Yöntem makalesi

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

DOI:

10.3791/63136

⸱

11 Nisan 2022

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, TIFR, 2Department of Biological Sciences, TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering, The University of Texas at Austin

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, 36 saate kadar sürekli bir gıda arzı varlığında C. elegans yetiştirmek için kullanılan basit bir mikroakışkan çip tasarımını ve mikrofabrikasyon metodolojisini açıklamaktadır. Büyüme ve görüntüleme cihazı ayrıca, birkaç gün boyunca geliştirme sırasında hücresel ve hücre altı süreçlerin aralıklı uzun süreli yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans), gelişimsel ve hücre biyolojik süreçlerini incelemek için değerli bir model sistem olduğunu kanıtlamıştır. Bu biyolojik süreçleri anlamak genellikle aynı hayvanın uzun süreli ve tekrarlanan görüntülenmesini gerektirir. Agar pedleri üzerinde yapılan geleneksel immobilizasyon yöntemleriyle ilişkili uzun iyileşme süreleri, hayvan sağlığı üzerinde zararlı etkilere sahiptir ve aynı hayvanı uzun süre boyunca tekrar tekrar görüntülemeyi uygun hale getirmez. Bu yazıda mikroakışkan çip tasarımı, üretim yöntemi, çip üzerinde C. elegans kültürleme protokolü ve bireysel hayvanlarda gelişimsel süreçleri incelemek için üç uzun vadeli görüntüleme örneği açıklanmaktadır. Polidimetilsiloksan ile imal edilen ve bir kapak camına bağlanan çip, azot gazı kullanılarak saptırılan elastomerik bir membran kullanarak hayvanları bir cam substrat üzerinde hareketsiz hale getirir. C. elegans'ın tamamen immobilizasyonu, hücresel ve hücre altı olayların anesteziz bir şekilde sağlam bir hızlandırılmış görüntülenmesini sağlar. Büyük bir kesitli bir kanal geometrisi, hayvanın kısmen kapatılmış iki izolasyon membranı içinde serbestçe hareket etmesini sağlayarak sürekli bir gıda kaynağı ile kanalda büyümeye izin verir. Bu basit çipi kullanarak, hayvan kanalın içinde büyüdükçe, PVD duyusal nöronlarında nöronal süreç büyümesi, vulval gelişim ve dendritik arborizasyon gibi gelişimsel olayların görüntülenmesi gerçekleştirilebilir. Uzun vadeli büyüme ve görüntüleme çipi, tek bir basınç hattı ile çalışır, harici valf içermez, ucuz akışkan sarf malzemeleri kullanır ve C. elegans kullanan diğer laboratuvarlar tarafından kolayca uyarlanabilen standart sonsuz taşıma protokollerini kullanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans, hücre biyolojisini, yaşlanmayı, gelişim biyolojisini ve nörobiyolojiyi incelemek için güçlü bir model organizma olduğunu kanıtlamıştır. Şeffaf gövdesi, kısa yaşam döngüsü, kolay bakımı, tanımlanmış sayıda hücre, birkaç insan genine sahip homoloji ve iyi çalışılmış genetiği gibi avantajlar, C. elegans'ın hem temel biyoloji keşifleri hem de uygulamalı araştırmalar için popüler bir model haline gelmesine yol açmıştır 1,2. Hücrenin biyolojik ve gelişimsel süreçlerini, bireysel hayvanların tekrarlanan uzun vadeli gözlemlerinden anlamak, faydalı olabilir. Geleneksel olarak, C. elegans agar pedleri üzerinde anestezi altına alınır ve mikroskop altında görüntülenir. Anesteziklerin hayvan sağlığı üzerindeki olumsuz etkileri, aynı hayvanın uzun süreli ve tekrarlanan aralıklı görüntülemesi için anestezi uygulanan hayvanların kullanımını sınırlandırmaktadır 3,4. Mikroakışkan teknolojilerdeki son gelişmeler ve ihmal edilebilir sağlık tehlikeleri olan C. elegans'ın anestezik olmayan tuzaklanması için adaptasyonları, aynı hayvanın kısa ve uzun bir süre boyunca yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Mikroakışkan çipler, C. elegans'ın 5 yüksek verimli tarama 6,7,8, yakalama ve dağıtma9, ilaç taraması10,11, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile nöron stimülasyonu 12 ve hayvanın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi 12,13,14 için tasarlanmıştır. Slaytlarda immobilizasyon için ultra ince mikroakışkan levhalar da geliştirilmiştir15. C. elegans'ın uzun vadeli çalışmaları, sıvı kültüründe büyüyen hayvanların düşük çözünürlüklü görüntüleri kullanılarak büyümeyi, kalsiyum dinamiklerini, davranışları üzerindeki ilaç etkilerini16,17,18,19, uzun ömürlülüklerini ve20 yaşlarını gözlemlemek için gerçekleştirilmiştir. Sinaptik gelişimi değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanan uzun süreli çalışmalar21, nöronal rejenerasyon22 ve mitokondriyal ilaveyi23 olarak değerlendirmiştir. Çok kanallı cihazlarda uzun süreli yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve hücre kaderi ve farklılaşmasının takibi24,25 olarak yapılmıştır. Birkaç hücresel ve hücre altı olay, birkaç saatlik zaman ölçeklerinde meydana gelir ve hücresel dinamikleri in vivo anlamak için süreçteki tüm ara adımları karakterize etmek için gelişimleri sırasında aynı bireyin farklı zaman noktalarında yakalanmasını gerektirir. Organogenez, nöronal gelişim ve hücre göçü gibi biyolojik süreçleri görüntülemek için, hayvanın birden fazla zaman noktasında aynı yönde hareketsiz hale getirilmesi gerekir. Daha önce, dokunma reseptör nöronları (TRN'ler) boyunca mitokondrilerin nereye eklendiğini belirlemek için 36 saatten fazla C. elegans'ın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için bir protokol yayınlamıştık23.

