Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak Anofel Sivrisineklerinde Plasmodium Sporozoitlerin Tespiti

2.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63158

⸱

30 Eylül 2021

 ,  ,  ,  , 
1Mahidol Vivax Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, 2Department of Molecular Tropical Medicine & Genetics, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, 3Department of Internal Medicine, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 4Mahidol Vivax Research Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, sivrisineklerde tükürük bezi sporozoitlerini tespit etmek için sandviç enzime bağlı bir immünosorbent testini tanımlar. Kolayca bulunabilen monoklonal antikorları kullanan yöntem, Plasmodium falciparum veya Plasmodium vivax taşıyan sivrisineklerin uygun maliyetli, yüksek verimli tespitini sağlar. Yöntem, vektör araştırmaları da dahil olmak üzere sıtma bulaşma araştırmaları için uygundur.

Özet

Plasmodium sporozoitler, insanları enfekte eden sıtma parazitlerinin enfektif aşamasıdır. Dişi Anofel sivrisineklerinin tükürük bezlerinde bulunan sporozoitler, kanla beslenme sırasında sivrisinek ısırıkları yoluyla insanlara bulaşır. Sivrisinek tükürük bezlerinde sporozoitlerin varlığı bu nedenle sivrisinek bulaşıcılığını tanımlar. Bir Anofel sivrisineğinin Plasmodium sporozoitleri taşıyıp taşımadığını belirlemek için, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) yöntemi, sporozoitlerin ana yüzey proteini olan Plasmodium circumsporozoite proteinini (CSP) tespit etmek için standart bir araç olmuştur. Bu yöntemde, her bir sivrisineğin göğüs kafesi ile birlikte baş, karından ayrılır, homojenize edilir ve Plasmodium falciparum'a özgü CSP'nin ve Plasmodium vivax'ın iki alt tipinin her biri olan VK210 ve VK247'nin varlığını tespit etmek için bir sandviç ELISA'ya tabi tutulur. Bu yöntem, sivrisinek enfeksiyonunun mevsimsel dinamikleri ve çalışma alanlarındaki başlıca sıtma vektörlerinin türleri dahil olmak üzere sıtma bulaşmasını incelemek için kullanılmıştır.

Giriş

Plasmodium sporozoitler, sivrisineklerdeki sıtma parazitlerinin bulaşıcı aşamasıdır. Sporozoitler insanlara sivrisinek ısırıkları yoluyla verilir. Sivrisinekte, sporozoitler ilk olarak orta bağırsak duvarındaki ookistlerin içinde oluşur. Hazır olduklarında hemokoele salınırlar ve sivrisinek tükürük bezlerine giderler. Orada olgunlaşırlar ve kanla beslenme sırasında insanlara bulaşmaya hazır hale gelirler. İnsanlarda, sporozoitler dermiste biriktirilir. Daha sonra kan damarına girerler ve hepatositlerde enfeksiyon oluşturmak için karaciğere ulaşmak için kan dolaşımı boyunca hareket ederler 1,2.

Sivrisinek tükürük bezlerinin sporozoit enfeksiyonunu belirlemek için üç farklı yöntem kullanılmıştır. İlk yöntem, tükürük bezlerinin diseksiyonu ve ardından sporozoitlerin ışık mikroskobu altında doğrudan incelenmesidir. Bu yöntem, Anofel sivrisinek tükürük bezlerindeki sporozoitleri tespit etmek ve ölçmek için altın standarttır3. Bununla birlikte, hem diseksiyon hem de mikroskobik inceleme konusunda iyi eğitimli bir teknisyen gerektirir. Ayrıca, Plasmodium türlerini ve CSP alt tiplemesini belirlemek için kullanılamaz (P. vivax için)4,5. İkinci yöntem, sivrisinek gövdesinin üst kısmındaki Plasmodium DNA'yı tespit etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanır6. PCR'nin özgüllüğü göz önüne alındığında, parazitin hem türü hem de alt tiplemesi mümkündür 7,8,9,10. PCR giderek daha fazla kullanılmasına rağmen, nispeten pahalı ekipman ve iyi eğitimli personel gerektirir. Plasmodium'a özgü circumsporozoite proteinini (CSP) tespit etmek için son yöntem olan ELISA, otuz yıldır temel dayanak noktası olmuştur 11,12,13. CSP hem ookist sporozoitlerinde hem de tükürük bezi sporozoitlerindebulunur 12,14. Spesifik antikorlar kullanarak, bu yöntem Plasmodium türlerinin tanımlanmasına ve P. vivax sporozoitlerin CSP alt tiplemesine izin verir. Bu testin mantığı, sıtma bulaşmasını anlamak (yani sporozoit enfeksiyon oranını belirlemek) için çok sayıda yabani sivrisineği incelemek için basit bir yüksek verimli testin gerekliliğidir.

