Sıralı Capillarity destekli Montaj yoluyla Mikroorganizmaların ve Mikropartiküllerin Deseni

Tek mikroorganizmaların, özellikle mikroakışkan cihazlar gibi çevresel koşullar üzerinde tam kontrol sağlayan deneysel arenalarda mekansal desenleme, çok çeşitli bağlamlarda son derece arzu edilir. Örneğin, mikroorganizmaların düzenli diziler halinde düzenlenmesi, çok sayıda bireysel hücrenin doğru görüntülenmesine ve çevresel uyaranlara yanıt olarak büyüme, fizyoloji, gen ekspresyonu ve ilaç duyarlılığının incelenmesine izin verecektir. Ayrıca, hücresel iletişim (örneğin, çekirdek algılama), çapraz besleme (örneğin, alg-bakteriyel simbiyoz) veya antagonizm (örneğin, allelopati) araştırmalarında özel olarak ilgi çekici hücre-hücre etkileşimlerinin incelenmesine ve hücrelerin birbirine göre mekansal lokalizasyonu üzerinde tam kontrole sahip olmasına izin verecektir. Hücre fizyolojisi ve evrim ^{çalışmaları1}, hücre-hücre etkileşim ^{çalışmaları2}, fenotipik farklılaşma ^taraması3, çevresel ^izleme4 ve ilaç ^taraması5 , bu tür nicel tek hücreli analizleri başarabilen bir teknolojiden büyük ölçüde yararlanabilecek alanlar arasındadır.

Holografik optik ^tuzaklar6 ve heterojen yüzey fonksiyonelleştirme ^{yöntemleri7,8,9,10'dan} tek hücreli kemostatlara11 ve damlacık mikroakışkanlarına12 kadar tek hücreleri izole etmek ve işlemek için son yıllarda çeşitli stratejiler önerilmiştir. Bu yöntemler teknik olarak çok zorludur veya hücre fizyolojisini etkiler ve tek hücreli çözünürlük, tam optik erişim ve çevresel koşullar üzerinde kontrol sağlayarak uzun süre çalışılabilen mikropları örüntülemek için yüksek verimli bir platform sağlayamaz. Bu makalenin amacı, bakterileri mikrometrik hassasiyetle, kapilarite destekli montaj yoluyla PDMS yüzeyinde öngörülen mekansal düzenlemelere desenlamak için bir platform tanımlamaktır. Bu platform, mikropların hassas ve esnek uzamsal desenlemesine izin verir ve mikroakışkan doğası sayesinde çevresel koşullar üzerinde tam optik erişim ve kontrol sağlar.

Bu platformun arkasındaki teknoloji, mikroakışkan bir platforma entegre edilen sCAPA13,14,15 (sıralı kapilarite destekli parçacık montajı) adlı son yıllarda geliştirilen bir montaj ^{teknolojisidir16}. Buharlaşan bir sıvı damlacığın menisküsleri, mikroakışkan bir kanalın içindeki desenli bir polidimetilsiloksan (PDMS) substratı üzerinde çekilirken, sıvıda asılı kalan bireysel kolloidal parçacıkları alt tabaka üzerinde mikrofebrik kuyulara hapseden kılcal kuvvetler uygular (Şekil 1A). Askıda parçacıklar önce konvektif akımlarla hava-sıvı arayüzüne taşınır ve daha sonra kapilarite ile tuzaklara yerleştirilir. Hareketli menisküs tarafından uygulanan kılcal kuvvetler, parçacık etkileşimlerine katılan kuvvetlere kıyasla daha büyük ölçekte hareket eder.

