Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması

3.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63130

⸱

1 Nisan 2022

 , 
1Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopaedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, The University of Oxford

Bu makalede

Özet

Burada Boncuk Destekli Lipid Bilayers kullanılarak sentetik antijen sunan hücrelerin adım adım yeniden uzlaştırılması ve aktif T hücrelerinden sinaptik çıkışı sorgulamak için kullanımları için protokolü sunuyoruz.

Özet

Antijen sunan hücreler (APC'ler) fiziksel temas halinde olan T hücrelerine üç aktive edici sinyal sunar: 1) antijen, 2) costimülasyon / corepression ve 3) çözünür sitokinler. T hücreleri aktivasyona yanıt olarak iki tür efektör parçacık salgılar: hücrelerarası habercileri aktaran ve sitotoksikliğe aracılık eden trans-sinaptik veziküller (tSV' ler) ve supramoleküler saldırı parçacıkları. Bu varlıklar, T hücreleriyle fiziksel temas halinde olan APC'ler tarafından hızla içselleştirilir ve karakterizasyonlarını korkutucu hale getirir. Bu makale, bu trans-sinaptik parçacıkları yakalamak ve analiz etmek için boncuk destekli Lipid Bilayer'leri (BSLB' ler) antijen sunan hücre (APC) mimetikleri olarak imal etmek ve kullanmak için protokol sunmaktadır. Ayrıca, hücre yüzeylerindeki protein yoğunluklarının mutlak ölçümleri, BSLB'lerin bu fizyolojik düzeylerle yeniden uzlaştırılması ve T hücreleri tarafından sinaptik parçacık salınımını izlemek için akış sitometri prosedürü için protokoller açıklanmıştır. Bu protokol, yardımcı T hücreleri, sitotoksik T lenfositleri, düzenleyici T hücreleri ve kimerik antijen reseptör ifade eden T hücreleri (CART) dahil olmak üzere, bireysel proteinlerin, karmaşık ligand karışımlarının, patojen virülans belirleyicilerinin ve ilaçların T hücrelerinin efektör çıkışı üzerindeki etkilerini incelemek için uyarlanabilir.

Giriş

İmmünolojik sinaps (IS), jukstracrine bilgilerinin düzenlenmiş alışverişini kolaylaştıran fiziksel temasla uğraşan hücrelerin arayüzünde oluşan önemli bir moleküler yapıdır. Literatürde farklı IS'ler tanımlanmıştır ve giderek büyüyen bir kanıt kütlesi, bu moleküler merkezlerin hücresel ağların korunmuş bir özelliği olduğunu göstermektedir. B hücreleri, doğal öldürücü hücreler, dendritik hücreler, makrofajlar ve T hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli bağışıklık hücreleri, kısa ömürlü kontakların montajı yoluyla bilgi alışverişinde bulunur1. Multimomik çalışmalar, patojenik hücresel ağları yönlendiren lökositlerin ve stromal hücrelerin yeni alt kümelerinin anlaşılmasını ve bilinmeyen işlevlere sahip yüzey proteinlerini ifade etmeyi ilerletmektedir. Sentetik APC'ler olarak BSLB'ler, tek tek proteinlerin aktif sinyallerin, yani antijenlerin ve costimülasyon/corepression'un T hücreleri tarafından entegrasyonundaki fonksiyonel rolünün doğrudan araştırılmasına ve sonuç olarak sinyal dört olarak adlandırılan efektör parçacıkların salınmasına izin verir.

Bu makalede, model APC'lerin yüzey bileşimini taklit etmek için BSLB'leri kullanırken dikkate alınması gereken protokoller ve kritik teknik noktalar açıklanmaktadır. APC'ler üzerindeki bağışıklık reseptörlerinin ve diğer yüzey proteinlerinin nicel ölçümüne ilişkin protokoller, bu ölçülen miktarları içeren sentetik APC'lerin yeniden uzlaştırılması protokolü ile birlikte sunulmaktadır. Daha sonra, T hücrelerinin ve BSLB'nin birlikte kullanılması için gereken adımlar, akış sitometrisi kullanılarak trans-sinaptik parçacık transferinin nicel ölçümü için protokol ile birlikte sunulur. En dikkat çekici şekilde, BSLB'ler sinaptik ektozomlar (SE) olarak adlandırdığı plazma membran türevi bir tSV popülasyonunu incelemeyi kolaylaştırır. T hücre antijen reseptörü ile zenginleştirilmiş (TCR+) SE'ler TCR tetiklemesine yanıt olarak dökülür2 ve BSLBs3 tarafından verimli bir şekilde yakalanır, antijenlerin ve modellenmiş membran bileşiminin agonistik özelliklerini değerlendirmek için mükemmel bir okuma temsil eder. CD63+ eksozomlar ve supramoleküler atak parçacıkları (SMAP' ler) da uyarılmış T hücreleri tarafından salınır ve BSLB'ler tarafından yakalanır. Aktivasyonun ek okumaları ve T hücreleri tarafından elde edilen ekzosit ve litik granül salgılanması olarak kullanılabilirler. Ekzosit veziküllerinin T hücresinin etkileşim kutbuna harekete geçirilmesi, aktivasyona yanıt olarak IL-2, IFN-γ ve IL-10 gibi sitokinlerin yönlü salınımını da kolaylaştırır4,5,6,7,8. T hücreli salınan sitokinler BSLB'lerde de tespit edilebilse de, immünolojik sinapsta sitokin salınımının nicel analizini doğrulamak için şu anda daha özel bir çalışma geliştirilmektedir.

Spesifik membran bileşimlerinin T hücrelerinin sinaptik çıkışını nasıl etkilediğini sorgulamak için hedef membran bileşeninin fizyolojik yoğunluğunun tanımlanması gerekir. Hücre yüzeyi proteinlerinin akış sitometrisi bazlı nicelikleri bu protokolde önemli bir adımdır ve şunları gerektirir: 1) antikor başına bilinen florokrom sayısına sahip antikorların kullanımı (F/P) ve 2) ölçülen ortalama floresan yoğunluklarından (MFI' ler) florokrom moleküllerinin enterpolasyonunun standart bir referansı olan kıyaslama boncuklarının kullanılması.

Bu kıyaslama standartları, her biri keyfi floresan algılamanın dinamik aralığını kapsayan, giderek artan sayıda eşdeğer çözünür florokrom (MESF) içeren beş boncuk popülasyonudur. Bu standart popülasyonlar ayrı floresan zirveleri verir ve basit doğrusal regresyon ile keyfi floresan birimlerinin MESF'lere dönüştürülmesini kolaylaştırır. Elde eden MOF'lar daha sonra hücre başına ortalama bağlı molekül sayısını (veya sonraki adımlarda BSLB'yi) hesaplamak için antikor F/P değerleriyle birlikte kullanılır. Tahmini hücre yüzey alanlarının tespit edilen moleküllerin ortalama sayısına uygulanması, fizyolojik yoğunlukların molekül/μm2 olarak hesaplanmasını sağlar. Bu niceleme protokolü ayrıca T hücreleri üzerindeki protein yoğunluklarının ölçümüne ve homotipik T hücre sinapslarının oluşumuna aracılık eden membran bileşimlerinin biyokimyasal olarak yeniden oluşturulmasına (yani T-T sinapsları9) uyarlanabilir. Gerekirse, molekül başına bilinen florokrom sayısı ile etiketlenmiş rekombinant hedefler kullanılarak antikor bağlamanın valency'si daha da tahmin edilebilir. Daha sonra, antikor bağlayıcı valency, bağlı floresan proteinlerin ve nicelik antikorlarının sayısı (iki farklı nicelik florokromu ve MESF standardı kullanılarak) aynı anda karşılaştırılarak aynı BSLB popülasyonu için hesaplanabilir.

APC membranlarının yeniden uzlaştırılması, desteklenen lipid bilayerlerinin (SLB' ler) silika boncuklar üzerinde birleşmesini gerektirir1. Farklı fosfolipid türleri içeren lipozom stokları, çok yönlü bir lipid-bilayer matrisi oluşturmak için kullanılabilir ve rekombinant proteinlerin farklı bağlayıcı kimya ile tutturulmasını sağlar (lipozomların hazırlanması 10'da ayrıntılıdır). İlgili ligandın fizyolojik yoğunluğu (veya yoğunlukları" "hücreler üzerinde" tanımlandıktan sonra, aynı akış sitometri protokolü, BSLB'leri hedef fizyolojik yoğunlukla kaplamak için gereken rekombinant protein konsantrasyonu tahmin etmek için uyarlanır. İki farklı ankraj sistemi kombinasyon halinde veya ayrı ayrı kullanılabilir.