ELISA yönteminin mikroskobik incelemeye göre iki önemli avantajı vardır. İlk olarak, araştırmacıların sivrisinek örneklerini örnek işleme için hazır olana kadar tutmalarına izin verir. İkincisi, ELISA yöntemi, türe özgü monoklonal antikorlar aracılığıyla Plasmodium türlerini ayırt etmek için kullanılabilir. Ek olarak, ELISA daha fazla sayıda sivrisinek örneğini barındırabilir ve çok daha yüksek bir verime izin verir15. Sporozoit DNA'sını tespit eden PCR ile karşılaştırıldığında, ELISA prosedürü daha fazla zaman alır ancak daha az maliyetlidir16. Burada tarif edilen ELISA testi, sivrisinek enfektivitesini belirlemek ve P. falciparum'un CSP'sini ve P. vivax, VK210 ve VK247'nin iki CSP varyantının her birini ayrı ayrı tespit etmek için geliştirilmiştir. Bu ELISA yöntemi, sivrisinek enfeksiyonunun mevsimsel dinamiklerini belirlemek ve 12,13,17,18 alanındaki başlıca sıtma vektörlerinin türlerini belirlemek için birçok çalışmada kullanılmıştır. Bu testi gerçekleştirmek için, bir ELISA plaka okuyucu ile donatılmış standart bir laboratuvar yeterlidir.

Genel yaklaşım Şekil 1'de özetlenmiştir. Bu sandviç ELISA'da, her bir Plasmodium türü/alt tipi için spesifik olan birincil (yakalama) monoklonal antikor (mAb) ilk olarak ELISA plakasını kaplamak için kullanılır. Her plaka tek bir yakalama mAb ile kaplanmıştır. mAb'nin işlevi, sivrisinek homojenatlarında karşılık gelen CSP antijenini yakalamaktır. Antijen yakalama ve plaka yıkamalarından sonra, yakalama mAb'sine bağlı CSP'nin varlığını tespit etmek için peroksidaz ile işaretlenmiş ikinci bir CSP'ye özgü antikor kullanılır. Peroksidaz tarafından katalize edilen kimyasal reaksiyon, CSP için pozitif kuyularda renk gelişimi ile sonuçlanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Reaktiflerin hazırlanması

NOT: Bu protokolde kullanılan ekipman, reaktifler ve diğer sarf malzemelerinin listesi için Malzeme Tablosuna ve çözeltilerin ve bileşimlerinin listesi için Tablo 1'e bakın.

  1. Yakalama ve peroksidaz konjuge mAb'ler
    1. mAb'yi sulandırmak için, liyofilize mAb'yi 1: 1 damıtılmış su karışımında yeniden süspanse edin: 0.5 mg / mL'de gliserol. Tekrarlanan donarak çözülmeyi önlemek için gerektiği gibi alikotlar yapın ve bunları -20 °C'de saklayın.
  2. Engelleme tamponu (BB)
    1. 5 g ELISA dereceli kazeini 100 mL 0.1 N NaOH içinde çözerek bloke edici tamponu hazırlayın. Son hacmi 1.0 L'ye getirmek için 900 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ( Tablo 1'e bakınız).
    2. İndikatör olarak 0.02 g fenol kırmızısı ekleyin ve pH'ı HCl ile 7.4'e ayarlayın. BB'yi bir haftaya kadar 4 ° C'de saklayın veya -20 ° C'de uzun süreli depolama için 50 mL'ye alın.
  3. Pozitif kontroller
    1. Pozitif kontrolleri yeniden oluşturmak için, 1.000 μL BB ekleyerek liyofilize proteinleri yeniden sulandırın. Stok pozitif kontrol solüsyonlarının gerektikçe ayrılmasını sağlayın ve -20 °C'de saklayın.
    2. Seri seyreltme için, her bir pozitif kontrolü BB cinsinden nihai çalışma konsantrasyonuna aşağıdaki gibi daha fazla seyreltin: Pf, 2 pg/μL; Pv (VK210), 182 (pg/μL); Pv (VK247), 89 sayfa/μL.
      NOT: Pozitif kontrollerin konsantrasyonlarının tam konsantrasyonu bir partiden diğerine değişebilir. İhtiyaç duyulan tam konsantrasyon için ürün bilgi sayfasına bakın. Yukarıdaki çalışma konsantrasyonundan başlayarak pozitif kontrol konsantrasyonları, Pf için 2, 1, 0.5, 0.25, 0.13, 0.06 pg/μL'dir; PV210 için 182, 91, 46, 23, 11, 5,7 pg/μL; ve 89, 45, 22, 11, 5.6, 2.8 pg/μL PV247.
  4. Negatif kontroller
    NOT: İdeal negatif kontrol, test numuneleri ile aynı şekilde hazırlanan dişi Anofel sivrisineklerinin baş-toraks homojenatıdır. Bununla birlikte, BB negatif kontrol olarak da kullanılabilir.
    1. Negatif kontrol olarak BB ile, güvenilir pozitif okumalar için 2 kat absorbans eşiğini kullanın.