Bu makale, tekrarlanan yüksek çözünürlüklü görüntüleme için mikroakışkan tabanlı bir metodoloji oluşturmak için bir protokol sunmaktadır. Tek bir akış kanalına sahip bu cihaz, cihaz başına tek bir hayvanın tekrarlanan görüntülenmesi için en uygun olanıdır. Verimi artırmak ve aynı anda birçok hayvanı görüntülemek için, aynı basınç hattına birden fazla cihaz bağlanabilir, ancak her cihazda tek bir hayvanı kontrol eden ayrı üç yönlü konektörlerle bağlanabilir. Tasarım, embriyonik sonrası gelişimsel süreçler, hücre göçü, organel taşınması, gen ekspresyon çalışmaları gibi yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntüler gerektiren çalışmalar için kullanışlıdır. Teknoloji, birçok geç evre hayvanın paralel büyümesini ve görüntülenmesini gerektiren yaşam süresi ve yaşlanma çalışmaları gibi bazı uygulamalar için sınırlayıcı olabilir. Polidimetilsiloksan (PDMS) elastomeri, biyostabilitesi26, biyouyumluluk27,28, gaz geçirgenliği 29,30 ve ayarlanabilir elastik modülü 31 nedeniyle bu cihazın üretimi için kullanılmıştır. Bu iki katmanlı cihaz, mikroakışkan bir kanalda sürekli gıda tedariki olan hayvanların büyümesine ve azot gazı kullanılarak PDMS membran sıkıştırması yoluyla bireysel C. elegans'ın yakalanmasına izin verir. Bu cihaz, sürekli bir gıda kaynağı altında mikrokanalda aynı hayvanı büyütme ve görüntüleme avantajı ile daha önce yayınlanmış cihazın bir uzantısıdır3. Ek izolasyon membran ağı ve 2 mm genişliğinde bir yakalama membranı, gelişmekte olan hayvanların verimli bir şekilde immobilizasyonunu sağlar. Cihaz, duyusal PVD nöronlarında nöronal gelişimi, vulval gelişimi ve dendritik arborizasyonu gözlemlemek için kullanılmıştır. Hayvanlar, cihazda olumsuz sağlık etkileri olmadan büyür ve gelişimi sırasında aynı hayvandaki hücre altı olayların görüntülenmesini kolaylaştırmak için tekrar tekrar hareketsiz hale getirilebilir.

Tüm protokol beş bölüme ayrılmıştır. Bölüm 1, büyüme ve görüntüleme çipi için cihaz imalatını açıklamaktadır. Bölüm 2, bireysel C. elegans'ı hareketsiz hale getirmek ve izole etmek için PDMS membran sapması için bir basınç sisteminin nasıl kurulacağını açıklamaktadır. Bölüm 3, cihaz görüntüleme için bir nematod büyüme ortamı (NGM) plakası üzerinde C. elegans'ın nasıl senkronize edileceğini açıklamaktadır. Bölüm 4, cihaza tek bir hayvanın nasıl yükleneceğini ve hayvanın birkaç gün boyunca mikroakışkan cihazın içinde nasıl yetiştirileceğini açıklar. Bölüm 5, bireysel bir hayvanın birden fazla zaman noktasında nasıl hareketsiz hale getirileceğini, farklı hedefler kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntülerin nasıl yakalanacağını ve Fiji'yi kullanarak görüntülerin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Büyüme ve görüntüleme cihazının imalatı