İlk olarak, Ni2+içeren fosfolipidlerin son 12,5 mol'unu içeren SLB, kare mikron10 başına yaklaşık 10.000 His-tag bağlama bölgesi sağlamak için yeterlidir ve BSLB'leri fizyolojik yoğunlukları bu maksimum yükleme kapasitesini aşmayan ticari olarak mevcut proteinlerin çoğuyla süslemek için iyi çalışır. İkinci yükleme sistemi, biyotinilasyonlu anti-CD3e Fab'ı (veya HLA/MHC monomerlerini) streptavidin köprüleri üzerinden yüklemek için biyotin içeren fosfolipidlerden (mol% olarak) yararlanır. Bu iki BSLB dekorasyon yönteminin kombinasyonu daha sonra BSLB'lerin sentetik APC'ler olarak esnek bir şekilde uyarlandırını sağlar. Son derece karmaşık APC yüzey bileşimleri için, fosfolipidlerin ve proteinlerin mol% 'i, eldeki sorunun gerektirdiği kadar protein yüklemek için artırılabilir. Proteinlerin çalışma konsantrasyonları ve biyotinillenmiş fosfolipidlerin mol% 'i tanımlandıktan sonra, BSLB'ler çokparametrik akış sitometrisi ile T hücrelerinin sinaptik çıkışını sorgulamak için monte edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre yüzeyi protein yoğunluklarının nicel akış sitometrisi ile ölçülması

  1. Steril fosfat tamponlu saline (PBS), pH 7.4'e EDTA (son 2 mM konsantrasyonuna) ve insan AB serumu (son %10'a) ekleyerek 0,22 μm filtreli insan akış sitometri tamponu (hFCB) hazırlayın (bkz. Tablo 1). Serum safsızlıklarını gidermek ve 4 °C'de saklamak için çözeltiyi 0,22 μm gözenek filtre ünitesi kullanarak filtreleyin.
  2. Hücreleri kurtarın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleme ile tortulayın.
  3. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Her yıkama adımında, PBS'deki hücreleri orijinal hacme (santrifüjlemeden önce) yeniden biriktirin ve RT'de 5 dakika boyunca 300 × g'da aşağı doğru döndürün.
  4. Hemositometrede trypan mavi lekeli hücre süspansiyonlarını sayın11. Alternatif olarak, elektrik akımı hariç tutma kullanarak hücreleri sayın. İkincisi için CASY-TT üreticisinin talimatlarına uyun (Bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: CASY-TT hücre sayacı, yüzde uygulanabilir hücrelerin, hücre boyutunun ve hücre hacminin belirlenmesini sağlar.
  5. Hücreleri 107 hücre/mL boyama konsantrasyonuna yeniden canlandırmak için gereken 1:1.000 SabitlenebilirLik Boyası eFluor 780 veya benzeri bir seyreltme içeren PBS hacmini hesaplayın (Bkz. Malzeme Tablosu).
  6. Canlı boya-PBS çözeltisini kullanarak hücreleri yeniden kullanın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  7. Bir hacim buz gibi hFCB ekleyerek canlılık boyasını çıkarın. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da aşağı doğru döndürün.
    NOT: Bundan sonra soğuk zinciri kesintisiz tutun.
  8. Hücreleri Fc Reseptör Engelleme Çözeltisinin 1:50 seyreltilmesini içeren hFCB ile yıkayın (bkz. Malzeme Tablosu). Hacmi 107 hücre/mL'lik son konsantrasyona getirin ve etkili FcgR engellemesi elde etmek için 15 dakika daha kuluçkaya yatırın.
  9. U-bottom veya V-bottom 96-well plakasının kuyusu başına 100 μL hücre süspansiyonu (yani 106 hücre) dağıtın. Hücreleri buzda tutun ve ışıktan koruyun (alüminyum Folyo ile örtün).
  10. Her florokrom konjuge antikor için ve en önemlisi yüzey protein yoğunluklarını belirlemek için kullanılan antikorlar için en uygun antikor konsantrasyonlarını tanımlayarak hFCB'de bir antikor ana karışımı hazırlayın. Örneğin, bademcik hücre popülasyonları üzerinde ICAM-1 ekspresyonunun nicelleştirilmesi için, Şekil 1'de gösterildiği gibi, antikor başına bilinen AF647 florokromlarına sahip bir anti-ICAM-1 antikorunun doygunluk konsantrasyonları ile birlikte 1:200 anti-CD4, anti-CD19 ve anti-CXCR5 seyreltmeleri içeren bir karışım hazırlayın (yani, bağımsız antikor titrasyon deneyleri ile tanımlanan 10 μg/mL).
  11. Ek kontroller olarak, ilgili antikor izotip kontrollerini içeren bir antikor ana karışımı hazırlayın (arka plan çıkarma için aynı florokromlarla konjuge edilen benzerleriyle aynı etkili konsantrasyonlarda ), yani ilgili bir AF647 izotip kontrolünün 10 μg/mL'sini kullanın.
    NOT: Yukarıdaki örnekte, hücrelerdeki gerçek ICAM-1 sinyalinden arka plan floresanını çıkarmak için böyle bir izotip kontrolü kullanılır.
  12. Dokularda düşük frekanslarda bulunan hücre alt kümelerindeki protein yoğunluklarını ölçerken, ilgi çekici belirteçler dışındaki tüm boyama antikorlarını içeren floresan eksi bir (FMO) kontrolleri hazırlayın ( 12'deki diğer ayrıntılara bakın).
  13. 300 × g'daki hücreleri içeren 96 kuyu plakasını 4 °C'de 5 dakika boyunca aşağı çevirin, süpernatant atın ve hücreleri nicelik antikor ana karışımının veya izotip antikor ana karışımının 50 μL'sinde yeniden biriktirin.
  14. Bir plaka çalkalayıcı kullanarak hücreleri 4 °C ve 400 rpm'de en az 30 dakika kuluçkaya yatırın. Plakaları ışıktan koruyun (alüminyum folyo ile örtün).
  15. Hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da hFCB ve santrifüj kullanarak üç kez yıkayın.
  16. Hücre peletini 200 μL PBS kullanarak yeniden biriktirin (yani, 5 × 106 hücre/mL'lik son konsantrasyona).
  17. Satın alma için:
    1. Standart bir BD FACS Yükleyici kullanıyorsanız, numuneleri 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplere aktarın (Bkz. Malzeme Tablosu).
    2. Yüksek aktarım hızı örnekleyicileri (plaka okuyucuları olarak da adlandırılır) kullanıyorsanız, hemen 1.19 adımına geçin.
  18. MESF standartları için veri toplama işlemine geçmeden önce, nicelik kanalları için floresan yoğunluğu doğrusallığı maksimum ve minimum sınırları kontrol edin.
  19. Telafiden önce, MESF standartları için veri alın ve hem en loş hem de en parlak popülasyonların doğrusal ölçüm aralığına düşmesini sağlayın.
  20. Tazminat örneklerini alın. Dinamik algılama aralığını korumak için nicelik kanallarının fotomultiplier boru (PMT) voltaj değerlerini değiştirmeden saklayın. Telafi matrislerini hesaplamadan önce diğer kanalların PMT voltajında hafif ayarlamalar yapın.
  21. Tazminatı hesaplayın ve uygulayın.
  22. Nicelik kanallarının her biri için en az 2 × 104 toplam MESF boncuk alın ve kaydedin.
  23. Şekil 1A 'da (i)'de gösterildiği gibi, yan ve ileri ışık saçılma alanlarına (sırasıyla SSC-A ve FSC-A) göre tek hücre popülasyonu seçin, ardından zaman sürekliliği içindeki olayların seçimi (Şekil 1A (ii)) ve yüksekliklerine kıyasla hem FSC hem de SSC'de uçuş süresi (W) için düşük (W) FSC-W/FSC-H, ardından sırasıyla Şekil 1A (iii) ve (iv) 'de gösterildiği gibi SSC-W/SSC-H gating. FSC-A ile FSC-H dağılımı arasındaki olayları içeren son bir tek olay kapısı tanımlayın (Şekil 1A (v)).
  24. Kontrol örnekleri alın (İzotip etiketli ve FMO kontrolleri).
  25. En az 10.000 hedef hücre elde edilene kadar numune alın ve kaydedin.
    NOT: Ortalama moleküler yoğunlukların sağlam bir şekilde belirlenmesi, bağımsız deneylerde birkaç donörun analizini gerektirir. Bu, azaltılmış frekanslarda bulunan veya kıt biyolojik malzemeden (örneğin, insan doku biyopsilerinden) elde edilen hücre alt kümelerini analiz ederken çok önemlidir.
  26. Aleti kapatmadan önce 5 dakika boyunca çalışan sitometreyi bir FACS temizleme çözeltisi ve ardından 5 dakika ultra saf su ile yıkayın. HTS kullanıyorsanız, HTS ve Temiz Plaka programı altındaki seçenekleri izleyin.
    NOT: Numuneden numuneye taşımayı azaltmak için sit (sampler) yıkama veya yüksek verimli örnekleyici yıkama seçeneklerini etkinleştirin, bu da sitometreyi tüpler veya kuyular arasında otomatik olarak yıkar. Satın almaya başlamadan önce, yıkanmamış biyolojik kirleticileri sitometre numune hattından çıkarmak için yüksek debide 10 dakika ultra saf su çalıştırın.
  27. Akış Sitometri Standardı (FCS) dosyalarını dışa aktarın.