2. Sivrisinek örneği hazırlama

  1. Toplanan her yetişkin sivrisineğin başını ve göğüs kafesini steril bir tıraş bıçağıyla karından ayırın. Başı ve göğüs kafesi önceden etiketlenmiş 1,5 mL'lik bir santrifüj öğütme tüpüne yerleştirin. İstenirse 10 sivrisineğin havuz başlıkları ve göğüsleri.
    NOT: Numune hazırlama için, tipik olarak, enfekte bir sivrisinekten alınan tükürük bezi diseke edilecek ve CS-ELISA'ya tabi tutulacaktır. Bununla birlikte, toplanan sivrisineklerin başı ve göğüs kafesi, CS-ELISA'yı doğrudan (tükürük bezleri için diseksiyon yapmadan) gerçekleştirmek için de kullanılabilir12,13,19.
  2. Her tüpe 50 μL Öğütme Tamponu (GB) ekleyin ve numuneyi temiz bir havaneli (sabunla yıkanmış) ile homojenize edin. Kullanılmış havaneli 250 μL GB ile homojenize sivrisinek(ler)i içeren tüpe ~300 μL'lik bir nihai hacme kadar durulayın.
  3. Numuneyi kullanana kadar bir dondurucuda (-20 °C) saklayın veya ELISA'yı gerçekleştirmek için hemen devam edin.