  1. SU8 kalıp imalatı
    1. Bir kelime işlem yazılımında (veya bilgisayar destekli bir tasarım CAD yazılımında) dikdörtgen şekiller kullanarak 1 (akış katmanı) ve 2 (kontrol katmanı) desenlerini tasarlayın ve fotomaskeleri, polyester tabanlı film üzerinde minimum 8 μm özellik boyutuna sahip bir lazer plotter yardımıyla yazdırın (Şekil 1).
    2. Silikon gofretleri 2,5 cm × 2,5 cm'lik parçalar halinde kesin ve 1 dakika boyunca% 20 KOH ile temizleyin. Gofretleri deiyonize (DI) suda durulayın. Akış ve kontrol katmanı için her biri bir gofret kullanın.
      DİKKAT: KOH aşındırıcıdır ve dikkatle kullanılmalıdır.
    3. Parçaları 14 psi sıkıştırılmış azot gazı ile kurutun ve ardından 4 saat boyunca 120 °C'de bir sıcak plakada dehidrasyon yapın. Bir sonraki adıma geçmeden önce, iki parçayı oda sıcaklığına soğutun.
    4. Silikon parçalardan birini alın ve bir sıkma kaplayıcının mandren üzerine koyun ve gofreti yerinde tutmak için vakumu açın. Silikon parçasına, ~ 20 μL hekzametildisila (HMDS) koyun ve spin kaplayıcıyı kullanarak 5 s için dakikada 500 rotasyonda (rpm) ve ardından 30 s için 3.000 rpm ile kaplayın.
      DİKKAT: Bu adım sarı ışıkta yapılmalıdır. Odada beyaz ışık kullanmayın.
    5. ~40 μm'lik düzgün bir fotodirenç kalınlığı elde etmek için (akış katmanına özgü; erken larva aşama 1 ila aşama 3 (L1 - L3) hayvanlarını görüntülemek için uygundur), silikon gofreti ~ 1.5 mL negatif fotorezist-1 ile kaplayın, 5 s için 500 rpm'de bir spin kaplayıcı ve ardından 30 s için 2.000 rpm ile kaplayın.
    6. Kontrol katmanına özgü ~40 μm'lik düzgün bir fotodirenç kalınlığı elde etmek için ikinci gofretle 1.1.4 ve 1.1.5 adımlarını tekrarlayın.
    7. Alternatif olarak, yaşlı hayvanlar için akış tabakasının kalınlığını ~80 μm'ye çıkarmak için, silikon gofretleri ~1.5 mL negatif fotorezist-2 ile kaplayın, spin kaplayıcıyı 5 s için 500 rpm'de ve ardından 30 s için 2.000 rpm'de kullanın. Bu kalınlık yetişkin hayvanlara L3 aşaması için uygundur.
      DİKKAT: Spin kaplı tabakaların zarar görmesini önlemek için silikon gofretleri yanlarından tutun. Bu adımda beyaz ışıkları kapalı tutun.
    8. Fotodirenç kaplı silikon parçaları (akış ve kontrol katmanları için) sıcak bir plaka üzerinde 1 dakika boyunca 65 ° C'de ve ardından 10 dakika boyunca 95 ° C'de pişirin. Pişmiş parçaları oda sıcaklığına soğutun.
      NOT: Pişmiş silikon parçalar bir sonraki adıma geçmeden önce bir gün saklanabilir. Karanlıkta saklayın ve beyaz ışığa maruz bırakmayın.
    9. UV aydınlatıcısının pozlama aşamasına, UV lambasına bakan fotodirenç kaplı yüzeyle yumuşak pişmiş silikon parçalar koyun. İki parçayı, sırasıyla akış ve kontrol katmanları elde etmek için 200 W'lık bir lamba kullanarak, desen 1 ve 2'ye sahip bir fotomaske aracılığıyla 15 saniye boyunca ayrı ayrı UV'ye maruz bırakın.
      DİKKAT: Güvenlik gözlükleri takın ve UV ışığına doğrudan maruz kalmaktan kaçının. Bu aşamada odadaki beyaz ışığı açmayın.
    10. Açıkta kalan iki silikon parçayı, kaplanmış tabakası yukarı bakacak şekilde, sırasıyla 65 ° C'de ve ardından 95 ° C'de sırasıyla 1 dakika ve 10 dakika pişirin. Bir sonraki adıma geçmeden önce parçaları oda sıcaklığına soğutun.
    11. Silikon parçalarını fotodirenç geliştirici çözeltisine (geliştiricinin izopropanolde 1: 3 seyreltilmesi) 20 dakika bekleterek desenleri geliştirin. Desen göründüğünde, parçaları saf izo-propil alkol (IPA) ile durulayın ve azot gazı (14 psi) kullanarak hafifçe kurutun.
      DİKKAT: İnsan maruziyetini önlemek için bu kimyasal işlem için iyi havalandırılan bir ortam kullanın. Beyaz ışığı yalnızca özellikler geliştirildikten ve IPA ile durulandıktan sonra kullanın.
    12. Silikon parçalarını, kaplanmış yüzey yukarı bakacak şekilde bir kurutucuda tutun. Küçük bir plastik kap veya cam bir slayt üzerine 50 μL saf trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silan dökerek parçaları silan buharlarına maruz bırakın. Bardağı / kaydırağı bir kurutucunun içine yerleştirin ve 2 saat boyunca inkübe edin.
      DİKKAT: Silan buharına doğrudan maruz kalmaktan kaçının. Silan buharı arıtımı için daima kapalı bir oda kullanın.
      NOT: Gerekirse, geliştirilen silikon parçalar bir sonraki adıma geçmeden önce 1-2 gün saklanabilir.
  2. PDMS çip imalatı
    1. Elastomer tabanı kürleme maddesi ile 10: 1 oranında karıştırarak PDMS'yi plastik bir kapta yapın. İçeriği 3 dakika boyunca sürekli karıştırarak iyice karıştırın. Karıştırma, PDMS karışımında çok fazla hava kabarcığı oluşturacaktır.
    2. Tüm hava kabarcıklarını gidermek için PDMS karışımını bir kurutucuda 30 dakika boyunca gazdan arındırın.
      DİKKAT: Kabarcıklar arızalı ve işlevsel olmayan cihazlara neden olabileceğinden, hava kabarcıklarının özelliklere dökülmeden önce PDMS karışımından çıkarıldığından emin olun.
    3. Silikon gofretleri kontrol tabakasıyla (desen 2) bir Petri kabına yerleştirin. Herhangi bir kabarcık oluşumunu önlemek için silikon parça üzerine 5 mm kalınlığında bir PDMS karışım tabakasını yavaşça dökün.
    4. PDMS döküm işlemi sırasında oluşan ek kabarcıkları gidermek için PDMS karışımını bir kurutucuda gazdan arındırın.
    5. Silikon gofreti, gofreti tutmak için 200-500 mTorr vakum basıncı uygulayarak akış katmanlı (desen 1) iplikçi mandren üzerine yerleştirin. Silikon gofret üzerine ~1 mL PDMS dökün ve ~80 μm kalınlığında bir tabaka elde etmek için 5 s boyunca 500 rpm'de bir spin kaplayıcı ve ardından 30 s için 1.000 rpm kullanarak kaplayın.
    6. İki silikon gofreti spin kaplı PDMS ile pişirin ve PDMS katmanlarını 50 °C'de sıcak hava konveksiyonlu fırında 6 saat boyunca dökün. Pişirdikten sonra, parçaların oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
    7. 5 mm kalınlığındaki PDMS tabakasını kontrol tabakasının etrafındaki silikon parçadan (desen 2) keskin bir bıçak kullanarak kesin ve silikon substrattan soyun.
    8. PDMS membran sapmaları için immobilizasyon kanalını ve izolasyon kanalı girişlerini gaz hatlarına bağlamak üzere PDMS bloğunun rezervuarında bir Harris zımba kullanarak ~ 1 mm çapında iki delik açın.
    9. Silikon parçayı, spin kaplı PDMS tabakası ile desen 1 (akış katmanı) üzerinde, PDMS kaplı yüzey yukarı bakacak şekilde plastik bir tepsiye yerleştirin. Delikli PDMS bloğunu, kalıplanmış tarafı yukarı bakacak şekilde tepside desen 2 (kontrol katmanı) ile tutun.
    10. Plastik tepsiyi bir plazma temizleyicinin içinde tutun ve iki PDMS yüzeyini düşük vakum (200-600 mTorr) altında 2 dakika boyunca 18 W hava plazmasına maruz bırakın. Oda parlak mora dönene kadar vakum uygulayın. Plazma renginin değiştiğini görmek için bu adımı düşük ışık altında gerçekleştirin.
    11. Plazma ile işlenmiş iki bloğu çıkarın ve desen 1 ve 2'nin plazma ile işlenmiş yüzeylerine birlikte bastırarak blokları yavaşça bağlayın. Yapıştırılmış desenleri sıcak hava konveksiyonlu fırında 50 °C'de 2 saat pişirin.
    12. Yapıştırılan cihazı fırından çıkarın. Bağlı cihazı desen 1 ve desen 2 ile silikon gofretten kesin ve Harris zımbayı kullanarak akış katmanının giriş ve çıkış rezervuarlarındaki delikleri delin.
    13. Bağlı PDMS bloğunu, akış tabakası yukarı bakacak şekilde plastik bir tepsiye yerleştirin. Aynı tepside temiz bir kapak camı (#1,5) bulundurun. Blokları ve kapak camını 2 dakika boyunca 18 W hava plazmasına maruz bırakın. Menekşe bir oda görmek için vakum basıncını ayarlayın.
      NOT: Bu adım, plazma renginin değiştiğini görmek için düşük ışıkta yapılmalıdır. Kapak camını temizlemek için IPA ile yıkayın ve 14 psi'de azot gazı kullanarak fön ile kurutun.
    14. Plazmaya maruz kalan PDMS bloğunu kapak camının üzerine yerleştirin ve yapıştırılmış yapıyı 2 saat boyunca 50 ° C'de bir fırında pişirin. Gelecekteki herhangi bir deney için cihazı temiz bir odada saklayın.