2. MESF aşırı düzeltilmiş ortalama (veya ortanca) floresan yoğunluğu (MFI) regresyon analizleri

  1. Akış sitometri analiz yazılımını açın ve deneme FCS dosyalarını yükleyin. Şekil 1A'da (i) gösterildiği gibi, boncuk popülasyonlarını yanlarına ve ileri ışık saçılma alanlarına (SSC-A ve FSC-A) göre seçin.
  2. Adım 1.24'te belirtildiği gibi, zaman içinde tek olayların dağılımını denetleyerek veri kalitesini kontrol edin.
    NOT: Kabarcıklar, olayların zaman içinde dağılımında boşluklar oluşturur; bu genellikle HTS kullanılarak edinmenin başlangıcında görünür. Optik sapmalar nedeniyle ölçüm hataları ekledikçe, edinme süresindeki boşlukları kuşatan olayları seçmekten kaçının.
  3. Tek olaylara odaklanın.
    1. Hücre
      1. Tek hücreleri önce SSC-A ve FSC-A dağılımlarına göre tanımlayın (Şekil 1A (i)), ardından sıralı kapılarda W için düşük olaylar FSC-W/FSC-H (singlets-1, Şekil 1A paneli (iii)) ve SSC-W/SSC-H (singlets-2; Şekil 1A panel (iv)). Orantılı FSC-A ve FSC-H (Şekil 1A, panel (v)) içeren olayları seçerek ek bir singlets-3 kapısı tanımlayın. Son olarak, canlı hücreleri sabitlenebilir canlılık boyası için negatif hücreler olarak tanımlayın.
    2. MESF boncukları
      1. 2.3.1.1 adımında olduğu gibi singlets-1'den singlets-3 ayrımcılığına (Şekil 1B, paneller (i) ila (v)) aynı singlet'ları izleyin. MESF popülasyonlarının her birini (boş, 1, 2, 3 ve 4) floresan yoğunluk düzeylerine göre tanımlayın (bkz. Şekil 1B, panel (vi)).
  4. MESF kesirlerinin MFI'sını boş ve 1'den 4'e çıkarın.
  5. Boş boncuk popülasyonunun MFI'lerini her kesirden çıkararak 1 ile 4 arasında MESF kesirleri için düzeltilmiş MFI (cMFI) değerleri oluşturun.
  6. cMFI'ler ile satıcı tarafından sağlanan MESF değerleri arasındaki ilişki için en uygun satırı hesaplayın (bağımsız değişken, sıfıra eşit kesir boştur).
  7. MESF'in cMFI üzerindeki doğrusal regresyonunun eğimini (aşağıdaki denklemde b ) ayıklayın (Şekil 1B paneli (viii), y = a + bx; a = 0 ile bir gerileme gösterir).
  8. Ortanca (bimodal floresan dağılımları için) veya ortalama (normal veya günlük-normal floresan dağılımları için) floresan yoğunluklarını ilgi popülasyonlarından çıkarın ( Şekil 1A panelinde (vii)'deki TFH ve B hücreleri).
  9. 2.5-2.7 adımlarında olduğu gibi, MFI değerlerini izotip etiketli kontrol hücrelerinden çıkarın.
  10. İzotip kontrollerinin F/P'si nicelik antikorları ile aynıysa, MMI'leri İzotip etiketli hücrelerden çıkararak lekeli hücrelerin MBI'lerini düzeltin.
  11. İzotiplerin F/P'si nicelik antikorlarından farklıysa, izotip etiketli hücrelerin MMI'lerini adım 2.7'de hesaplanan eğimle bölerek MESF'yi izotiplerden çıkarın. İlişkili nicellik antikorlarını tahmin etmeden önce Izotip MESF'i nicelik MESF'sinden çıkarın.
  12. Hücre başına bağlı molekül sayısını tahmin etmek için MESF'yi nicelik antikorlarının F/P'sine bölün (Molec. Şekil 1C'nin akış diyagramında gösterildiği gibi hücre).
  13. Proteinlerin yoğunluğunu molec./μm2 (Şekil 1C) olarak çıkarmak için bağlı moleküllerin sayısını tahmini hücre yüzey alanına (CSA (μm2)) bölün. Daha fazla ayrıntı için temsili sonuçlar bölümüne bakın.

3. BSLB'leri kaplayan proteinlerin kalibrasyonunda kullanılacak fonksiyonel fosfolipid türleri

  1. Desteklenen lipid bilayerini oluşturan lipid matrisinin ana bileşeni olarak 0,4 mM DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-fosfokolin) kullanın. Bu DOPC çözeltisinde diğer tüm lipit türlerini seyreltin.
  2. 0,4 mM DOPE'un (1,2-Dioleoyl-sn-glisero-3-fosephoethanolamine) 0,2 ila 1 mol%'unu, IÇ floresanlı BSLB'ler oluşturmak için ATTO 390, 488 veya 565 ( Bkz. Malzeme Tablosu) dahil olmak üzere boyalara eşleştirilmiş olarak kullanın.
    NOT: BSLB'lerin iç floresan, sinaptik transfer deneylerinde tek BSLB'lerin ve tek hücrelerin tanımlanmasını kolaylaştırır.
  3. His etiketli proteinleri tutturmak için 0,4 mM DGS-NTA(Ni) (1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-[(N-(5-amino-1-karboksipentil) iminodiasetik asit) süksinil]) %12,5 mol kullanın. DGS-NTA(Ni)'nin mol%'unu sabit tutun ve en yüksek konsantrasyon olarak 100 nM ile başlayan His etiketli proteinlerin 2 kat titrasyonunu gerçekleştirin. Mutlak nicelikler için negatif kontrol olarak proteinsiz bir durum bırakın.
    NOT: Aksesuar sinyalleri ve ICAM-1 gibi yapışma molekülleri, DGS-NTA(Ni) için proteinin benzeşimini artırmak için 12-His etiketi ile tasarlanmıştır.
  4. Biyotintinli proteinleri biotin-streptavidin-biotin köprüleri üzerinden tutturmak için Biotinyl Cap PE (1,2-dioleoyl-sn-glicero-3-fosfothoethanolamine-N-(kapak biyotinil)) kullanın. %10 mol ile %0 mol (negatif kontrol olarak) arasında 0,4 mM Biyotinil Kapak PE kapsayan 5 katlı seri titrasyon kullanın. Streptavidin ve biyotinilasyonlu proteinlerin konsantrasyonunu hem kalibrasyon deneylerinde hem de sinaptik transfer deneyleri için sentetik APC'lerin yeniden uzlaştırılmasında sabit tutun (200 nM).
    NOT: Lipid matrisinde Biotinyl Cap PE'nin son mol'u üzerinde biyotinillenmiş proteinlerin ampirik yoğunluklarının regresyon analizleri (ayrıca Onun etiketli proteinlerini tutturmak için DGS-NTA(Ni) içerir) antijenin hedef yoğunluklarını yeniden inşa etmek için kullanılacak mol% 'u tanımlayacaktır.

4. % 1 serum albümin içeren takviyeli HEPES tamponlu salin hazırlanması

NOT: BSLB'lerin yıkama ve protein yükleme adımlarında %1 insan serum albümini (HBS/HSA) veya %1 sığır serum albümini (HBS/BSA) içeren hepes tamponlu salin gereklidir (Tablo 1). 10x HBS stok çözeltisi ve çalışma tamponunu mümkün olduğunca taze hazırlayın; soğutmaya devam edin ve bir ay içinde kullanın. BSA, HSA'ya daha ucuz bir alternatif olsa da, Ni-şelat lipidlerinin verimli bir şekilde tıkanmasını sağlar13 ve yüksek verimli deneyler için önerilir.

  1. 200 mM HEPES, 7 mM Na2HPO4, 1400 mM NaCl, 50 mM KCl, 60 mM glikoz, 10 mM CaCl2 ve 20 mM MgCl2 içeren 10x stok tampon çözeltisi hazırlayın.
    NOT: MgCl2'yi çözmek oldukça eksotermiktir ve yanık tehlikesidir. Bu tuzu yavaşça ve büyük miktarda çözücüye ekleyin. Bu tuzların konsantre çözeltilerini (yani 1 M) hazırlamaktan kaçının, çünkü zaman içinde çökelme eğilimindedirler, bu da çalışma tamponuna kesin katkılarını zorlaştırır.
  2. 10x çözeltiyi 0,22 μm filtre ünitesi kullanarak filtreleyin ve 4 °C'de steril tutun.
  3. 500 mL HBS/ has için, takviye edilen 10x HBS çözeltisinin 50 mL'sini alın, gerekirse pH'ı 7,4'e ayarlayın ve ultra saf su ile hacmi 483,4 mL'ye ayarlayın.
  4. 483,4 mL HBS, pH 7,4'e 16,6 mL%30 HSA çözeltisi ekleyin.
  5. 500 mL HBS/BSA için, HBS'de 5 g BSA çözün ve 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yanın. Daha sonra, görünür protein kristalleri veya kümeler görünmeyene kadar şişeyi periyodik olarak ters çevirerek RT'de hafifçe karıştırın.
  6. Elde edilen çözeltiyi 0,22 μm filtre ünitesi kullanarak adım 4,5'ten filtreleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 4 °C'de saklayın.