Böylece, montaj mekanizması parçacıkların malzeme, boyut ve yüzey özelliklerinden etkilenmez. Partikül konsantrasyonu, menisküs hızı, sıcaklık ve süspansiyonun yüzey gerilimi gibi parametreler, desenleme işleminin verimini etkileyen tek parametrelerdir. Okuyucu, yukarıda belirtilen parametrelerin desenleme işlemi üzerindeki etkisinin ayrıntılı bir açıklamasını ^13,14,15'te bulabilir. Orijinal sCAPA ^{teknolojisinde13,14,15}, kolloidal desenleme işlemi açık bir sistemde gerçekleştirildi ve süspansiyonu şablon boyunca sürmek için yüksek hassasiyetli bir piezoelektrik aşama gerektirdi. Bu platform farklı bir stratejiden yararlanır ve desenlemenin genellikle mikroakışkanlarda kullanılan standart ekipmanlarla kontrollü bir ortamda gerçekleştirildiğini ve böylece numunelerin kirlenme risklerini en aza indirmesini sağlar.

Bu mikroakışkan platform, düzenli inert parçacık dizileri oluşturmak için önce kolloidal parçacıklar üzerinde optimize edildi ve daha sonra bakterilere başarıyla uygulandı. Her iki mikroakışkan platform da bu makalede açıklanmıştır (Şekil 1B,C). Hazırlık adımlarının ve protokolde açıklanan deneysel ekipmanların çoğu iki uygulama için ortaktır (Şekil 2). Tekniğin karmaşık, çokmal desenler oluşturmak için aynı yüzeyde birden fazla sıralı çökelti gerçekleştirmek için kullanılabileceğini göstermek için kolloidal desenleme rapor ediyoruz. Özellikle, belirli bir geometriye ve bileşime sahip kolloidal diziler oluşturmak için her adım için tuzak başına tek bir parçacık biriktirildi, sadece tuzakların geometrisi ve dolum sırası tarafından dikte edildi. Bakteriyel desenleme gelince, tek ifadeler tanımlanır ve bu da tuzak başına bir bakterinin birikmesine neden edilir. Hücreler yüzeyde desenlendikten sonra, mikroakışkan kanal, herhangi bir tek hücreli çalışmanın ön adımı olan bakteri üremesini teşvik etmek için orta ile yıkanır.

1. Silikon master hazırlığı

NOT: Kolloidal ve mikrobiyal desenleme şablonlarını oluşturan mikrofabrik tuzakları taşıyan PDMS şablonları Geissler ve ark. ^17. Silikon ustası, temiz bir odada geleneksel litografi ile hazırlandı. Prosedür için aşağıdaki adımlara ve ekipman için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanarak özellikleri tasarlayın.
2. Tasarlanan özellikleri UV doğrudan lazer yazıcı ile ortaya sürerek krom cam maskesini pozitif fotoresist tabakasıyla hazırlayın.
   1. Krom cam maskesini, 15 sn için 1:4 fotoresistten su oranına bir geliştirici kullanarak bir spin geliştiricisi ile geliştirin.
   2. Maskeyi 50 s boyunca krom vbhant içine daldırın.
   3. Plazma-tedavi 10 cm silikon gofret için 3 dakika 600 W.
   4. Buhar bir hexamethyldisilizane tabakası biriktirin ve fotoresiste doğru yapışma geliştirmek için 110 °C'de pişirin.
   5. 2 dakika boyunca 4.500 × g'da bir fotoresist tabakası yatırın.
   6. Özelliği, 2 s için maske hizalayıcılı krom cam maske aracılığıyla UV'ye maruz bırakın ve maskeye gelince bir geliştiriciyle geliştirin.
3. Silikon ustasının imalatını tamamlamak için, gofret derin reaktif iyon değişimi ile kazıyın, istediğiniz derinliğe ulaşmak için gravür süresini (<2 dk) ayarlayın (profilometre ile ölçülür).