2. PDMS membran astarlama

  1. Cihazı alın ve bir stereomikroskop üzerine koyun ve tüpleri takın. Mikro esnek boruyu (iç çap ~5 mm, dış çap ~8 mm) bir uçtaki sıkıştırılmış azot gazı hattına bağlayın. Diğer uca üç yönlü bir konektör bağlayın. Üç konektörlerin 1 ve 2 numaralı tüpleri, sırasıyla tuzak ve izolasyon membranlarına bağlanacaktır.
  2. İki mikro esnek boruyu (iç çap ~1,6 mm, dış çap ~5 mm) üç yönlü durdurmanın iki çıkış portuna bağlayın. İki tüpün diğer ucunu 8 mm uzunluğunda 18 G iğneye bağlayın.
  3. Giriş portundan bir mikropipet kullanarak akış katmanını M9 tamponuyla doldurun. Her iki tüpü de iğneye bağlı uçtan DI suyuyla doldurun. İki iğneyi sırasıyla izolasyon ve yakalama membranını bağlayarak delinmiş deliklere yerleştirin.
  4. Azot gazı regülatörünü 14 psi'de açın ve suyu kontrol katmanlarındaki mikroakışkan kanallardan, yani tuzak ve izolasyon membranlarından cihaza itmek için üç vanayı tüp 1'den çevirin.
  5. Her iki kanalda da herhangi bir hava damlacığı bulunmadan suyun kanalı doldurmasını bekleyin. Kanallar tamamen suyla doldurulduktan sonra, kanalların astarlanmış olduğu kabul edilir.
  6. Kanallar suyla doldurulduktan ve astarlandıktan sonra üç yönlü stopcock'u kullanarak basıncı serbest bırakın. Astarlama, akış katmanında kabarcıklara yol açabilir, akış kanalından ek ortam akıtarak kabarcıkları çıkarın.