5. BSLB'lerde protein yoğunluğu kalibrasyonları

  1. 5.00 ±0.05 μm çapında işlevsel olmayan silika boncuklarını almadan önce, stok çözeltisini iyice karıştırın ve şişelerin dibine çökelmiş büyük boncuk yığınlarını yeniden depolayın.
    NOT: Silika boncukları hızlı bir şekilde çökelme eğilimindedir, bu da sayma hatalarına neden olabilir. Bir P1000 mikropipette maksimum hacminin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyarak kuvvetlice karıştırın.
  2. 1.000 μL PBS'de 1 μL boncuk çözeltisini seyreltin, boncukları bir hemositometre odası kullanarak sayın ve mL başına konsantrasyonlarını hesaplayın.
    NOT: Silika boncuklarını görselleştirmek için trypan mavisi boyamaya gerek yoktur.
  3. Titrasyon noktası başına 5 × 105 nihai BSLB için gereken silika boncuklarının hacmini hesaplayın.
  4. Gerekli miktarda silika boncukları steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  5. Silika boncuklarını 1 mL steril PBS ile üç kez yıkayın, rt'de (sabit rpm'de) bir tezgah üstü mikrosantrifüjde boncukları 15 sn sn santrifüj haline alın.
    NOT: Yıkama sokunu çıkarırken boncuk peletini rahatsız etmekten kaçının. Küçük bir tampon kolon, lipozom ana karışımını oluşturan lipozomların yayılmasını etkilemez, çünkü bunlar PBS'de de vardır.
  6. BSLB'yi yıkanmış silika boncuklarına monte etmek için üç hacim liposome master karışımı hazırlayın (örneğin, silika boncuklarının ilk toplam hacmi 20 μL ise, lipozom ana karışımının en az 60 μL'lik bir kısmını hazırlayın).
  7. Biotinyl Cap PE mol% titrasyonları için
    1. Biotinyl Cap PE'nin 5 kat seyreltmelerini içeren lipid ana karışımlarını hazırlayın.
      1. 0.4 mM Biotinyl Cap PE mol%'u %100 DOPC matrisinde seyreltin.
      2. Her Biotinyl Cap PE mol% titrasyon noktasını 1:1 (vol:vol) oranında 0.4 mM% 25 DGS-NTA (Ni) çözeltisi ile karıştırın, böylece Ni içeren lipitlerin son% 12.5'i tüm titrasyonlarda bulunur.
        NOT: Ni içeren lipitlerin %12,5'i (vol:vol%), BSLB'lerin karışık lipit bileşimini temsil eder ve bu da Onun etiketli proteinlerinin paralel kalibrasyonlarda test edilebilir. Örneğin, tüm lipozom stokları aynı azı dişi konsantrasyonunda hazırlandığından, 200 μL nihai lipozom karışımında hedef mol% karışımına ulaşmak için, Ni içeren DGS-NTA'nın% 25'inin 100 μL'sini 100 mol% DOPC ile karıştırın.
    2. 5 × 105 yıkanmış silika boncukları 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere aktarın, böylece tüp başına bir Biotinyl Cap PE mol% titrasyon noktası monte edilir.
    3. Yıkanmış silika boncuklara Biotinyl Cap PE mol% titrasyon ana karışımlarını ekleyin ve toplam hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hafifçe karıştırın. Lipid bilayer'i fazla miktarda tahrip eden kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
    4. Havayı yerinden etmek ve lipitleri karıştırma sırasında oksidasyondan korumak için şimdi oluşturan BSLB'leri içeren tüpe Argon (veya Azot) gazı ekleyin.
    5. Argon'ı depolamadan önce 0,4 mM lipit stoklarına ekleyin ve steril bir teknik kullanarak manipüle edin.
      NOT: Argon/Nitrojen gaz silindirine küçük bir boru bağlayın. Tüplere gaz eklemeden önce, gaz silindiri regülatörünü basıncın 2 psi'den yüksek olmayacak şekilde ayarlayın. Sıvılaşma stoğunun içindeki gaz akışını 5 sn'ye yönlendirmek için steril bir pipet ucunu çıkış borusuna bağlayın ve kapağı hızla kapatın. Lipit stokları durumunda, 4 ° C'de saklamadan önce tüpün kapağını parafin filmi ile kapatın.
    6. BSLB'leri dikey, değişken açılı bir laboratuvar mikserine taşıyın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 10 rpm'lik bir yörüngesel karıştırma kullanarak RT'de 30 dakika karıştırın.
      NOT: Bu adım, desteklenen lipid bilayer oluşumu sırasında boncukların çökeltisini önleyecektir.
    7. Bir tezgah üstü minicentrifuge üzerinde RT'de 15 sn santrifüjleme yaparak boncukları aşağı çevirin ve ardından fazla lipozomları gidermek için 1 mL HBS / HSA (BSA) ile üç kez yıkayın.
    8. NTA sahalarını doyurmak için 100 μM NiSO4 içeren 1 mL%5 kazein veya %5 BSA ve BSLB'lerdeki tüm biyotin-ankraj alanlarını düzgün bir şekilde kaplamak için 200 nM streptavidin ekleyerek oluşan BSLB'leri engelleyin. Toplam hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetle çevirerek hafifçe karıştırın ve rt ve 10 rpm'de 20 dakikadan daha uzun olmayan dikey karıştırıcıda kuluçkaya yatırın.
    9. BSLB'leri bir tezgah üstü minimerrifuge üzerinde RT'de 15 sn santrifüjle aşağı çevirin ve ardından 1 mL HBS/HSA (BSA) tamponu ile üç kez yıkayın.
      NOT: BSLB'leri kaplayan az miktarda yıkama tamponu ile yıkanmış boncukları dikey olarak tutun.
  8. DGS-(Ni) NTA içeren BSLB'lerin% 12,5'inde Etiketli proteinlerin titrasyonu için
    1. DGS-NTA(Ni)'nin son %12,5'ini içeren üç cilt lipozom ana karışımı hazırlayın.
    2. Yıkanmış silika boncuklarını yeniden depolamak için lipozom ana karışımını kullanın ve toplam hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyarak hafifçe karıştırın. Lipid bilayer'e fazla hasar veren kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.
    3. Havayı yerinden etmek ve lipitleri karıştırma sırasında oksidasyondan korumak için şimdi oluşturan BSLB'leri içeren tüpe Argon (veya Azot) gazı ekleyin.
    4. Argon'ı depolamadan önce 0,4 mM lipit stoklarına ekleyin ve steril bir teknik kullanarak manipüle edin.
    5. BSLB'leri dikey karıştırıcıya taşıyın ve 10 rpm'de yörüngesel karıştırma kullanarak RT'de 30 dakika karıştırın.
    6. Bir tezgah üstü minicentrifuge üzerinde RT'de 15 sn santrifüjleme yaparak boncukları aşağı çevirin ve ardından fazla lipozomları gidermek için 1 mL HBS / HSA (BSA) ile üç kez yıkayın.
    7. BSLB'lerdeki NTA sitelerini doyurmak için 100 μM NiSO4 içeren 1 mL%5 kazein (veya% 5 BSA) ekleyerek oluşan BSLB'leri engelleyin.
    8. Fazla engelleme solüsyonını çıkarmak için HBS/HSA (BSA) kullanarak üç kez yıkayın.
    9. Yeni bir U-bottom 96-well plakasında proteinlerin 2 kat seri seyreltmelerini hazırlayın.
      1. Toplam 200 μL HBS/HSA (BSA) tampon hacminde ilgi alanı proteini için 100 nM başlangıç konsantrasyonu hazırlayın, bu çözeltinin 100 μL'lik kısmını ilk sütuna dağıtın ve kalan 100 μL'yi 100 μL HBS/HSA (BSA) tampon içeren #2 sütununun üzerine dağıtın.
      2. 100 μL'yi 2 numaralı sütundan #3 sütununa seri olarak aktararak devam edin ve tüm titrasyon noktalarını kapsayacak şekilde gerektiği gibi tekrarlayın. Serinin son sütununu proteinsiz bırakın, çünkü bu nicelik için boş referans olarak kullanılacaktır.
    10. Hazırlanan BSLB'leri 100 μL HBS/HSA (BSA) tamponunda 5 × 105 BSLB içerecek şekilde yeniden diriltin.
    11. BSLB süspansiyonunun 100 μL'sini ikinci bir U-bottom 96 kuyu plakasının kuyularına aktarın, böylece her biri 5 × 105 BSLB alır.
    12. BSLB'leri içeren ikinci plakayı 300 × g ve RT'de 2 dakika döndürün ve süpernatant atın.
    13. 100 μL hacimleri protein titrasyon plakasından çökelmiş BSLB'leri içeren tabağa aktarın. Alüminyum folyo ile ışıktan koruyun.
    14. RT'de 2 dakika boyunca 300 × g çökeltme adımları kullanarak plakayı HBS/HSA (BSA) tamponu ile üç kez yıkayın.
    15. Kalibrasyonda kullanılan rekombinant protein doğrudan florokromlara eşlenmişse ve bilinen F/P değerlerine sahipse, 5.8.20 adımına geçin.
    16. Kalibrasyonda kullanılan rekombinant protein etiketlenmemişse veya florokromlara eşlenmişse veya MESF boncuk standardı mevcut değilse, protein kaplı BSLB'yi lekelamak için bilinen F/P değerlerine sahip Alexa Fluor 488 veya 647 konjuge antikorları kullanın.
    17. Nicelik antikorlarının doygunluk konsantrasyonları ile leke.
      NOT: Hedef ifade düzeyine bağlı olarak, bunlar 5 ila 10 μg /mL arasındadır.
    18. RT'de 30 dakika ve plaka çalkalayıcı kullanarak 1.000 rpm leke. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun.
    19. HBS/HSA (BSA) tamponu ile iki kez ve PBS ile bir kez RT'de 2 dakika boyunca 300 × g'lik sedimasyon adımları kullanarak yıkayın.
      NOT: Satın almadan önce yıkanmış BSLB'leri yeniden kullanmak için PBS, pH 7.4 kullanın. Protein içeren tamponlar kullanmayın, çünkü bu, numunelerin yüksek verimli örnekleyicilerle otomatik olarak karıştırılması sırasında kabarcıkların oluşumuna yol açar.
    20. Şekil 1B'de (vii) gösterildiği gibi, en parlak tepelerin nicelik dedektörü (kanal) için doğrusal algılama aralığında kalmasını sağlayarak MESF standartlarını alın.
    21. Örnekleri el ile veya HTS kullanarak alın. İkincisini kullanıyorsanız, BSLB'leri 100 μL PBS'de yeniden diriltin ve 2,5 ila 3,0 μL/ s arasında bir akış hızı kullanarak 80 μL elde edin, 100 μL karıştırma hacmi (veya resüspensyon hacmi daha azsa toplam hacmin% 50'si), 150 μL / s karıştırma hızı ve BSLB'lerin monodispersed olmasını sağlamak için beş karışım.
    22. FCS dosyalarını dışa aktar.
    23. Çiftler veya üçüzler belirlemede hata getireceği için analizler için tek olaylara odaklanın (Şekil 2A). İletişim kuralı adım 1.2.3'te belirtildiği gibi tek olayların iç içe tanımlamayı kullanın.
    24. Her MESF fraksiyonunun (1-4) MFI'sını ölçün ve düzeltilmiş MFI'leri (cMFI) ayıklamak için boş boncukların MFI'sını çıkarın.
    25. 5.33. adımda kullanılacak olan MESF standartları için hesaplanan cMFI üzerinden MESF eğimini (b) ayıklamak için doğrusal bir regresyon analizi gerçekleştirin.
    26. Her titrasyon noktasının MFI'sını çıkarın ve cMFI'leri elde etmek için proteinsiz boncukların MFI'lerini çıkarın.
    27. Her titrasyon noktası için BSLB'lere bağlı MESF'yi ayıklamak için cMPI'ları adım 5.31'de hesaplanan eğimle bölün.
    28. BSLB başına bağlı ortalama molekül sayısını ayıklamak için BSLB'lere bağlı MESF'yi nicelik antikorunun F/P değerine bölün.
    29. BSLB'lerin çapını (5,00 ± 0,05 μm) kullanarak, titrasyon noktası başına proteinin (molec./μm2) son yoğunluklarını (protein konsantrasyonu) hesaplamak için boncuk yüzey alanını (SA = 4pr2) çıkarın.
    30. En uygun çizginin eğimini (b) hesaplamak için protein yoğunluğu üzerinde protein konsantrasyonunun yeni bir regresyon analizini gerçekleştirin.
      NOT: DGS-NTA(Ni)'nin %12,5'inin konsantrasyonu, T hücrelerinin spesifik olmayan aktivasyonunu teşvik etmeden veya SLB'lerin yanal hareketliliğini etkilemeden yaklaşık 10.000 molec./μm210 maksimum ankraj kapasitesi sağlar.