2. Mikrokanel kalıp hazırlama

1. Kanalı CAD yazılımıyla tasarlayın ve dilimleyici bir yazılımla dilimleyerek tasarlanan modeli 3D yazıcı için talimatlara dönüştürün ve dilimleme mesafesini 0,05 mm olarak ayarlayın.
2. Kanalı ~1 saat boyunca 3D yazıcıyla yazdırın.
3. Kalıbı özel bir kürleme ve çamaşır makinesinde yıkayın ve postcure edin.
   1. Kalıbı saf izopropil alkol (IPA) ile dolu bir kaba koyun ve sıvıyı girdaplayın (20 dakika yıkayın). IPA dolu kabı makineden çıkar.
   2. Yıkanmış kalıp IPA kabından çıkarıldıktan sonra, yıkama ve kürleme makinesine geri koyun ve 35 ° C'de 15 dakika boyunca postcure edin.
      NOT: Malzeme Masası , 3D yazıcıyı ve kalıp hazırlama protokolünde kullanılan kür ve çamaşır makinesini raporlar. 3D model, 3D yazıcının tescilli dilimleyici yazılımı ile dilimlendi.
4. Baskıyı 12 saat boyunca bir UV fırınına yerleştirin ve 12 saat boyunca 80 °C'de bir fırına yerleştirin.
   NOT: Bu adım, PDMS'nin kürlemesini önleyeceği için tüm polimerin kürlanmasını ve tüm kesilmemiş polimerlerin baskıdan çıkarılmasını sağlar.
5. Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane buhar birikimi yoluyla kalıbı silezleştirin.
   1. 3D kalıbı, kalıba yakın yerleştirilmiş alüminyum bir folyo üzerine pipetlenmiş 20 μL konsantre Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane ile birlikte bir vakum kurutucuya yerleştirin.
   2. Buhar üretmek ve 40 dakika bekletmek için kurutucuda bir vakum oluşturun.
   3. Kalıbı kurutucudan çıkarın ve üzerine PDMS dökmeden önce saf etanol ile durulayın.

3. Mikroakışkan çipin imalatı

1. Elastomer'ı çapraz bağlama maddesiyle (Malzeme Tablosu) karıştırarak pdms karışımı hazırlayın. Hava kabarcıkları oluşana ve PDMS karışımı opak görünene kadar iki bileşeni eşit şekilde karıştırmak için karışımı kuvvetlice karıştırın.
   NOT: Çapraz bağlayıcı miktarı, elastomer miktarının ağırlığına göre% 10 olmalıdır.
2. Sıkışan hava kabarcıklarını çıkarmak için elastomer ve çapraz bağlama maddesinin karışımını bir vakum kurutucuda gazdan arındırın. Kurutucudaki karışımı karıştırma için kullanılan kaba aktarın (adım 3.1). Tüm kabarcıklar çıkarılana ve karışım tekrar şeffaf görünene kadar gaz giderme işlemine devam edin.
   NOT: Genellikle desiccation için gereken süre 30 dakikadır.
3. Mikroakışkan çipin "zemini" olarak hizmet edecek şablonu üretmek için silikon ustasına 3 g karışım dökün.
   NOT: PDMS katmanının kalınlığı, silikon ana üzerine dökülen karışım miktarı değiştirilerek ayarlanabilir.
   1. 400 μm kalınlığında bir şablon elde etmek için, silikon ana üzerine 3 g PDMS dökün, silikon ustayı bir spin kaplayıcıya yerleştirin ve 5 s için 21 × g ve 10 s için 54 × g'da spin coat ve ardından sıkışmış hava kabarcıklarını çıkarmak için 3.2 adımda açıklandığı gibi tekrar gaz çözün.
4. Mikroakışkan çipin "çatısı" olarak hizmet edecek mikrokanalı yapmak için 3D baskılı kalıba PDMS karışımından 20 g dökün ve 30 dakika boyunca 3.2 adımda açıklandığı gibi gazdan arındırın.
5. Hem silikon gofret hem de 3D baskılı kalıbı 70 °C'de en az 2 saat pişirin.
6. PDMS katmanını 3D baskılı kalıptan soyun, PDMS'yi mikrokanellerin etrafında bir bıçakla kesin ve mikroakışkan kanalın giriş ve çıkışı olarak hizmet edecek delikleri delin.
7. PDMS'yi silikon ustasından soyun ve PDMS katmanını şablonların üzerine yapıştırılacak mikroakışkan kanalların aynı boyutlarıyla daha küçük parçalara bölün.
8. Şablonları ve mikrokanelleri% 1 deterjan çözeltisi kullanarak hafifçe ovalayın ( Malzeme Masasına bakın) 5 dakika boyunca ve ardından deiyonize suyla durulayın. Daha sonra, şablonları ve mikrokanelleri izopropanol ile durulayın ve deiyonize su ile durulayın. Şablonları ve mikrokanelleri oda sıcaklığında 1 barda basınçlı hava ile 1 dakika kurutun.
9. Şablonları ve mikrokanelleri, bağlanacak yüzeyler yukarı bakacak şekilde bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Plazma temizleyiciyi açın ve plazma şablonları ve mikrokanelleri 40 s boyunca tedavi edin. Plazma temizleyiciden çıkar ve mikrokanelleri hemen şablonların üzerine birbirleriyle temas ettirerek yapıştırın.
10. PDMS hidrofobik geri kazanımı sağlamak ve 30 ila 60°^10,11 arasında optimum aralıkta geri çekilen temas açısına sahip olmak için mikroakışkan talaşları beş gün boyunca 70 °C'de bir fırında saklayın.