3. Sporozoit ELISA

  1. Sporozoit ELISA çalışma sayfasını doldurun (Ek Materyal 1'e bakınız). Her CSP (Pf, Pv-210 veya Pv-247) için bir ELISA plakası hazırlayın.
  2. Antikoru PBS'de çözerek yakalama mAb çalışma solüsyonunu hazırlayın: 4 μg/mL Pf; 2 μg/mL Pv-210; 2 μg/mL Pv-247. Plaka başına 5 mL ilavesine dayalı olarak gereken hacimleri hesaplayın. Çözeltiyi nazikçe girdaplayın.
  3. Adım 3.2'den itibaren çalışan her mAb çözeltisinden 50 μL'yi ELISA plakasının her bir oyuğuna pipetleyin. Plakayı plastik bir kapakla örtün ve 30 dakika veya gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  4. Kuyu içeriğini aspire edin ve tüm sıvıyı çıkarmak için plakayı en az 5 kez kağıt havluların üzerine baş aşağı vurun.
    NOT: Bir aspirasyon sistemi (temiz uçlara bağlı çok kanallı vakumlu emme) mevcut değilse, antikorları lavaboya boşaltın ve ardından plakayı kağıt havluların üzerine hafifçe vurun.
  5. Plakadaki tüm kuyucukları doldurmak için 200 μL BB ekleyin. Plakayı plastik bir kapakla örtün. Plakayı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Kuyu içeriğini aspire edin veya boşaltın. Tüm sıvıyı çıkarmak için plakayı kağıt havluların üzerine 5 kez baş aşağı vurun.
  6. Sivrisinek homojenatını ve kumandayı aşağıdaki gibi plakaya yükleyin.
    1. H1 ve H2 kuyularına 50 μL pozitif kontrol ekleyin.
    2. C satırından G'ye kadar olan sütun 1 ve 2'deki kuyucuklara 50 μL BB ekleyin. Ardından, G1 ve G2 kuyularına 50 μL pozitif kontrol ekleyin. Pozitif kontrolün G1 ve G2'den başlayarak, ardından F1 ve F2'den C1 ve C2'ye kadar seri bir seyreltme yapın.
      NOT: Tüm pozitif kontrol kuyuları 50 μL içermelidir.
    3. A1, A2, B1 ve B2 kuyularına 50 μL BB (negatif kontrol) ekleyin.
    4. Her homojenat numunesinden 50 μL'yi Bilinmeyen (Unk) bir kuyuya ekleyin.
    5. Plakayı örtün ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  7. Yaklaşık 2 saat sonra alt tabakaları hazırlamaya başlayın. ABTS substrat 2 bileşenli kit için, substrat A ve substrat B'yi 1:1 oranında karıştırın.
    NOT: Tam 96 oyuklu bir plaka, 5 mL substrat A ve 5 mL substrat B gerektirir.
  8. 1 μg/mL'lik bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için sulandırılmış konjuge mAb'ye BB ekleyerek Pf, Pv-210 ve Pv-247 için peroksidaz etiketli mAb'lerin çalışma çözeltilerini hazırlayın.
    1. Plaka başına 5 mL çalışma eşleniği mAb çözeltisinin eklenmesine dayalı olarak gerekli hacimleri hesaplayın.
    2. Peroksidaz aktivitesini, adım 3.8'de yapılan peroksidaz etiketli mAb'nin 5 μL'sini, adım 3.7'de yapılan 100 μL substrat ile ayrı bir 1.5 mL'lik tüpte karıştırarak test edin. Yavaşça girdap.
      NOT: Berraktan yeşile hızlı bir renk değişimi olmalıdır, bu da peroksidaz enziminin ve substratların çalıştığını gösterir.
  9. Kuyu içeriğini aspire edin veya boşaltın ve tüm sıvıyı çıkarmak için plakayı kağıt havluların üzerine 5 kez baş aşağı vurun.
  10. Kuyuları 200 μL PBS-Tween ile iki kez yıkayın, kuyu içeriğini aspire edin ve plakaya her biri 5 kez vurun.
  11. Her bir oyuğa adım 3.8'de yapılan 50 μL peroksidaz etiketli mAb ekleyin. Plakayı örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Kuyu içeriğini aspire edin veya boşaltın ve plakayı 5 kez bir kağıt havluya baş aşağı vurun.
  12. Kuyuları 200 μL PBS-Tween ile 3 kez yıkayın, kuyu içeriğini aspire edin ve plakaya her biri 5 kez vurun.
  13. Her bir oyuka adım 3.7'de hazırlanan substrat çözeltisinden 100 μL ekleyin. Plakayı örtün ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
  14. 30 dakika sonra, bir ELISA plaka okuyucu kullanarak 405-414 nm'de absorbansı okuyun.
    NOT: Kullanılan ELISA plaka okuyucu için özel talimatları izleyin. Bu protokol için kullanılan yazılımın talimatlarıyla ilgili ayrıntılar için Ek Materyal S2'ye bakın. Pozitif kontrol kuyularında berraktan yeşile gözle görülür bir renk değişimi olmalıdır.

4. Analiz

  1. Pozitif numunelerin tespit edilmesi.
    1. Absorbans değerleri kesme değerin üzerinde olan numuneleri (negatif numunelerin ortalama absorbans değerinin iki katı) pozitif olarak etiketleyin.
  2. CSP'nin Ölçülmesi
    1. Aşağıdaki gibi kontrol seyreltme serisinden oluşturulan standart eğriyi kullanarak numunedeki CSP konsantrasyonunu tahmin edin.
      1. Seri olarak seyreltilmiş kontrollerin absorbans değerlerini (y ekseni) konsantrasyonlarına (x ekseni) göre çizerek standart eğriyi oluşturun.
      2. A ve B'nin serbest parametreler olduğu y = A + Bx kullanarak en uygun olanı belirlemek için doğrusal regresyon gerçekleştirin.
      3. Belirli bir absorbans değeri için denklemi çözerek her pozitif numune için CSP konsantrasyonunu belirleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Temsili ELISA sonuçları Şekil 2'de gösterilmiştir. Bu deneyde, P. falciparum ELISA A7 kuyusunda sporozoit enfeksiyonu tespit etti. Pozitif kuyu, soluk yeşil rengiyle görsel olarak tespit edilebilir (Şekil 2A). Bu kuyunun absorbans değeri, kesme eşiğinin üzerindeydi (dört negatif kontrol kuyusunun ortalama değerinin iki katı) (Şekil 2B). 80 bilinmeyen kuyunun tümünün absorbans değerlerinin dağılımı Şekil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