6. T hücreleri ve BSLB'ler arasında sinaptik transfer deneyleri yapmak

  1. Sinaptik aktarım deneyini çalıştırmadan önce
    1. Cihazın floresan spektrum etkileşimlerini tanımlamak için floresan olmayan BSLB'ler, floresan lipitli BSLB'ler, lekesiz hücreler (veya kompanzasyon boncukları; Malzeme Tablosuna bakın) ve tek renkli lekeli hücreler (veya kompanzasyon boncukları) alıp alın. Polikromatik paneli yeniden tasarlamak, hassasiyeti artırmak ve kritik dedektörlerdeki ölçüm hatasını azaltmak için yüksek dökülme yayılımı olan dedektörlere odaklanın (bkz. 14).
    2. En uygun konsantrasyonu bulmak için algılama antikorlarını titratlayarak negatiflerin algılanmasını tehlikeye atmadan pozitif olayların tespitini sağlar.
      NOT: F/P değerleri ve parlaklık toplu işlerden toplu işleme değiştiğinden, antikor lot değişikliği olduğunda bu adımı yineleyin.
    3. İsteğe bağlı: Numuneyi farklı voltaj aralıklarında (yani bir voltaj yürüyüşü) alarak PMT voltajlarını optimize ederek, gürültü üzerinde optimum sinyale yol açan PMT'leri (yani, en parlak popülasyonun sinyalinin doğrusal aralıkta kalmasını sağlarken negatiflerin ve pozitiflerin ayrılması) bulmak için optimize edin.
  2. BSLB'lere T hücre çıkış transferinin ölçümü
    1. Isı inaktive fetal sığır serumunun (FBS) %10'unu, 100 μM esansiyel olmayan amino asitleri içeren takviyeli RPMI 1640 (burada R10 ortamında) hazırlayın, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U/ml penisilin ve 100 μg/mL streptomisin. Kültür ve T hücrelerini genişletmek için R10 ortamını kullanın.
    2. 1. günde, T hücrelerini periferik kan veya lökoredüksiyon sistemi (LRS) odalarından izole edin. İnsan CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin zenginleştirilmesi için immünodensite hücre izolasyonu ve ayırma kitleri kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu).
    3. Hücreleri 1,5 ila 2,0 × 106 hücre/mL arasında değişen son konsantrasyonda, kuyu başına toplam 5 mL'den fazla olmayan 6 kuyu plakaları kullanarak tohumlayın.
    4. T hücrelerini 1:1 oranında insan T hücre aktivasyonu (anti-CD3/anti-CD28) manyetik boncuk kullanarak etkinleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve hücre çoğalmasını ve hayatta kalmasını desteklemek için 100 IU rekombinant insan IL-2 ekleyin.
    5. 3. günde, manyetik sütunlar kullanarak etkinleştirici manyetik boncukları çıkarın (Bkz. Malzeme Tablosu). Ek yıkama adımları için hücreleri kurtarmadan önce manyetik boncukların tüpün kenarlarına bağlı kalmasını sağlayın.
    6. Manyetik boncukları 5 mL taze R10 ortamı ile bir kez daha yıkayın, iyice karıştırın ve mıknatısa geri koyun. Bu birimi kurtarın ve 6.2.5 adımında kurtarılan hücrelerle karıştırın.
    7. 100 U/mL IL-2 içeren taze R10'da hücreleri 1,5-2 × 106 hücre/mL'ye yeniden biriktirin. 48 saat sonra ortamı yenile, IL-2'nin son ilavesinin deney gününden önce 48 saat olduğundan emin olun (kültürün 7 ila 14 gün).
    8. Sinaptik transfer deneyi gününde, Phenol Red-free RPMI 1640 ortamını % 10 FBS ile destekleyerek Sinaptik Transfer Tahlil ortamını hazırlayın (bkz. Tablo 1), 100 μM esansiyel olmayan amino asit, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 100 U/ml penisilin ve 100 μg/mL streptomisin. Rekombinant insan IL-2'ye yer vermiyorsunuz.
    9. Trypan mavisi boyama veya elektrik akımı hariç tutma kullanarak hücreleri sayın ve orta alanda 2,5 × 106 hücre/mL'lik son konsantrasyona yeniden harcayın. Aşırı hücre ölümü gözlenirse (%>10), polisakkarit ve sodyum diatrizoat karışımı kullanarak ölü/ölmekte olan hücreleri çıkarın ( Bkz. Malzeme Tablosu:
      1. Polisakkarit-sodyum diatrizoat çözeltisinin 13 mL'nin üzerine 15 mL hücre kültürü tabakası.
      2. Rt'de minimum hızlanma ve deacceleration ile 20 dakika boyunca 1.250 × g santrifüj. Hücre katmanını (bulut) ortam ve polisakkarit-sodyum diatrizoat çözeltisi arasındaki arayüzde toplayın.
      3. Hücreleri önceden ısıtılan Sinaptik Transfer Tahlil ortamıyla en az iki kez yıkayın (adım 6.2.7'de hazırlanmıştır).
      4. Sinaptik Transfer Tahlil ortamını kullanarak hücreleri 2,5 × 106/mL'lik son konsantrasyona sayın ve yeniden biriktirin. BSLB'ler ile bu hücre süspansiyonunun 100 μL'si ortak kültür (bkz. adım 6.2.15).
    10. Deneme için gereken BSLB sayısını hesaplayın; test edilecek tüm farklı protein ana karışımlarını ve antijen titrasyonlarını (biyotinillenmiş HLA / MHC-peptit monomerler veya monobiyotinillenmiş anti-CD3φ Fab) düşünün.
    11. Protokol bölüm 5'ten aynı adımları izleyerek BSLB'leri birleştirin, ancak bu sefer karmaşık bir APC zarını yeniden oluşturmak için gereken proteinlerin ve lipitlerin tüm titrasyonlarını birleştirin (Şekil 3A). Aynı vol'i koruyun: ilk silika boncuk hacmi ile kalibrasyonlar sırasında kullanılan protein karışımının hacmi ile BSLB'lerin yüklenmesinde kullanılan zaman ve sıcaklıklar arasındaki vol ilişkileri. Örneğin, ilk kalibrasyon için 0,5 μL silika boncuk/kuyu ve 100 μL/kuyu protein karışımı kullanılmışsa, BSLB'leri T hücreleriyle birlikte kültüre edilecek şekilde hazırlamak için 5:1.000 vol:vol oranlarını koruyun.
    12. BSLB'ler ilgi protein karışımı ile yüklendikten sonra, fazla ilişkisiz proteinleri çıkarmak için BSLB'leri HBS / HSA (BSA) ile iki kez yıkayın. Her yıkama adımında RT'de 2 dakika boyunca 300 × g çökeltme hızları kullanın ve süpernatantları atın.
    13. Kuyu başına 5 × 105 BSLB'× 200 μL'de yeniden satın.
    14. Kuyu başına 100 μL'yi, bir kopya yapmak için yeni bir U-bottom 96 kuyu plakasına aktarın, böylece kuyu başına son BSLB miktarı 2,5 × 105'tir.
    15. BSLB'leri 2 dakika ve RT için 300 × g'da döndürün ve süpernatant atın.
    16. BSLB'leri 100 μL T hücre süspansiyonu kullanarak yeniden diriltme; kabarcık oluşumunu önlemek için hafifçe karıştırın.
    17. 37 °C'de 90 dakika boyunca kokültürleri kuluçkaya yatırın.
      NOT: Alternatif olarak, hücreler ve boncuklar kokültür için Fenol-Red içermeyen RPMI yerine HBS/HSA (BSA) tamponunda yeniden kullanılabilir. Bu durumda, inkübasyon CO2 olmayan bir inkübatörde yapılmalıdır, çünkü bu gaz bikarbonat yokluğunda tamponu hızla asitleştirecektir.
    18. BSLB-T hücre kokültürlerini önce RT'deki hücreleri en az 15 dakika kuluçkaya yatırarak soğutun. Onları ışıktan koru.
    19. Hücreleri 500 × g ve RT'de 5 dakika santrifüj edin; üstnatant atın.
    20. Hücreleri blokaj için RT %2 BSA-PBS (Ca2+ ve Mg2+-free) olarak yeniden biriktirin. Hücreleri 45 dakika boyunca buza yerleştirin. Işıktan kork.
    21. Hücreleri kuluçkalarken, antikor ana karışımını PBS'de buz gibi 0,22 μm filtreli% 2 BSA kullanarak ekstra engelleme sağlayacak bir boyama tamponu olarak hazırlayın.
      NOT: Parlak Menekşe boyalarına konjuge edilen bazı antikor partileri, spesifik olmayan bir şekilde BSLB'lere bağlanma eğilimindedir. %5 BSA-PBS ile engelleme, bu gürültüyü azaltmaya yardımcı olur. Şu andan itibaren, soğuk zinciri kırılmadan tuttuğundan emin ol.
    22. 5 dakika ve 4 °C için 500 × g'da kokültürleri aşağı çevirin. Süpernatantları atmadan önce, arka ışık kullanarak 96 kuyu plakasının altını inceleyerek peletin mevcut olduğundan kısa bir süre emin olun.
    23. Çok kanallı bir pipet kullanarak, optimize edilmiş antikor konsantrasyonları içeren boyama ana karışımındaki hücreleri yeniden biriktirin.
      NOT: Boyama hacimlerinin dağılımında kabarcıkların ve hataların üretilmesini önlemek için filtresiz pipet uçlarını kullanın.
    24. İzotip etiketli hücreler ve BSLB'ler, floresan ve floresan olmayan BSLB'ler ve tek başına lekelenmiş hücreler ve BSLB'leri içerir. Tüm kontroller için kuyu başına toplam olay sayısına saygı gösterin (yani, lekeli olay başına antikorların göreceli olarak artmasını önlemek için yalnızca 5 × 105 BSLB/ kuyu içeren BSLB'ler ve sadece 5 × 105 hücre / kuyu içeren hücre kontrolleri).
    25. Hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyarak hafifçe karıştırın ve buzda 30 dakika kuluçkaya yatırın. Işıktan kork.
    26. Hücreleri ve BSLB'leri buz gibi %2 BSA-PBS, pH 7,4 ve 500 × g'luk çökeltme adımlarını kullanarak 4 °C'de 5 dakika boyunca iki kez yıkayın. Yıkanmış kokültürleri 100 μL PBS'de yeniden satın alın ve hemen elde edin.
    27. Sabitleme gerekiyorsa, PBS'de %0,5 w/v PFA kullanarak 10 dakika boyunca sabitlayın, bir kez yıkayın ve edinceye kadar PBS'de tutun. Işıktan kork.
    28. Tazminat almadan önce, hem en loş hem de en parlak popülasyonların doğrusal ölçüm aralığına düşmesini sağlayan MESF standartlarını alın.
    29. Ücret örnekleri alın, telafiyi hesaplayın ve ücret matrisini (bağlantı) denemeye uygulayın.
    30. Nicelik kanallarının her biri için en az 2 × 104 toplam MESF standardı alın ve kaydedin.
    31. Yüksek verimli örnekleyiciler kullanarak satın alma için, cihaz alımını standart olarak ayarlayın, numune alımını 80 μL (veya toplam hacmin% 80'i), numune akış hızını 2,0 ila 3,0 μL / s arasında, numune karıştırma hacmini 50 μL (veya karıştırma sırasında kabarcık oluşumunu önlemek için toplam hacmin% 50'si), 150 μL / s numune karıştırma ve kuyu başına karıştırma 3 ila 5 arasında ayarlayın.
    32. Örnek başına en az 1 × 104 tek BSLB alın (referans gating stratejisi için Şekil 3B panellere (i)-(vi) bakın).
    33. Aleti kapatmadan önce 5 dakika boyunca çalışan sitometreyi bir temizleme çözeltisi ve ardından 5 dakika ultra saf su ile yıkayın. HTS kullanıyorsanız, HTS sekmesi altındaki seçenekleri ve Temizle seçeneğini izleyin.
    34. FCS dosyalarını dışa aktar.