4. Bakteriyel desenleme

1. Deneyden bir gün önce, Escherichia coli popülasyonunu büyütün (MG1655 prpsM-GFP suşu). Kültürü doğrudan donmuş stoktan aşılayın ve 37 °C'de bir çalkalayıcı inkübatörde lysogeny et suyu (LB) ortamında 20 saat boyunca bir gecede büyüyün. PrpsM-GFP plazmidini korumak için hücreler için 50 μg/mL kanamycin ekleyin.
2. Deney günü, kutu inkübatörü (Şekil 2A) deneye başlamadan önce düzgün ve istikrarlı bir sıcaklığa sahip olacak şekilde deneyden birkaç saat önce 37 °C olarak ayarlayın. Şırınga pompasını ve ısıtılmış cam plakayı mikroskop aşamasına (Şekil 2B,C) kurun ve sıcaklığı kutu inkübatörü ile aynı sıcaklığa ayarlayın.
   NOT: Mikroskop (Şekil 2E) dahil olmak üzere tüm sistemin içine yer aldığı kutu inkübatörü, kanal ortamla yıkandığında tüm deney boyunca düzgün ve sabit bir sıcaklığın korunmasını sağlar.
3. Deneyden doksan dakika önce, mikroakışkan çipi% 100 etanol (EtOH) ile dolu bir kap içine koyun ve kanalı en az 10 dakika boyunca% 100 EtOH ile yıkayın. Mikroakışkan çipi bir vakum kurutucusunda ve degazda en az 30 dakika yerleştirin. EtOH'u damıtılmış suyla değiştirin ve çipi en az 30 dakika vakumla tedavi edin. Kanalda kalan sıvı izlerini gidermek için mikroakışkan çipi 10 dakika boyunca 70 °C'de fırına koyun.
   NOT: Bu adım, kültür ortamı ile yıkandığında kanalda kabarcık oluşumunu önlemek için gereklidir. Bu kabarcık önleme protokolü Wang ve ^ark.18'den uyarlanmıştır.
4. Pipet 1 mL 3-(N-morpholino)propansülfonic asit (MOPS) orta (1x) santrifüj şişe içine ve 10 μL 0.132 M potasyum fosfat (_K2HPO4) ekleyin. Gece kültürünü 37 °C inkübatörden çıkarın ve aliquot 100 μL'yi santrifüj şişesine alın ve kültürü 2 dakika boyunca 2.300 × g'da santrifüj edin. Süpernatantı santrifüj şişelerinden hafifçe borulayın ve peleti 1 mL taze MOPS ortamında 0.015% v / v Tween 20 ve% 0.01 potasyum fosfat v / v ile yeniden atın.