3. C. elegans bakım ve senkronizasyon

NOT: C. elegans suşları: Çalışmada vulvalgelişimi 32 için PS3239 (dpy-20(e1282) syIs49 IV [MH86p(dpy-20(+) + pJB100(ZMP-1::GFP)]), PVD gelişimini izlemek için jsIs609 (mec7p::MLS(mitokondriyal matriks lokalizasyon sinyali)::GFP)33 transgenleri ve PVD gelişimini izlemek için wdIs51 (F49H12.4::GFP + unc-119(+)) kullanılmıştır. Standart C. elegans kültür ve bakım protokolü35 izlendi.

  1. C. elegans'ı nematod büyüme ortamı (NGM) Petri plakaları üzerinde 22 ° C'de besin kaynağı olarak E. coli OP50 ile büyütün. C. elegans suşlarını, birkaç hermafroditi tekrar tekrar aktararak veya birkaç hayvanla az miktarda agar'ı OP50 çimli yeni bir NGM plakasına parçalayarak koruyun.
  2. 3-5 gün sonra, hayvan büyümesi ve C. elegans yumurtaları için NGM plakasını kontrol edin. Bir plakadan yaklaşık 30 yumurta toplayın ve OP50 çimli taze bir NGM plakasına aktarın.
  3. Hayvanları görüntüleme için senkronize etmek için, yumurtadan çıkmamış tüm yumurtaları her 2 saatte bir plakadan taze bir tabağa aktarın ve 22 ° C'de tutun. Her plakada yaklaşık 15-20 yumurta yumurtadan çıkacaktır.
  4. Larva 2 (L2) ve larva 3 (L3) aşamaları için yumurtadan çıktıktan sonra hayvanları sırasıyla 14-16 saat ve 28-30 saat arasında seçin. Hayvanları görüntüleme için mikroakışkan cihaza aktarın. Uzun vadeli büyüme ve görüntüleme deneyleri için hayvanı cihazın içinde tutmak üzere bir sonraki bölümde açıklandığı gibi gıda arzı ekleyin.

4. C. elegans büyüme ve görüntüleme mikroakışkan cihaz içinde büyüme

  1. Bir büyüme ve görüntüleme mikroakışkan cihazını ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine monte edin ve izolasyon membranlarını ve immobilizasyon membranını bağladıktan sonra, düşük büyütmelerde (4x veya 10x) desen 2'yi görüntüleyin. Kanalların temiz damıtılmış suyla doldurulduğundan emin olun.
  2. 10 mL 1 M potasyum sitrat pH 6.0, 10 mL eser metal çözeltisi, 3 mL 1 M CaCl2, 3 mL 1 M MgSO4 kullanarak taze bir 1 L S ortamı çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi steril koşullar altında hazırlayın. S ortamını otoklav yapmayın.
  3. Denemeden 10 dakika önce akış kanalını büyüme ortamı (S ortamı) ile doldurun. Akış kanalında hava kabarcıklarından kaçının. Hava kabarcıklarını gidermek için gerekirse ek ortam akıtın.
  4. Bir mikropipet kullanarak 10 μL S ortamındaki bir NGM plakasından gerekli gelişim aşamasından tek bir hayvan seçin ve hayvanı giriş deliğinden akış kanalına itin.
  5. Düşük büyütme hedefi kullanarak akış kanalındaki hayvan konumunu izleyin. Hayvanı itmek ve iki izolasyon membranı arasında kısıtlanmış akış kanalı içinde konumlandırmak için giriş veya çıkıştan ek ortam akıtın.
  6. İzolasyon kanallarına 14 psi basınç uygulamak için üç yönlü durdurma musluğunu açın ve membranları akış kanalına doğru itin.
    NOT: Membran, akış kanalını kısmen kapatır ve hayvan hareketini iki izolasyon membranı arasındaki bölgeye kısıtlar.
  7. 250 mL L Et suyu aşılamak için çizgili bir plakadan tek bir E. coli OP50 kolonisi kullanın (2.5 g bakto-tripton, 1.25 g bakto-maya, H2 O'da1.25g NaCl). Aşılanmış kültürü bir gecede 37 ° C'de büyütün.
  8. OP50 kültürünün Aliquot 500 μL'si 1,5 mL steril santrifüj tüplerine dönüşür ve stoğu ve alikotu 4 °C'de 2 hafta boyunca saklar.
  9. OP50 kültürünü 5 dakika boyunca 1,3 x g'de santrifüjleme ile toplayın. Peleti 1 mL taze S ortamı (0.5x seyreltme) ile çözün ve 3-4 gün boyunca oda sıcaklığında saklayın. Bu seyreltilmiş OP50'yi mikroakışkan cihazların içinde C. eleganları beslemek için kullanın.
  10. S ortamının akış kanalındaki buharlaşmasını azaltmak için giriş ve çıkış rezervuarlarının üzerine bir damla S ortamı bırakın.
  11. Seyreltilmiş OP50 çözeltisini 10 μL'lik bir mikropipet içinde alın. OP50 çözeltisiyle doldurulmuş mikro ucu pipetten çıkarın ve ucu giriş haznesine bastırarak takın. Ardından, 10 μL gıda çözeltisi içeren başka bir mikropipet ucu yerleştirin ve çıkış haznesine yerleştirin.
  12. Gıda çözeltilerinin hava boşluğu olmadan sürekliliğini sağlamak için parmağınızı kullanarak basınç uygulayarak uç kafasını kapatın. Mikropipet ucunu OP50 çözeltisi ile 3-4 günden eski olmayan her gün değiştirin.
  13. Her iki uca da ilave 20-30 μL gıda çözeltisi doldurun. Mikropipet ucuna yiyecek çözeltisi ekleyin veya çıkarın ve degradeyi hayvanı akış kanalına itecek şekilde ayarlayın ve görüntüleme için yakalama zarının altındaki hayvanın konumunu ayarlayın.
  14. Parlak alan görüntülerini kullanarak akış kanalındaki kısmen kapalı izolasyon membranları boyunca sürekli olduğundan emin olmak için bakteri akışını izleyin.
    NOT: Bakteri akışının yokluğunda, hayvanlar iki izolasyon zarı arasındaki akış kanalındaki mevcut bakterileri yiyebilir. Kanalda bakteri olmaması veya akış olmaması durumunda, giriş ve çıkıştaki iki mikropipet ucunu, taze hazırlanmış gıda malzemeleriyle doldurulmuş yeni pipet uçlarıyla değiştirin.