7. Parçacıkların BSLB'ye sinaptik transferinin ölçülmesi

  1. Deneme FCS dosyalarını açın. Şekil 3B'de (i) gösterildiği gibi, yan ve ileri ışık saçılma alanlarına (SSC-A ve FSC-A)'ya göre hücre ve BSLB popülasyonu seçin.
  2. Sürekli alım penceresindeki olayları seçin (Şekil 3B (ii)).
  3. Hem hücrelerin hem de BSLB'nin tek olaylarına odaklanın; FSC-W/FSC-H (singlets-1, Şekil 3B panel (iii)) ve SSC-W/SSC-H (singlets-2) kapılarındaki düşük W'ye dayanarak ilk olarak tek hücreleri tanımlayın; Şekil 3B panel (iv)). Orantılı FSC-A ve FSC-H (Şekil 3B, panel (v)) içeren olayları seçerek ek bir singlets-3 kapısı tanımlayın.
  4. Mesf kesirlerinin MFI'sını boş ve 1'den 4'e ve her deneme örneği için tek hücrelerden ve MESF'den çıkarın.
  5. Boş boncuk popülasyonunun MFI'sını her kesirden çıkararak 1 ile 4 arasında MESF kesirleri için düzeltilmiş MFI (cMFI) değerleri oluşturun.
  6. Tek BSLB'ler ve hücreler için cMFI'ler oluşturun ( Şekil 3C paneline (i)bakın).
  7. İlgili T hücre işaretçilerine karşı antikorlarla boyanmış BSLB'nin MFI'sını düzeltmek için izotip kontrol antikorları ile boyanmış BSLB'den gelen sinyali kullanın. Şekil 3C panelinde (ii) gösterilen denklemi kullanarak normalleştirilmiş sinaptik aktarım yüzdesini (%NST) hesaplamak için cMFI kullanın.
  8. Bunun yerine, TCR tetiklemesine yanıt olarak özel olarak aktarılan parçacıklarla ilgileniyorsanız, sinyali agonistik BSLB'lerin MFI'sinden boş BSLB'lerden çıkarın. Şekil 3C panelinde (ii) gösterilen denklemi kullanarak TCR güdümlü NST% hesaplamak için bu cMFI'yi kullanın.
  9. T hücre-BSLB arayüzünde parçacık yükü olarak aktarılan toplam molekül sayısını belirlemekle ilgileniyorsanız, T hücre-BSLB kokültürleri için aynı cihaz ayarlarını ve alım seansını kullanarak MESF kıyaslama boncuklarını alıp alın.
  10. MESF boncuk popülasyonlarını analiz edin ve protokol adım 5.8.15 ila 5.8.17'de belirtildiği gibi cMFI'lerini çıkarın. CMFI üzerinden MESF'in regresyon analizi için en uygun çizginin eğimini hesaplayın.
  11. BSLB'lere yatırılan MESF sayısını ayıklamak için hesaplanan eğimi kullanın.
  12. BSLB başına hesaplanan (ortalama) MESF'leri nicelleşme antikorunun F/P değerine bölerek BSLB'lere aktarılan belirteçlerin molekül sayısını hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hücre yüzeyinde mutlak protein nicelemesi için FCM
Ligandların fizyolojik yoğunluklarını sunan BSLB'lerin yeniden uzlaştırılması, modellenen hücre alt kümesindeki toplam protein yoğunluklarının tahminini gerektirir. BSLB'leri yeniden inşa etmek için, BSLB ile hücreler arasındaki yapışmayı ve fonksiyonel etkileşimi destekleyen proteinlerin yanı sıra, örneğin CD40, CD58 ve B7 reseptörleri (CD80 ve CD86) gibi ilgili ligandları da ekleyin. ICOSL3, PD-L1 ve PD-L215 gibi costimulatory moleküller de dahil

