fluor 488 (1:400) ile konjuge edilmiş anti-TOMM20 antikoru ile aynı sayıda hücreyi 30 dakika boyunca ayrı ayrı lekeleyin (15 mL'lik bir tüpte 1 mL birincil antikor çözeltisi; antikorlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın).
  6. Hücreleri PBS (1x) ile bir kez 300 × g'da santrifüjleme ile 5 dakika boyunca yıkayın. NDUFB10, SDHA ve COX IV tüplerine ikincil antikor (1:400) ekleyin ve hücreleri bu çözeltilerle 30 dakika boyunca inkübe edin.
  7. Hücreleri PBS (1x) ile 5 dakika boyunca 300 × g'de santrifüj yaparak bir kez yıkayın. Süpernatantları aspire edin, tüplerde yaklaşık 100 μL bırakın. Hücre peletlerini 300 μL PBS (1x) içinde yeniden askıya alın. Hücreleri buz üzerinde karanlıkta tutulan 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
  8. Akış sitometresindeki hücreleri analiz edin (3 mavi ve 1 kırmızı lazer konfigürasyonu ile). 530/30 bandpass filtresi kullanarak filtre 1'deki (FL1) sinyalleri algılayın. Mikroskop ayarları ve parametreleri için Ek Şekil S2'ye bakınız.

5. Akım sitometrisi edinimi ve analizi

  1. Analiz edilen hücre popülasyonunun boyutuna ve karmaşıklığına bağlı olarak ileri saçılma alanı (FSC-A) ve yan saçılma alanı (SSC-A) saçılma grafiklerini ayarlamak için lekesiz kontrol tüpünü kullanın. Mikroskop ayarları ve parametreleri için Ek Şekil S2'ye bakınız.
    NOT: Tek tek hücre tipleri için lekesiz denetimler ayarlayın.
  2. Pozitif kapıları seçmek için leke olmayan kontrol tüplerini kullanın ve çok renkli akış sitometrisinde MTG (florofor-1 [FL-1]) ve TMRE (FL-2) arasındaki floresan spektral örtüşmesini telafi etmek için tek renkli kontrol tüpleri kullanın. MRC ve TFAM örneklerinde arka plan boyamasını izlemek üzere negatif kontrol için izotip kontrolünü kullanın. FCCP tüpünü TMRE boyama için depolarizasyon kontrolü olarak kullanın.
  3. Canlı hücreleri ve ana geçidi ileri ve yan saçılma grafiğinden seçmek için yabancı kalıntıları kapatın (Şekil 2A). Çiftleri hariç tutmak ve ayrıca bir yan saçılma yüksekliği (SSC-H) ve SSC-A grafiği oluşturmak için ileri dağılım yüksekliği (FSC-H) ve (vs.) FSC-A yoğunluk grafiği kullanarak çiftleri kapatın (Şekil 2A).
  4. Veri toplama (akış sitometresi)
    1. Lekesiz veya izotip örnekleri negatif kontrol olarak kullanarak, SSC-A'yı ve çeşitli filtreleri (FL1, FL2, FL3, FL4) görüntülerken tek hücreli olayların ana popülasyonunun üzerinde bir kapı oluşturun (Şekil 1B ve Şekil 2B).
  5. Veri analizi (CFlow yazılımı)
    1. Kapıların konumunu lekeli hücre örneklerine kopyalayın ve pozitif boyama için pozitif boyanmış hücrelerin miktarını kaydedin.
    2. Her hücre alt popülasyonu için bir histogram grafiği seçin ve farklı filtre kanallarının (FL1, FL2, FL3, FL4) (x ekseni) medyan floresan yoğunluğunu (MFI) analiz edin.
      1. TMRE düzeylerini, aşağıdaki Eq (1)'de olduğu gibi, bir histogramdaki #3 TMRE boyalı örneklerden FL2 MFI'sından FL2 FCCP ile muamele edilmiş hücrelerin FL2 MFI'sından çıkararak hesaplayın.
        TMRE seviyeleri = #3 TMRE boyalı numunelerden FL2'nin MFI'sı - #2 FCCP ile muamele edilmiş hücrelerin FL2'sinin MFI'sı (1)
      2. MMP ve mitokondriyal ROS için spesifik değerleri, mitokondriyal hacim göstergesi MTG'yi bölerek TMRE veya MitoSox Kırmızısı cinsinden MFI ile hesaplayın.
