Bu protokol, NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü çeviri ribozomal mRNA'ları izole etmeyi amaçlamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücre Tipine Özgü RNA'ları, Hücre Sıralama Olmadan Dondurulmuş Heterojen Doku Örneklerinden İzole Edin
Bu makalede
Özet
Özet
Hücresel heterojenlik, transkriptom düzeyinde karmaşık dokuların işlevini anlamada zorluklar yaratır. Hücre tipine özgü RNA'ların kullanılması, dokuların heterojenliğinin neden olduğu potansiyel tuzakları önler ve güçlü transkriptom analizini serbest bırakır. Burada açıklanan protokol, ribozoma bağlı RNA'ları, hücre sıralaması olmadan karmaşık bir dokudaki az miktarda EGFP eksprese eden hücrelerden izole etmek için Translating Ribozom Afinite Saflaştırma (TRAP) yönteminin nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu protokol, yakın zamanda mevcut olan NuTRAP fare modelini kullanarak hücre tipine özgü RNA'ları izole etmek için uygundur ve RNA'ları herhangi bir EGFP eksprese eden hücreden izole etmek için de kullanılabilir.
Giriş
RNA dizilimi (RNA-seq) ve mikroarray dahil olmak üzere yüksek verimli yaklaşımlar, gen ekspresyon profillerinin genom çapında sorgulanmasını mümkün kılmıştır. Kalp, beyin ve testis gibi karmaşık dokular için, hücre tipine özgü veriler, RNA'ların tüm dokudaki kullanımını karşılaştıran daha fazla ayrıntı sağlayacaktır 1,2,3. Hücresel heterojenliğin etkisinin üstesinden gelmek için, Translating Ribozom Afinite Saflaştırma (TRAP) yöntemi 2010'ların başından berigeliştirilmiştir4. TRAP, ribozoma bağlı RNA'ları doku ayrışması olmadan spesifik hücre tiplerind....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Yapılan tüm hayvan deneyleri, Auburn Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUC) tarafından onaylanan protokolleri takip etti.
NOT: Aşağıdaki protokol, Gli1-CreERT2'den P28'de bir testis (yaklaşık 100 mg) kullanır; NuTRAP fareleri (Mus musculus). Reaktiflerin hacimlerinin, numune tiplerine ve doku sayısına göre ayarlanması gerekebilir.
1. Doku toplama
- Bir CO2 odası kullanarak fareleri ötenazileştirin,% 70 etanol ile karın yüzeyini sterilize edin.
- Alt karın bölgesini makasla açın ve testisleri çıkarın. Testisle....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Gli1-CreERT2 fare (Jackson Lab Stok Numarası: 007913) ilk olarak çift mutant fareler üretmek için NuTRAP muhabir faresi (Jackson Lab Stok Numarası: 029899) ile çaprazlandı. Her iki genetiği değiştirilmiş gen alellerini (yani, Gli1-CreERT2 ve NuTRAP) taşıyan farelere, üç enjeksiyon için günde bir kez, her gün tamoksifen enjekte edildi. Doku örnekleri, enjeksiyonun 1. gününden sonraki 7. günde toplandı. İmmünofloresan analizi, EGFP'nin testislerdeki int.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Tüm doku transkriptom analizinin yararlılığı, özellikle karmaşık heterojen dokuları incelerken azaltılabilir. Hücre tipine özgü RNA'ların nasıl elde edileceği, güçlü RNA-seq tekniğini ortaya çıkarmak için acil bir ihtiyaç haline gelir. Hücre tipine özgü RNA'ların izolasyonu genellikle mikromanipülasyon, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) veya lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) kullanılarak belirli bir hücre tipinin toplanmasına dayanır18. Diğer modern yüksek verimli tek hücreli t.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen NIH R00HD082686 tarafından desteklenmiştir. Endokrin Derneği Yaz Araştırma Bursu'na H.S.Z.'ye teşekkür ederiz. Ayrıca fare kolonisini yetiştirdiği ve koruduğu için Dr. Yuan Kang'a teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Actb | eurofins | qPCR primerleri | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (ileri astar/ters astar) |
| Biyoanalizör | Agilent | 2100 Biyoanalizör Cihazı | |
| cOmplete Mini EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü Kokteyl | Milipore | 11836170001 | |
| sikloheksimid | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primerleri | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (ileri astar/ters astar) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 mıknatıs | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tüpleri 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antikoru | Abcam | ab290 | |
| Cam öğütücü seti | DWK Yaşam Bilimleri | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN KİMYASAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primerleri | GACAGGAGCAGGAGGGTGTGTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (ileri astar/ters astar) |
| KCl | Biyolojik Bilimler | R005 | |
| MgCl < alt > 2 < / alt > | Biyobilimler | R004 | |
| Mikrosantrifüj tüpleri 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Fare Clariom S Testi mikrodizileri | Thermo Fisher Scientific Mikroarray | hizmeti | |
| NP-40 | Kırlangıç | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA İzolasyon Kiti | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNaz içermeyen su | yetiştirme hücreleri | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Rekombinant Ribonükleaz İnhibitörü | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primerleri | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (ileri astar/ters astar |
| Üst simge IV ters transkriptaz | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primerleri | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (ileri astar/ters astar) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
Kaynaklar
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