5. C. elegans immobilizasyon ve görüntüleme

  1. C. elegans yakalama membranı altında immobilizasyon
    1. Büyüme kanalında tek bir hayvanı düşük büyütmelerde bulun. Giriş ve çıkış rezervuarlarına bağlı iki mikropipet ucundaki gıda çözeltisi yüksekliklerini ayarlayın. Akış kanalındaki hidrostatik basınç farklarını kullanarak hayvanı istenen yönde itin.
    2. Hayvanı yakalama zarının merkezine yerleştirin ve düşük büyütme hedefi (4x) kullanarak yüzme davranışını izleyin.
    3. Tuzak kanalındaki basıncı yavaşça artırmak için üç yönlü durdurma musluğunu çevirin. Hayvanı, tuzak zarının altında, büyüme kanalı sınır duvarı boyunca düz bir duruşta hareketsiz hale getirin.
      DİKKAT: Hayvanı akış kanalı boyunca Z veya U büküm pozisyonunda tutsak etmekten kaçının. Bu, hayvan vücudunun daha fazla basınçla sıkılmasına neden olur ve sağlığına kalıcı zarar verir.
  2. C. elegans görüntüleme ve membrandan serbest bırakma
    1. Cihazı mikroskop aşamasına taşıyın ve yükleyin. Yüksek çözünürlüklü parlak alan, diferansiyel görüntüleme kontrastı (DIC) veya floresan görüntüleme (Ek Şekil 1) için gerekli tüm optik bileşenlerle (objektif, ışık kaynağı, floresan filtreleri ve bir dedektör) istenen görüntüleme ayarlarında ters çevrilmiş bir mikroskop kurun.
    2. Hücresel ve hücre altı olayları yakalamak için tek veya birkaç hızlandırılmış floresan görüntüsü elde edin.
    3. C. elegans nöronlarının floresan görüntülerini, dönen bir disk mikroskobunda 60x, 1.4 sayısal açıklık (NA) hedefi, % 7-10 lazer gücüne sahip 488 nm dalga boyu lazeri, bir CCD kamera kullanarak gelişimlerinin bir fonksiyonu olarak elde edin. Mikroskopla birlikte verilen yazılımı kullanarak hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin ve saniyede 4 kare hızında görüntüler elde edin (Ek Şekil 1).
    4. Görüntülerin elde edilmesinden sonra, tuzak basıncını serbest bırakın ve hayvanın hareketini düşük büyütmelerde izleyin - 4x ve 10x. Hayvanı, membranları izole ederek tanımlanan bölgede sınırlı tutun (deney boyunca 14 psi'nin altında tutulur).
    5. Büyüme kanalında yavaş bir yerçekimi kaynaklı gıda akışına devam etmek için iki mikropipet ucundaki gıda çözeltisinin hacmini ayarlayın. Bu gıda akışı, giriş ve çıkıştaki mikropipetlerdeki gıda çözeltilerinin seviyelerinin ayarlanmasıyla elde edilir (tipik olarak 1-5 mm yükseklik farkı).
    6. Büyüme kanalındaki bakterilerin akış modelinden parlak bir alan altındaki akışı görselleştirin.
      NOT: Akış yokluğunda, hayvan mevcut OP50 bakterilerini yer, kanal net görünür ve hayvan birkaç saat içinde aç kalır. Açlıktan ölen bir hayvan tipik olarak yüksek otofloresan geliştirir, hızlandırılmış floresan görüntüleri elde edildiğinde kolayca gözlemlenebilir. Bu tür olayların hayvan fizyolojisi üzerinde zararlı etkileri vardır ve deneylerde kaçınılmıştır.
    7. Aynı kişinin birden çok zaman noktasında floresan/DIC/parlak alan görüntülerini elde etmek için önceden belirlenmiş bir zaman aralığından sonra 5.2.1-5.2.3 arasındaki adımları yineleyin.
    8. Görüntüler aynı bireysel hayvandan istenen birden fazla zaman noktasında elde edildikten sonra, izolasyonu ve yakalama basıncını serbest bırakın. Kanalı M9 tamponuyla yıkayın ve hayvanı giriş rezervuarından geçirin. Hayvanı rezervuardan kurtarın ve daha fazla sağlık izlemesi için hayvanı taze bir NGM plakasına yerleştirin.
    9. Bakterileri uzaklaştırmak için kanalı birkaç kez M9 tamponuyla yıkayın. Akış kanalını% 70 etil alkol ile durulayın (damıtılmış suda seyreltilmiş). Bir şırınga kullanarak havayı iterek kanalları kurulayın. Gelecekte tekrar tekrar kullanmak üzere cihazı kuru tozsuz bir yerde saklayın.
  3. Görüntü analizi ve istatistikleri
    1. Tiff görüntü analizi için FIJI ImageJ yazılımını kullanın. Fiji ImageJ'de wdIs51 hayvanlarından PVD hızlandırılmış görüntülerin tiff görüntülerini açın. Görüntü sekmesini seçerek birincil işlemleri gösteren z-düzlemleri yığınından en iyi düzlemleri ayıklayın > Z projesi > Yığınlar'ı seçin.