CSP-ELISA, Plasmodium CSP'yi tespit etmek için oldukça spesifik ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar. P. falciparum ve P. vivax sporozoitlerin yanı sıra P vivax 11,13,14,15'in iki alt tipi olan VK210 ve VK247 arasında ayrımcılığa izin verir. Güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için bazı kritik noktalara dikkat edilmelidir. Mikrobiyal üremeyi önle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Eğitim ve rehberlik için MVRU'dan Bay Kirakorn Kiatibutr'a teşekkür ederiz. Ayrıca, Şekil 2'nin hazırlanmasındaki teknik yardımı için MVRU'dan Bayan Pinyapat Kongngen'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (U19 AI089672) tarafından sağlanan bir hibe ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekipman< / güçlü >
ELISA plaka okuyucuBioTek Instrument, Inc.Synergy H1Absorbans, UV-VIS absorbans algılama modu kullanılarak ölçülür
Öğütücü tokmak tokmağıAxygenPES-15-B-SISivrisinek başını/toraksını
Reaktifleri
ABTS substratını homojenleştirmek için 2 bileşenliKPL50-62-00Peroksidaz tahrikli algılama için
Engelleme tamponu (BB)Not: çözelti
Yakalama ve peroksidaz konjuge monoklonal antikorlar (mAbs)Not: mAbs, Sporozoit ELISA Reaktif Kitlerinin (P. falciparum için MRA-890 ve P. vivax için MRA-1028K) bir parçası olarak liyofilize formda elde edilebilir. BEI Kaynaklarından (https://www.beiresources.org.)
KazeinSigma aldrich9000-71-9Tampon hazırlığını engellemek için
Öğütme tamponu (GB)Not: çözelti
Igepal CA-630Sigma aldrich9002-93-1Öğütme tamponu hazırlığı için
KClSigma aldrich7447-40-7Fosfat tamponu tuzlu su hazırlığı için
KH2PO4 Sigma aldrich7778-77-0Fosfat tamponu tuzlu su hazırlama için
Na2< / sub>HPO4< / sub>Sigma aldrich7558-79-4Fosfat tamponu tuzlu su hazırlığı için
NaClSigma aldrich7647-14-5Fosfat tamponu tuzlu su hazırlığı için
NaOHSigma aldrich1310-73-2Tampon hazırlığını bloke etmek için
PBS-Tween
Pf yakalama mAbCDCPf-CAPPf circumsporozoit proteini
Pf peroksidaz mAbCDCPf-HRPPf circumsporozoit proteinini tespit etmek için
Pf pozitif kontrolCDCPf-PCPf pozitif kontrol
Fenol kırmızıSigma aldrich143-74-8Tampon hazırlamayı engellemek için
Fosfat tamponlu salin (PBS)Not: çözelti
Pozitif kontrollerNot: çözelti
Pv210 yakalama mAbCDCPv210-CAPPv210 circumsporozoite proteini yakalamak için
Pv210 peroksidaz mAbCDCPv210-HRPPv210 circumsporozoite proteini
Pv210 pozitif kontrolCDCPv210-PC'yi tespit etmek içinPv210 pozitif kontrol
Pv247 yakalama mAbCDCPv247-CAPPv247 circumsporozoite proteini yakalamak için
Pv247 peroksidaz mAbCDCPv247-HRPPv247 circumsporozoite proteinini tespit etmek için
Pv247 pozitif kontrolCDCPv247-PCPv247 pozitif kontrol
Tween20Sigma aldrich9005-64-5PBS-Tween hazırlığı için
< güçlü > Sarf malzemeleri< / güçlü >
Tek kullanımlık pipetleme rezervuarlarıJenerikÇalışma reaktifleri için
ELISA plakaları: ELISA için 96 iyi şeffaf yuvarlak alt PVSCorning Life Science2797
Eldivenler: tek kullanımlık eldivenler ve dondurucu eldivenleriJenerikKişisel koruma için
Laboratuvar önlüğüJenerikkişisel koruma için
Çok Kanallı Pipet P30-300Jenerik Solüsyontransferi için
Pipet seti, P2, P20, P200 ve P1000Jenerik Solüsyontransferi için
Pipet uçları 10 ve mikro; L, 200 ve mikro; L ve 1000 &mikro; LJenerikÇözelti transferi için
Serolojik pipetler 5 mL, 10 mLJenerikÇözelti transferi için
Transfer pipetleriJenerikÇözelti transferi için