      3. Karmaşık alt birim ve TFAM için özgül değeri, karmaşık ifadede MFI veya TFAM kullanarak mitokondriyal hacim göstergesi TOMM20'yi bölerek hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farklılaşma yönteminin ve akış sitometrik stratejilerinin şematik bir açıklaması Şekil 3'te gösterilmiştir. İnsan iPSC'leri nöral rozetlere farklılaştırılır ve daha sonra nöral kürelere farklılaşma için süspansiyon kültürüne kaldırılır. Nöral küreler daha da farklılaşır ve DA nöronlarına olgunlaşır. Nöral küreler, glial astrositler üretmek için tek hücrelere ayrılır, NSC'ler olarak tek katmanlar halinde yeniden kaplanır ve daha sonra astrositlere farklılaştırılır. Bu protokol, MMP, mitokondr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, iPSC kaynaklı nöronlar ve astrositler üretmek ve akış sitometrisi kullanarak mitokondriyal fonksiyonun birçok yönünü değerlendirmek için protokoller bulunmaktadır. Bu protokoller, insan iPSC'lerinin hem nöronlara hem de glial astrositlere verimli bir şekilde dönüştürülmesine ve çoğunlukla canlı hücrelerde mitokondriyal fonksiyonun ayrıntılı karakterizasyonuna izin verir. Protokoller ayrıca, canlı hücrelerde hacim, MMP ve mitokondriyal ROS seviyeleri ve MRC kompleksleri ve sabit hücrelerde TFAM dahil olmak üzere ç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Norveç'teki Bergen Üniversitesi'ndeki Moleküler Görüntüleme Merkezi ve Akış Sitometrisi Çekirdek Tesisi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma, Norveç Araştırma Konseyi (Hibe numarası: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ve Çin Burs Konseyi (proje numarası: 201906220275) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
anti-Oct4Abcamab19857, RRID: AB_445175Birincil Antikor; 1:100, 10 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi; Alexa Fluor & reg; kullanın 488 keçi anti-tavşan IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) ikincil antikor olarak.
anti-SSEA4Abcamab16287, RRID: AB_778073Birincil Antikor; 1:100, 10 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi; Alexa Fluor & reg; kullanın İkincil antikor olarak 594 keçi anti-fare IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005).
anti-Sox2Abcamab97959, RRID: AB_2341193Birincil Antikor; 1:100, 10 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi; Alexa Fluor & reg; kullanın 488 keçi anti-tavşan IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) ikincil antikor olarak.
anti-Pax6Abcamab5790, RRID: AB_305110Birincil Antikor; 1:100, 10 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi; Alexa Fluor & reg; kullanın 488 keçi anti-tavşan IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) ikincil antikor olarak.
anti-NestinSanta Cruz Biyoteknolojisc-23927, RRID: AB_627994Birincil Antikor; 1:50, 20 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi; Alexa Fluor & reg; kullanın İkincil antikor olarak 594 keçi anti-fare IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005).
anti-GFAPabcam ab4674, RRID: AB_304558Birincil antikor; 1:100, 10 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi;   Alexa Fluor & reg; kullanın İkincil antikor olarak 594 keçi anti-tavuk IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11042).
anti-S100 ve beta;   Alexa Fluor 488 ile konjugeAbcamab196442, RRID: AB_2722596Birincil Antikor; 1:400, 2.5 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi;
anti-THAbcamab75875, RRID: AB_1310786Birincil Antikor; 1:100, 10 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi; Alexa Fluor & reg; kullanın 488 keçi anti-tavşan IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) ikincil antikor olarak.
anti-TUJ 1abcamab78078, RRID: AB_2256751birincil antikor; 1:1000, 1 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi; Alexa Fluor & reg; kullanın İkincil antikor olarak 594 keçi anti-fare IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11005).
anti-SinaptofizinAbcamab32127, RRID: AB_2286949Birincil Antikor; 1:100, 10 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi; Alexa Fluor & reg; kullanın 488 keçi anti-tavşan IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) ikincil antikor olarak.
anti-PSD-95Abcamab2723, RRID: AB_303248Birincil Antikor; 1:100, 10 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi;   Alexa Fluor & reg; kullanın İkincil antikor olarak 594 keçi anti-tavuk IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11042).