   NOT: Bakteriyel süspansiyonun tipik konsantrasyonu% 0.015-0.15 vol aralığındadır, bu da genişletilmiş ve mobil bir biriktirme bölgesinin oluşumunu sağlar ve parçacıkların substratta birikmesini önler. Gece ortamının taze ortamla değiştirilmesi, şablonda bakteri filmlerinin serbest bırakılması risklerini en aza indirir. Taze ortamdaki karbon kaynağı eksikliği, şablon desenleme sırasında süspansiyonda hücrelerin büyümesini önler. PDMS şablonundaki geri çekilen sıvının temas açısının 30 ila 60° arasında en uygun aralığa düşmesi için süspansiyondaki Tween 20'nin %0,015 v/v konsantrasyonu gereklidir.
5. Bakteri süspansiyonunu 1 mL şırıngaya yükleyin ve şırıngayı mikroakışkan boru ile çipe bağlayın.
   1. Şırınga ile boru arasındaki bağlantıyı sabitlemek için, doğrudan dış çapı 0,6 mm olan bir iğneyi boruya yerleştirin. Giriş çevresinde kalan süspansiyonun kanal boyunca dağılmasını önlemek için, taze ortamı giriş olarak kullanılan delik yerine, desenleme işlemi sırasında çıkış olarak kullanılan delikten (Şekil 3A-III) boşaltın.
   2. Şırıngayı şırınga pompasına monte edin ve süspansiyon şablon bölgesini tuzaklarla kaplayana kadar kanalın yukarı akış kısmında bulunan girişten süspansiyonu mikroakışkan çipe enjekte edin.
      NOT: Sıvı enjeksiyon işlemi sırasında, hava kanalın aşağı akış ucunda bulunan bir çıkıştan kaçabilir.
   3. Şırıng pompasını bakteri süspansiyonu (Şekil 3A-I) 0,07-0,2 μL/dk akış hızında çekecek şekilde ayarlayın, bu da tarif edilen geometride 80-100 μm/ dk menisküs geri çekilme hızına karşılık gelir.
   4. Mikroskop yazılımı ile desenleme işlemini izleyin.
      NOT: Burada, şablondaki geri çekilen menisküsleri izlemek için 10x büyütme ve mikrofabrik tuzaklara bireysel bakterilerin birikmesini izlemek için 20x büyütme kullanıldı.
6. Şablon hücrelerle desenlendikten sonra (Şekil 3A-II), mikroakışkan kanalı hızlı bir şekilde boşaltmak ve daha önce en az 30 dakika gazdan arındırılan ve 30 ° C'de önceden ısıtılmış taze LB ile yıkamak için geri çekilme akış hızını artırın.
7. Kanalı hafifçe yıkamak için şırınna pompasını 2 μL/dk akış hızına ayarlayın. Kanal doldurulduktan sonra, belirli deneysel ihtiyaçlara göre akış hızını (15 μL/ dk) artırın.
8. İstenilen büyütme ve zaman aralığında büyüyen bakterilerin görüntülerini elde edin.