Kaynaklar

  1. Bray, R. S., Garnham, P. C. The life-cycle of primate malaria parasites. British Medical Bulletin. 38 (2), 117-122 (1982).
  2. Held, J. R. Primate malaria. Annals of the New York Academy of Sciences. 162 (1), 587-593 (1969).
  3. World Health Organization. Division of Malaria and Other Parasitic Diseases. Manual on practical entomology in Malaria, Part I and Part II. World Health Organization. , Geneva. (1975).
  4. Robert, V., et al. Study of the distribution of circumsporozoite antigen in Anopheles gambiae infected with Plasmodium falciparum, using the enzyme-linked immunosorbent assay. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 82 (3), 389-391 (1988).
  5. Fontenille, D., Meunier, J. Y., Nkondjio, C. A., Tchuinkam, T. Use of circumsporozoite protein enzyme-linked immunosorbent assay compared with microscopic examination of salivary glands for calculation of malaria infectivity rates in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Cameroon. Journal of Medical Entomology. 38 (3), 451-454 (2001).
  6. Echeverry, D. F., et al. Fast and robust single PCR for Plasmodium sporozoite detection in mosquitoes using the cytochrome oxidase I gene. Malaria Journal. 16 (1), 230(2017).
  7. Singh, B., et al. A genus- and species-specific nested polymerase chain reaction malaria detection assay for epidemiologic studies. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 60 (4), 687-692 (1999).
  8. Snounou, G. Genotyping of Plasmodium spp. Nested PCR. Methods in Molecular Medicine. 72, 103-116 (2002).
  9. Snounou, G., Singh, B. Nested PCR analysis of Plasmodium parasites. Methods in Molecular Medicine. 72, 189-203 (2002).
  10. Snounou, G., Viriyakosol, S., Jarra, W., Thaithong, S., Brown, K. N. Identification of the four human malaria parasite species in field samples by the polymerase chain reaction and detection of a high prevalence of mixed infections. Molecular and Biochemical Parasitology. 58 (2), 283-292 (1993).
  11. Wirtz, R. A., et al. Identification of Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes using an enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 34 (6), 1048-1054 (1985).
  12. Wirtz, R. A., Burkot, T. R., Graves, P. M., Andre, R. G. Field evaluation of enzyme-linked immunosorbent assays for Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax sporozoites in mosquitoes (Diptera: Culicidae) from Papua New Guinea. Journal of Medical Entomology. 24 (4), 433-437 (1987).
  13. Wirtz, R. A., Sattabongkot, J., Hall, T., Burkot, T. R., Rosenberg, R. Development and evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay for Plasmodium vivax-VK247 sporozoites. Journal of Medical Entomology. 29 (5), 854-857 (1992).
  14. Burkot, T. R., Williams, J. L., Schneider, I. Identification of Plasmodium falciparum-infected mosquitoes by a double antibody enzyme-linked immunosorbent assay. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 33 (5), 783-788 (1984).
  15. Rosenberg, R., et al. Circumsporozoite protein heterogeneity in the human malaria parasite Plasmodium vivax. Science. 245 (4921), 973-976 (1989).
  16. Marie, A., et al. Evaluation of a real-time quantitative PCR to measure the wild Plasmodium falciparum infectivity rate in salivary glands of Anopheles gambiae. Malaria Journal. 12, 224(2013).
  17. Arevalo-Herrera, M., et al. Immunoreactivity of sera from low to moderate malaria-eEndemic areas against Plasmodium vivax rPvs48/45 proteins produced in Escherichia coli and chinese hamster ovary systems. Frontiers in Immunology. 12, 634738(2021).
  18. Balkew, M., et al. An update on the distribution, bionomics, and insecticide susceptibility of Anopheles stephensi in Ethiopia, 2018-2020. Malaria Journal. 20 (1), 263(2021).
  19. Wirtz, R. A., Avery, M., Benedict, M., Sutcliffe, A. Plasmodium sporozoite ELISA. Methods in Anopheles Research. , 333-343 (2016).
  20. Durnez, L., et al. False positive circumsporozoite protein ELISA: a challenge for the estimation of the entomological inoculation rate of malaria and for vector incrimination. Malaria Journal. 10, 195(2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Plasmodium Sporozoit TespitiSirkumsporozoit ProteinSandvi ELISASivrisinek T k r k BezleriT rle zg AntikorlarS tma letimiStandart E riPCR Do rulamas
Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak Anofel Sivrisineklerinde Plasmodium Sporozoitlerin Tespiti
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.