Abcamab198308ile konjuge anti-TFAM; 1:400, 2.5 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi; fare monoklonal IgG2b  kullanın Alexa Flor® 488 bir izotip kontrolü olarak.
Santa Cruz BiyoteknolojiKedisi # sc-17764 ilekonjuge anti-TOMM20Birincil Antikor; 1:400, 2.5 & olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi; fare monoklonal IgG2a  kullanın; Alexa Flor® 488 bir izotip kontrolü olarak.
anti-NDUFB10Abcamab196019Birincil Antikor; 1:1000, 1 & Mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi; Alexa Fluor & reg; kullanın 488 keçi anti-tavşan IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) ikincil antikor olarak; izotip kontrolü olarak tavşan monoklonal IgG kullanın.
anti-SDHAAbcamab137040Birincil Antikor; 1:1000, 1 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi;   Alexa Fluor & reg; kullanın 488 keçi anti-tavşan IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11008) ikincil antikor olarak; izotip kontrolü olarak tavşan monoklonal IgG kullanın.
anti-COX IVAbcamab14744, RRID: AB_301443Birincil Antikor; 1:1000, 1 & mu olarak kullanın; 1000 &mu'da L; L boyama çözeltisi; Kullanım  Alexa Fluor & reg; 488 keçi anti-fare IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Katalog # A-11001) ikincil antikor olarak; izotip kontrolü olarak fare monoklonal IgG'yi kullanın.
Activin APeproTech120-14EAstrosit farklılaşma ortamı bileşeni
ABM Bazal OrtaLonzaCC-3187Astrosit kültürü için bazal ortam
AGM SingleQuots Ek PaketiLonzaCC-4123Astrosit kültürü için takviye
Antibiyotik-AntimikotikThermo Fisher Scientific15240062CDM bileşeni
Gelişmiş DMEM / F-12Thermo Fisher Scientific12634010Seyreltik Geltrex
Sığır Serumu AlbüminEuropa BioproductsEQBAH62-1000İmmün boyama testlerinde antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için bloke edici ajan ve CDM bileşeni
BDNFPeproTech450-02DA nöronları orta bileşen
B-27 TakviyesiThermo Fisher Scientific17504044Astrosit farklılaşma ortamı bileşeni
BD Accuri C6 Plus Akış SitometresiBD Biosciences, ABD
Kimyasal Olarak Tanımlanmış Lipid KonsantresiThermo Fisher Scientific11905031CDM bileşeni
Kollajenaz IVThermo Fisher Scientific17104019İnsan iPSC'lerinin nazikçe ayrışması için reaktif
CCD Mikroskop Kamera Leica DFC3000G Leica Mikrosistemler, Almanya
Corning işlenmemiş kültür kaplarıSigma-AldrichCLS430589Süspansiyon kültürü
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Çeşitli hücre kültürü yıkamaları için kullanılır
DMEM/F-12, GlutaMAX takviyesiThermo Fisher Scientific10565018Astrosit farklılaşması bazal Orta
EDTAThermo Fisher İnsan iPSC'lerinin nazikçe ayrışması için Bilimsel 15575020 Reaktif
Temel 8 Bazal OrtaThermo Fisher BilimselA1516901iPSC kültürü için bazal ortam
Temel 8 Takviyesi (50X)Thermo FisheriPSC kültürü içinA1517101
EGF Rekombinant İnsan ProteiniThermo Fisher NSCPHG0314Takviyesi
FGF-temel (AA 10– 155) Rekombinant İnsan ProteiniThermo FisherNSC kültürü için Bilimsel PHG0024 Takviyesi
Fetal Sığır SerumuSigma-Aldrich12103COrta bileşen
FGF-temelPeproTech100-18BAstrosit farklılaşma ortamı bileşeni
FCCPAbcamab120081Mitokondriyal membran potansiyelini ve TMRE boyamasını
ortadan kaldırırSıvı aspirasyon sistemi BVC kontrolüVacuubrand, Almanya
Formaldehit (PFA) %16Thermo Fisher Scientific28908Hücre fiksasyonu
GeltrexThermo Fisher ScientificA1413302İnsan iPSC'lerinin takılması ve bakımı için kullanılır
GlutaMAX TakviyesiNSC kültürüThermo Fisher Scientific
Peprotech450-10DA nöronları orta bileşen
GlisinSigma-AldrichG8898Tamponu bloke etmek için kullanılır
Ham'ın F-12 Besin KarışımıThermo Fisher Scientific31765027CDM için bazal ortam
Heregulin beta-1 insanSigma-AldrichSRP3055Astrosit farklılaşma ortamı bileşeni
Hoechst 33342Thermo Fisher BilimselH1399Konfokal görüntü için çekirdekleri boyayın