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

BSLB'ler, model APC membranları ile uyarılan T hücrelerinin partikül çıkışını incelemek için çok yönlü araçlardır. Yöntemin esnekliği, ligandların ve sinyallerinin TSV'lerin ve supramoleküler saldırı parçacıklarının ve bileşenlerinin salgılanması üzerindeki etkilerini incelemek için karmaşık ve indirgemeci membran bileşimlerinin yeniden inşasını sağlar. Bu teknolojiyi önceden devreye konmuş TH, CTL, Tregs ve CART15 dahil olmak üzere çeşitli T hücreleri üzerinde test ettik. Bu protokol ayrıca taze ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Laboratuvar üyelerimize ve Kennedy Romatoloji Enstitüsü topluluğuna, özellikle akış sitometri tesisi müdürümüz Jonathan Webber'e yapıcı bilimsel tartışmalar için minnettarız. Bu çalışma Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) ve Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (üçü de MLD'ye) tarafından finanse edildi. PFCD, Avrupa Komisyonu (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) ve Marie Sklodowska-Curie Actions) ve Oxford-Bristol Myers Squibb Bursu ile birlikte EMBO Uzun Vadeli Burs (ALTF 1420-2015) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

2
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,2-dioleoil-sn-glisero-3- [(N- (5-amino-1-karboksipentil) iminodiasetik asit) süksinil] (nikel tuzu)Avanti Polar Lipidler790404C-25mg18: 1 DGS-NTA (Ni) kloroform

PIPETMAN L Çok Kanallı P8x200L, 20-200 & mikro; L		GilsonFA10011
1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolinAvanti Polar Lipidler850375C-25mg& nbsp; 18:1 (Δ 9-Cis) Kloroformda PC (DOPC)
1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (DOPE) ATTO 390ATTO-TECAD 390-165DOPE ATTO 390
1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (DOPE) ATTO 488ATTO-TECAD 488-165DOPE ATTO 488
1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (DOPE) ATTO 565ATTO-TECAD 565-165DOPE ATTO 565
1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N- (kap biyotinil) (sodyum tuzu)Avanti Polar Lipidler870273C-25mg18:1 Biyotinil Kap PE kloroform
200 ve mikro; L sarı uçlar 10 x 96 Uç, YığınStarlabS1111-0206
5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplerFalcon®
5.00 ± 0.05 &mikro; m işlevselleştirilmemiş silika boncuklarBangs Laboratories Inc.
96 Kuyulu Hücre Kültasyon Plakası Kapaklı U-alt, Doku kültürü ile tedavi edilmiş, pirojenik olmayan.Costar®3799FCM boyama ve BSLB ve hücrelerin ko-kültürü için.
96 Kuyu Hücre Kültasyon Plakası Kapaklı V-alt, Doku kültürü ile muamele edilmiş, pirojenik olmayan.Costar®3894Süspansiyondaki hücrelerin veya boncukların FCM ile boyanması için.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (Süksinimidil Ester)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen ve ticaret;A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)Thermo Fisher Scientific, Invitrogen & Trade;A37573 ve A20006
Allegra X-12R SantrifüjBeckman CoulterFCM Alüminyum Folyo için biyolojik numunelerin normal tüp boyaması için
Herhangi bir markaHücreleri ve BSLB'leri hafif
anti-insan CD154'ten (CD40L) korumak için, klon 24-31BioLegend310815 ve 310818Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 647 konjugatları, sırasıyla.
anti-insan CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, klon J252D4BioLegend356934Şekil 1'de gösterildiği gibi bademcik hücrelerinin kantitatif FCM analizi için. 1E
anti-insan CD19 Brilliant Violet 421, klon HIB19BioLegend302234Şekil 1'de gösterildiği gibi bademcik hücrelerinin kantitatif FCM analizi için. 1E
anti-insan CD2, klon RPA-2.10BioLegend300202Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
anti-insan CD2, klon TS1/8BioLegend309218Brilliant Violet 421 konjugatı
anti-insan CD252 (OX40L), klon 11C3.1BioLegendAlexa Fluor 647 eşlenik
anti-insan CD28, klon CD28.2eBioscience16-0289-85Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
anti-insan CD317 (BST2, PDCA-1) ile evde etiketlenmiş, klon 26F8ThermoFisher Scientific, invitrojen53-3179-42Alexa Fluor 488 konjugat, bu klonun klon RS38E'den daha temiz olduğunu bulduk.
anti-insan CD38, klon HB-7BioLegend356624Alexa Fluor 700 eşlenik
anti-insan CD38, klon HIT2BioLegend303514Alexa Fluor 647 konjuge
anti-insan CD39, klon A1BioLegendAlexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
anti-insan CD4 Brilliant Violet 650BioLegend317436Şekil 1E'de gösterildiği gibi bademcik hücrelerinin kantitatif FCM analizi için
anti-insan CD4, klon A161A1BioLegend357414 ve 357421PerCP/Cyanine5.5 ve Alexa Fluor 647 konjugatları, sırasıyla
anti-insan CD4, klon OKT4BioLegend317414 ve 317422PE / Cy7 ve Alexa Fluor 647 konjugatları,
sırasıyla anti-insan CD40, klon 5C3BioLegend334304Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
anti-insan CD40, klon G28.5BioLegendevde etiketlenmiştir Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
anti-insan CD45, klon HI30BioLegend304056 ve 368516Alexa Fluor 647 ve APC / Cy7 konjugatları
anti-insan CD47, klon CC2C6BioLegend323118Alexa Fluor 647 eşleniği
ile etiketlenmiştiranti-insan CD54 (ICAM-1), klon HCD54BioLegend322702Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
anti-insan CD63 (LAMP-3), klon H5C6BioLegend353020 ve 353015PerCP / Siyanin5.5 ve Alexa Fluor 647 konjugatları, sırasıyla
anti-insan CD73, klon AD2BioLegend344002Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
ile evde etiketlenmiştiranti-insan CD80, klon 2D10BioLegend305216Alexa Fluor 647 konjuge
anti-insan CD81, klon 5A6BioLegend349512 ve 349502PE / Cy7 konjugatı ve sırasıyla Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester) ile evde etiketlenmiştir.
anti-insan CD82, klon ASL-24BioLegend342108Alexa Fluor 647 eşlenik
anti-insan CD86, klon IT2.2BioLegend305416Alexa Fluor 647 eşlenik
anti-insan CD8a, klon HIT8aBioLegend300920Alexa Fluor 700 eşlenik
anti-insan CD8a, klon SK1BioLegend344724Alexa Fluor 700 eşlenik
anti-insan HLA-A/ B/C/E, klon w6/32BioLegend311414 ve 311402Alexa Fluor 647 konjugatı ve Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
anti-insan HLA-DR, klon L243BioLegend307656 ve 307622Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 647 konjugatları
anti-insan ICAM-1, klon HCD54BioLegend322702Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
anti-insan ICOS ile evde etiketlenmiş, klon C398.4ABioLegend313516Ermeni Hamster IgG
anti-insan ICOSL, klon MIH12BioLegend329611Alexa Fluor 647 eşlenik
anti-insan ICOSL, klon MIH12eBioscience16-5889-82Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
anti-insan LFA-1, klon TS1/22BioLegendEvde üretilmiştirAlexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
anti-insan OX40, klon Ber-ACT35 (ACT35)ileAlexa Fluor 350018 Alexa Fluor 647 eşlenik
anti-insan PD-1, klon EH12.2H7BioLegend135230 ve 329902Alexa Fluor 647 konjugatı ve Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
anti-insan PD-L1, klon 29E.2A3BioLegendileevde etiketlenmiştir 329702 Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
anti-insan PD-L2, klon 24F.10C12BioLegend329611Alexa Fluor 647 eşlenik
anti-insan PD-L2, klon MIH18BioLegend345502Evde Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
anti-insan TCRab, klon IP26BioLegend306712 ve 306714Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 647 konjugatları
antti-insan CD156c (ADAM10), klon SHM14BioLegend352702
antti-insan CD317 (BST2, Tetherin), klon RS38EBioLegend348404Alexa Fluor 647 eşlenik
Ermeni Hamster IgG Alexa Fluor 647 İzotip kontrolü, klon HTK888BioLegend400902Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)
BD Sitometre Kurulumu ve İzleme boncuklarıile evde etiketlenmiştirBecton Dickinson & Şirket (BD)641319Kantitatif FCM BD FACS öncesi enstrümanların performans
takibiDivaBecton Dickinson & Şirket (BD)23-14523-00Satın alma yazılımı
Sığır Seum AlbüminMerck, Sigma-AldrichA3294
CaCl2, Kalsiyum klorürMerck, Sigma-AldrichC5670susuz, BioReagent, böcek hücre kültürü için uygun, bitki hücre kültürü için uygun, & Sığır sütünden elde edilen% 96.0
kazein, protein kinaz için substrat için uygun (defosforilasyondan sonra), saflaştırılmış tozMerck, Sigma-AldrichC5890
Dynabeads İnsan T-Aktivatörü CD3 / CD28ThermoFisher Scientific, Gibco11132D
DynaMag-2ThermoFisher Scientific, Invitrogen & trade;12321D2 mL'den daha küçük hacimlerde Dynabeads İnsan T-Aktivatörü CD3/CD28'in çıkarılması için
DynaMag™-15ThermoFisher Scientific, Invitrogen™12301DDynabeads & trade'in kaldırılması için; 15 mL'den daha az hacimlerde İnsan T-Aktivatörü CD3/CD28
Fetal Sığır Serumu Nitelikli, Tek AtışThermoFisher Scientific, GibcoA316080156 oC'de 30 dakika boyunca ısı inaktivasyonuna ihtiyaç duyar
Ficoll-Paque PLUSCytiva, GE HealthcareGE17-1440-02Lenfosit izolasyonu için steril polisakkarit ve sodyum diatrizoat çözeltisi
Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor 780eBiosciences65-0865-14Analizler sırasında ölü hücrelerin dışlanması için
FlowJoBecton Dickinson & Şirket (BD)Sürüm 10.7.1Analiz yazılımı
Grant Bio MPS-1 Çok Plakalı ÇalkalayıcıKeison ÜrünleriMPS-1Boyama sırasında hücrelerin veya staning veya protein yüklemesi sırasında BSLB'lerin karıştırılması için (orbital ajitasyona alternatif olarak)
HEPES Tampon Çözeltisi (1 M)ThermoFisher Scientific, Gibco15630-056
HEPES, N- (2-Hidroksietil) piperazin-N ve prime; - (2-etansülfonik asit), 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit.Merck, Sigma-AldrichH4034HBS/HAS veya HBS/BSA tamponunun hazırlanması için. Biyoperformans Sertifikalı, ≥ %99,5 (titrasyon), hücre kültürü için uygun
HERACell 150i CO2 inkübatör, 150 L, Elektropolisajlı Paslanmaz ÇelikThermoFisher Scientific51026282Saflaştırılmış CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin kültürlenmesi ve genişletilmesi için.
Hula Mikser® Numune KarıştırıcıThermoFisher Scientific, Yaşam Teknolojileri15920DBSLB'lerin ve lipid ana karışımının, bloke edici çözeltilerin, protein ana karışımının ve küçük ölçekli antikor boyamalarının karıştırılması için kullanılan dikey, değişken açılı laboratuvar karıştırıcısı.
İnsan Serumu Albümini, %30 sulu çözeltiMerck, Sigma-Aldrich12667-M
İnsan TruStain FcX Fc Reseptör Bloke Etme ÇözeltisiBioLegend422302Fc Reseptör Engelleme Biyolojik olarak ilgili örneklerden Fc Reseptörlerinin bloke edilmesi için çözelti
Innovatis CASY hücre sayacı ve analizörü TTBiovendis Products GmbHHücrelerin sayımı ve elektrik akımının dışlanmasına dayalı olarak hücre boyutunun ve hacminin belirlenmesi için.
KCl, Potasyum klorürMerck, Sigma-AldrichP5405Toz, BioReagent, hücre kültürü için uygun
L-Glutamin 200 mM (100x)ThermoFisher Scientific, Gibco25030-024
MgCl2, Magessium chlorideMerck, Sigma-AldrichM2393BioReagent, hücre kültürü için uygun, böcek hücre kültürü için uygun
24 x 1.5/2.0 mL için Mikrotüp Ek Parça tüplerKeison ÜrünleriP-2-24Grant Bio MPS-1 Çok Plakalı Çalkalayıcı
Mini İnkübatör I5110A-230Vyokluğunda BSLB ve hücrelerin inkübasyonu (birlikte kültürlenmesi) için
ThermoFisher Scientific, Gibco11140-035
Fare IgG poliklonal antikor kontrolüMerck, Sigma-AldrichPP54Fare IgG yakalama boncuğu standartlarına
bağlı antikorların ölçümü için pozitif kontrol olarak kullanılırFare IgG1, k Isotype, klon MOPC-21BioLegend400129, 400112, 400130, 400144, 400128 ve 400170Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC / Cyanine7 ve Brilliant Violet 785 & nbsp; konjugatları, sırasıyla.
Fare IgG1, k İzotip, klon X40Becton Dickinson & Şirket (BD), Horizon562438Parlak Menekşe 421 eşleniği.
Fare IgG1, κ İzotip kontrolü, klon P3.6.2.8.1eBioscience14-4714-82Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester) ile evde etiketlenmiştir
Fare IgG2a, k İzotip, klon MOPC-173BioLegend400240Alexa Fluor 647 eşlenik
Fare IgG2b, k İzotip, klon MPC-11BioLegend400330 ve 400355Alexa Fluor 647 ve Brilliant Violet 785 konjugatları,
Multiwell 6 kuyulu Vakumlu gaz plazma ile muamele edilmiş doku kültürüFalcon353046Saflaştırılmış CD4 + < / sup> ve CD8 + < / sup> T hücrelerinin kültürlenmesi ve genişletilmesi için.
Na2HPO4, Disodyum FosfatMerck, Sigma-AldrichS7907
NaCl, Sodyum klorürMerck, Sigma-AldrichS5886BioReagent, hücre kültürü için uygun, böcek hücre kültürü için uygun, bitki hücre kültürü için uygun, & % 99
NiSO4< / sub>, Nikel (II) sülfatMerck, Sigma-Aldrich656895NTA bölgelerini doyurmak için; bloke etme işlemi sırasında eklenir
Penisilin Streptomisin [+] 10.000 birim Penisilin; [+] 10.000 ve mikro; g/mL StreptomisinThermoFisher Scientific, Gibco15140-122
Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuz pH 7.4, sterilThermoFisher Scientific, Gibco10010No Ca 2 + < / sup> veya Mg2 + < / sup> eklendi
Polietersülfon (PES) Filtre ünitesiThermo Scientific Nalgene  UY-06730-43Düşük protein bağlamalı hidrofilik PES membranı, yüksek protein içerikli çözeltilerin filtrelenmesini kolaylaştırır
PURESHIELD argon ISO 14175-I1-ArBOC Ltd.11-Y+4 ° C'de depolanan lipit stoklarının korunması için.
Saflaştırılmış StreptavidinBioLegend280302
Quantum Alexa Fluor 488 MESF boncukBangs Laboratories Inc.488Alexa Fluor'un hücrelere ve/veya BSLB Quantum Alexa Fluor 647 MESF boncuklarına bağlı moleküllerin enterpolasyonu için kıyaslama boncukları
Bangs Laboratories, Inc.647Hücrelere ve/veya BSLB'ye bağlı Alexa Fluor 647 moleküllerinin enterpolasyonu için kıyaslama boncukları
Sıçan anti-fare IgG Kappa Hafif Zincir, klon OX-20ThermoFisher Scientific, invitrojenSA1-25258Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester) ile evde etiketlenmiştir
Rekombinant insan IL-2Peprotech200-02-1MG
RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-GlutaminThermoFisher Scientific, Gibco31870-025
Rozet İnsan B Hücresi Zenginleştirme KokteyliSTEMCELL Teknolojileri15064Saflaştırılmış hücre popülasyonlarındaki protein yoğunluklarını ölçmek için B hücrelerinin izolasyonu
Rozet İnsan CD4+ T Hücre Zenginleştirme KokteyliKÖK HÜCRE Teknolojileri15022C.1
Rozet İnsan CD4 + CD127low T Hücre Zenginleştirme KokteyliSTEMCELL Teknolojiler15361CD4 + CD127Low< / sup> T hücrelerinin FACS ile aşağı akış izolasyonu için ön zenginleştirme.
Rozet İnsan CD8+ T Hücre Zenginleştirme KokteyliSTEMCELL Teknolojileri15063
RPMI Orta 1640 (1x); [-] Fenol KırmızısıThermoFisher Scientific, Gibco11835-063CO2 yokluğunda BSLB ve hücrelerin inkübasyonu (birlikte kültürlenmesi) için. Fenol kırmızısı içermeyen ortam, akış sitometrisi ve mikroskopi tabanlı ölçümlerde hücrelerin otofloresansını azaltır.
Sodyum Piruvat (100 mM)ThermoFisher Scientific, Gibco11360-070
Sprout mini santrifüjFisherScientific, Heathrow Scientific LLC1203011,5 mL Eppendorf tüplerinde silika boncukları ve BSLB'yi yıkamak için kullanılan tezgah üstü mikrosantrifüj.
Steril kapaklı 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplerFalcon352058
UltraComp eBeads Kompanzasyon BoncuklarıThermoFisher Scientific, invitrogen01-2222-42
Zeba Spin Tuz Giderme Kolonları 7K MWCOThermo Fisher Scientific, Invitrogen™89882
352052SS05003 ile evde etiketlenmiştir. ile evde etiketlenmiştir, klon OKT4 ile ile evde etiketlenmiştir. ile evde etiketlenmiştir evde etiketlenmiştir ile etiketlenmiştir. Labnet International için mikrotüp ek parça COMinimum Esansiyel Ortam Esansiyel Olmayan Amino Asitlerin

Kaynaklar

  1. Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling. FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).
  2. Choudhuri, K., et al. Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse. Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).
  3. Saliba, D. G., et al. Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells. elife. 8, 47528(2019).
  4. Barcia, C., et al. In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells. Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).
  5. Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion. Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).
  6. Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).
  7. Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions. Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).
  8. Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells. Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).
  9. Gerard, A., et al. Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells. Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).
  10. Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. Supported planar bilayers for study of the immunological synapse. Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).
  11. Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2021).
  12. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  13. Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers. Frontiers in Physiology. 11, 613367(2020).
  14. Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).
  15. Céspedes, P. F., et al. Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses. bioRxiv. , (2021).
  16. Yoon, J., et al. Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning. Scientific Reports. 7 (1), 6654(2017).
  17. Roederer, M. Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not. Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).
  18. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).
  19. Balint, S., et al. Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells. Science. 368 (6493), 897-901 (2020).
  20. Cespedes, P. F., et al. Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

T H cresi mm n SinapsTrans Sinaptik Vezik llerAk SitometrisiProtein Yo unlu u l mAntijen Sunan H crelerSupramolek ler Sald r Partik lleriKimerik Antijen Resept rleriFloresan Aktive H cre Ay rmaICAM 1 Kantifikasyonu
T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.