    2. Tüm görüntü serisini tarayın ve hayvan görüntü çerçevelerinin üst üste binen bölümlerini kullanarak tüm nöronal süreçleri başarıyla kapsayan belirli görüntü çerçevelerini bulun. FIJI araç çubuğundan Eklenti > > Hücre Sayacını Analiz Et'i seçin. Bu, farklı dalları numaralandırmak ve seçilen her nöronun sayısını tutmak için bir pencere açacaktır.
    3. Type1> > Sayaçları Başlat'ı seçin, sonra ikincil dalları işaretleyin. Ardından Tür 2'yi seçin ve Kuvaterner'i işaretleyin, tüm dalların sayılarını gösteren Sonuçlar penceresine tıklayın (Ek Şekil 2). Bu yöntem, zaten sayılan dalları görüntüler.
    4. Çakışan bir sonraki görüntüyü açın ve kalan dalları sayın. Bu işlem çift sayımı önleyecek ve her işlemin sayılmasını sağlayacaktır. C. elegans'ın erken larva aşamalarında bulunan toplam birincil dal sayısını tanımlayın ve sayın. Yaşlı hayvanlarda ikincil ve kuaterner süreçler için görüntüler için benzer analizler yapın.
      NOT: Yetişkinler, vücut duvarı kaslarında innerve olan birçok süreç gösterir ve sayılması zor olabilir. Her işlemin yalnızca bir kez sayıldığından emin olun.
    5. PVD hücre gövdesinden (CB) PVC CB'ye parçalanmış bir çizgi çizerek wdIs51 hayvanlarındaki PVD hücre gövdeleri arasındaki mesafeyi hesaplayın. Larva 4 (L4) evre hayvanları için, hücre gövdeleri birbirinden çok uzaktır ve 60x objektifle görüntülendiğinde aynı çerçevede değildir.
    6. ImageJ'den Yığınlar > Z projesi > Görüntü sekmesini kullanarak baştan kuyruğa tüm hayvan uzunluğunu kapsayacak şekilde yığından üst üste binen görüntüleri seçin. PVD ve PVC CB'ler arasındaki nöronal süreç boyunca parçalı çizgiler çizin.
    7. ImageJ > Analiz > Measure'ı kullanarak tüm segmentlere ayrılmış çizgilerin uzunluklarını ölçün. Her zaman noktası için PVD ve PVC CB'ler arasındaki toplam mesafeyi hesaplamak üzere tüm segmentlerin uzunluklarını ekleyin.
    8. jsIs609 hayvanlarında TRN'lerin nöron uzunluğu için, görüntüleri Fiji'ye yükleyin. Arka lateral mikrotübüller (PLM'ler; çözünür GFP ile görülebilir) boyunca hücre gövdesinden ilk mitokondrinin merkezine kadar parçalı bir çizgi çizin. İlk mesafe değeri için çizginin uzunluğunu hesaplayın.
    9. Birinci mitokondrinin merkezinden ikinci mitokondriye kadar parçalı bir çizgi çizin. Bu işlemi, nöronal süreç uzunluğunun sonuna kadar her bir mitokondri çifti için tekrarlayın. Toplam nöronal süreç uzunluğunu hesaplamak için tüm uzunlukları ekleyin.
    10. Hücre soyağacı analizi için, Fiji'deki tüm vulval görüntüleri yükleyin ve hücrelerin en iyi odak görüntüsünü, birden fazla z-düzleminin hızlandırılmış görüntülerinden çıkarın.
    11. Verileri ortalamanın standart hatası (SEM) ± olarak temsil edin. İkiden fazla numune için tek yönlü ANOVA veya bir çift numune için iki örneklemli bir t-testi kullanarak istatistiksel anlamlılığı hesaplayın. Anlamlılığı p değeri 0,05 (*), p değeri 0,005 (**) < ve p değeri 0,05 (ns, anlamlı değil) < > belirtin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cihaz karakterizasyonu: Büyüme ve görüntüleme cihazı, geri dönüşümsüz plazma bağı kullanılarak birbirine bağlanmış iki PDMS katmanından oluşur (Şekil 1). 10 mm uzunluğunda ve 40 μm veya 80 μm yüksekliğinde olan akış tabakası (desen 1), hayvanı sıvı kültürde büyütmemizi sağlar (Şekil 1A). Yakalama tabakası (desen 2), yüksek çözünürlüklü görüntüleme için hayvanı hareketsiz hale getirmek için 2 mm genişliğinde bir zara (Şekil ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, sürekli gıda arzı ve gelişimi sırasında tek bir hayvanın yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi ile C. elegans yetiştirmek için basit bir mikroakışkan cihazın üretimi ve kullanımı için bir protokol tanımlanmıştır. Bu üretim süreci basittir ve steril olmayan bir ortamda yapılabilir. Tozsuz bir ortam, üretim aşamalarında kritik öneme sahiptir. Toz parçacıklarının varlığı, iki yapıştırma yüzeyi arasında yanlış temasa yol açacak ve C. elegans hareketsiz hale getirilirken yüksek basınç uygulaması sıra...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.M. ve S.P.K., mikroakışkan büyüme ve görüntüleme cihazı hakkında bekleyen bir patentin yazarlarıdır (Patent başvuru numarası 640/CHE/2011).