Heracell 150i CO2 İnkübatörleriFisher Scientific, ABD
IMDMThermo Fisher Scientific21980032CDM
İnsüliniRoche1376497CDM bileşeni
InSolution AMPK İnhibitörüSigma-Aldrich171261Nöral indüksiyon ortamı bileşeni
İnsülin benzeri Büyüme Faktörü-I insanSigma-AldrichI3769Astrosit farklılaşma ortamı bileşeni
KnockOut DMEM/F-12 ortamıThermo Fisher Scientific12660012NSC kültürü için bazal ortam
LamininSigma-AldrichL2020İn vitro olarak nöral hücrelerin bağlanmasını ve büyümesini destekler
Leica TCS SP8 STED konfokal mikroskopLeica Microsystems, Almanya
MonotiyokliserolSigma-AldrichM6145CDM bileşeni
MitoTracker Green FMThermo Fisher ScientificM7514Mitokondriyal hacim göstergesi için kullanılır
MitoSox RedThermo Fisher ScientificM36008Mitokondriyal ROS göstergesi için kullanılır
N-Asetil-L-sisteinSigma-AldrichA7250Nöral indüksiyon ortamı bileşeni
N-2 TakviyesiThermo Fisher Scientific17502048Astrosit farklılaşma ortamı bileşeni
Normal keçi serumuThermo Fisher ScientificPCN5000bloke etmek için kullanılır
- SSM1Stuart Equipment, Birleşik Krallık
Poli-L-ornitin çözeltisiSigma-AldrichP4957İn vitro nöral hücrelerin bağlanmasını ve büyümesini destekler
Poli-D-lizin hidrobromürSigma-AldrichP7405İn vitro nöral hücrelerin bağlanmasını ve büyümesini destekler
PurmorfaminKÖK HÜCRE Teknolojileri72204DA nöron farklılaşmasını teşvik eder
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Konfokal görüntü
için lamel montajıPBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Çeşitli yıkama için kullanılır
Rekombinant İnsan / Fare FGF-8b Protein R& D Systems423-F8-025 / CFDA nöron farklılaşmasını teşvik eder
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNöral İndüksiyon Orta bileşen
StemPro Nöral TakviyesiThermo Fisher ScientificA10508-01NSC kültürü için ek
TrypLE Express EnzimThermo Fisher Scientific12604013Hücre ayrışma reaktifi
TransferrinRoche652202CDM bileşeni
TRITON X-100VWR International9002-93-1İmmün boyama deneylerinde hücre geçirgenliği için kullanılır
TMREAbcamab113852Mitokondriyal membran potansiyel boyama için kullanılır
Su Banyosu Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Hibe Aletleri HibeEnstrümanları, ABD
Alexa Fluor 488 Birincil Antikor Alexa Fluor 488 RRID: AB_628381 için bazal ortam Bilimsel Takviyesi kültürü için Bilimsel GDNF için 35050061 Supplement için bazal ortam Tampon Orbital çalkalayıcıları

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304(2021).
  3. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146(2020).
  4. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
  5. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  6. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583(2019).
  7. Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311(2019).
  8. Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
  9. Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449(2020).
  10. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337(2021).
  11. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  12. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  13. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
  15. Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400(2019).
  16. Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
  17. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  18. Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
  19. Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
  20. Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
  21. Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryMitochondrial ParametersInduced Pluripotent Stem CellsNeural DerivativesGlial DerivativesMitochondrial Membrane PotentialReactive Oxygen SpeciesMitochondrial VolumeMitochondrial DNA CopyMitochondrial Respiratory Chain

Related Articles