5. Kolloidal desenleme

1. Pipet 900 μL% 0.015 v/v Ara 20 sulu çözeltiyi bir santrifüj şişesine ve pipet 100 μL orijinal kolloidal süspansiyon içine. Süspansiyonu 1 dakika boyunca 13.500 × g'da santrifüj edin. Üstnatant yavaşça çıkarın ve sulu Ara 20 (%0,015 v/v) çözeltisi ile değiştirin. Tedarikçinin çözücüsünden stok süspansiyonundan tamamen değiştirilmesini sağlamak için bu işlemi üç kez tekrarlayın.
2. Kolloidal süspansiyonu 1 mL şırıngaya yükleyin ve şırıngayı mikroakışkan boru ile çipe bağlayın. Süspansiyonu, kanalın yukarı akış kısmında, orta bölümde bulunan girişten mikroakışkan çipe enjekte edin ve şablon kaplanana kadar süspansiyonu kademeli olarak itin.
3. Kolloidal süspansiyonu 0,07-0,2 μL/dk akış hızında çekin, bu da 1-2 μm/dk menisküs çekme hızına karşılık gelir ve mikroskop yazılımı aracılığıyla desenleme işlemini görüntüleyin. Şablondaki geri çekilen menisküsleri izlemek için 10x büyütme ve mikrofabrik tuzaklara tek tek parçacıkların birikmesini gözlemlemek için 20x büyütme kullanın. Menisküs, kanalı hızlı bir şekilde boşaltmak için şablonun sonuna ulaştığında akış hızını artırın.
   NOT: Çeşitli parçacıklardan oluşan kolloidal diziler, seri olarak 5.1 ile 5.3 arası desenleme işlemi çalıştırılarak üretilebilir. Kanal, istenen kolloidal dizilerin bileşimine göre her yinelemede yeni bir kolloidal süspansiyon ile yüklenir. Her desen adımı kolloidal diziye bir parçacık ekler ve tuzaklar istenen parçacıkların dizisiyle doldurulana kadar sırayla çalıştırılabilir. Elde edilen kolloidal dizilerin bileşimi sadece tuzakları doldurmak için kullanılan kolloidal süspansiyonların dizisi tarafından verilir (Şekil 3B).

Kolloidal parçacıkları ve bakterileri pdms şablonunda mikrofabrik olarak tasarlanmış tuzaklara sokmak için kapillarite destekli montajdan yararlanan mikroakışkan bir platform geliştirilmiştir. Kolloidlerin ve bakterilerin kapillarite destekli montaj yoluyla desenlerini optimize etmek için iki farklı kanal geometrisi tasarlanmıştır. İlk kanal geometrisi (Şekil 1B), aralarında fiziksel bariyer olmayan üç 23 mm uzunluğunda paralel bölümden oluşur. Yanlardaki iki bölüm 5 mm genişliğinde ve 1 mm yüksekliğinde, orta bölüm ise 7 mm genişliğinde ve 500 μm yüksekliğindedir. Bu tasarım, geri çekilen dışbükey şekilli menisküs ile iyi tanımlanmış hareketli bir damlacık korumaya yardımcı olur. Bu platformun çalışma prensibi Pioli ve ark.11 tarafından ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Deney, bakteri kültleme durumunda olduğu gibi yanal kanalların doldurulması gerektiriyorsa, genellikle hava cepleri oluşur. Bu nedenle, kanal orta ile yıkandığında dolum işlemini basitleştiren ikinci bir geometri tasarladık ve test ettik. Bu durumda, platform (Şekil 1C) tek bir 20 mm uzunluğunda, 3 mm genişliğinde ve 500 μm yüksekliğinde düz bir kanaldan oluşur.

Mikroakışkan kanaldaki sıcaklık, verimli bir biriktirme işlemi sağlamak için önemli bir parametredir. Şablonda yoğuşma olmaması için çiy su noktasının 15 °C üzerinde tutulmalıdır. Kanalın altındaki ısıtmalı cam plaka (Şekil 2D), sıvı hava arayüzüne yakın bölgede, havadaki yüksek buhar konsantrasyonu ile karakterize edilen desenleme işlemi sırasında yoğuşmayı önlemek için şablon genelinde eşit bir sıcaklık sağlar. Şablonda yoğuşma olmaması için ısıtılmış cam plakanın sıcaklığı kutu inkübatörü ile aynı olmalıdır.

Düz kanal geometrisi, floresan E. coli suşu (MG1655 prpsM-GFP) sabit fazlı hücreleri (Şekil 4A

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.