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CIFF görüntüleme tesisi NCBS'ye, DST - Nanoteknoloji Merkezi tarafından desteklenen konfokal mikroskopların kullanımı için teşekkür ederiz (Hayır. SR/55/NM-36-2005). DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK ve Gautam Menon) tarafından desteklenen eğirme diski ve HHMI-IECS hibe numarası 55007425 (SPK) tarafından sağlanan araştırma fonlarına teşekkür ederiz. HB101, PS3239 ve wdIs51 suşları, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) tarafından sağlanmıştır. S.P.K., Mike Nonet'in laboratuvarında jsIs609'u yaptı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
18 G iğnelerSigma-Aldrich, Bangalore, HindistanÖlçer 18
3 muslukCole-ParmerWW-30600-02Luer kilitli Masterflex bağlantı parçası
CCD kameraAndor TeknolojisiEMCCD C9100-13no
Devre kartı filmiFine Line Imaging, Colorado, ABDTasarımlar inç başına 65.024 nokta (DPI)
ile basılmıştırKonveksiyonlu FırınMeta-Lab Scientific Industries, HindistanMSI-5
LamellerMavi stat mikroskobik kapak camı22mm x 10Gms
EtanolHi media
Harris tek çekirdekli zımba 1mmQiagenZ708801
HeksametildisilazaneSigma-Aldrich, Bangalore, Hindistan440191
Sıcak plaka  IKARCT BS 22
İzopropanolFisher Scientific26895
KOHFisher Scientific
Lazer Tarama MikroskobuZEISSLSM 5 LIVE
Mikropipet uçlarıTarsons0.5-10 & mikro; L mikropipet uçları gıda temini için kullanılır
Negatif Fotorezist-1MicrochemSU8-2025http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negatif Fotorezist-2MicrochemSU8-2050http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Azot gazıYerel TedarikçiTicari azot gazı7 metreküp silindir hacmi
PDMS (Kürleme çözeltisi)Dow Corning Corporation, MI, ABD&nbsp; Sylgard kürlemesolüsyonu kürleme maddesi
Petri plakalarıPraveen Scientific Corporation
Plazma temizleyiciHarrick Plasma, NY, ABD&nbsp; PDC-32G
Tıraş bıçağı ve bıçaklarıLister cerrahi bıçak
Silikon Elastomer (Taban)Dow Corning Corporation, MI, ABDSylgard 184 bazelastomer taban
Silikon tüplerFisher Scientificİç çapı 1,59 mm ve dış çapı 3,18 mm olan plastik tüpler
Silikon gofretÜniversitesi Gofret, MA, ABD[100] yönlendirme, 4 inç çap100 mm çaplı gofretten küçük parçalar (2 mm ve kez; 2 mm) kesildi
Spin CoaterSPS-Europe B.V., HollandaSPIN 150
Eğirme Diski mikroskobuPerkin Elmer ultra görünümlü VOX sistemiCSU-X1-A3 NSistem dört (405/488/561/640 nm) lazerle donatıldı ve Volocity yazılım paketi ile kontrol edildi.
SU8 geliştiriciMicrochem, MA, ABDSU8 Geliştirici
Trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silanSigma-Aldrich, Bangalore, Hindistan448931Trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silan buharı toksik
UV lambasıdırOriel Instruments, Bangalore, Hindistan200 Watt ve kolimasyonlu UV ışık kaynağı
Volocity yazılımıPerkin-ElmerGörüntü analiz

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435(2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), Copenhagen, Denmark. 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037(2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023(2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530(2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192(2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, Clifton, N.J. 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190(2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500(2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499(2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, Suppl 1 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Developmental Biology. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), New York, N.Y. 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938(2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Microfluidic ChipCaenorhabditis ElegansLong Term ImagingWorm ImmobilizationPDMS DeviceNeuronal Process GrowthDendritic ArborizationNitrogen Gas ImmobilizationTime Lapse ImagingDevelopmental Biology

İlgili makaleler