Rejeneratif Kapasitenin Karşılaştırmalı Analizi için Zebra Balığı ve Medaka Kullanan Yetişkin Optik Tektumunun Bıçak Yarası Yaralanma Modeli

Özet

Yetişkin zebra balıklarında mekanik bir beyin hasarı modeli, yüksek rejeneratif kapasitelerini düzenleyen moleküler mekanizmaları araştırmak için tanımlanmıştır. Yöntem, floresan immünoboyama kullanarak rejeneratif yanıtları değerlendirmek için birden fazla küçük balık türünün optik tektumunda bir bıçak yarası yaralanması oluşturmayı açıklar.

Özet

Zebra balığı, merkezi sinir sistemini (CNS) yenilemek için üstün bir kapasiteye sahipken, medaka daha düşük bir CNS rejeneratif kapasitesine sahiptir. Zebra balığı ve medaka'nın yetişkin optik tektumunda bir beyin hasarı modeli geliştirilmiş ve bu balık türleri arasında bu dokunun yüksek rejeneratif kapasitesini düzenleyen moleküler mekanizmaları aydınlatmak için karşılaştırmalı histolojik ve moleküler analizler yapılmıştır. Burada erişkin optik tektum için nöral kök hücrelerin (NSC) proliferasyonu ve farklılaşması için bir iğne ve histolojik analizler kullanılarak bir bıçak yarası yaralanma modeli sunulmuştur. Optik tektumun merkezi bölgesine manuel olarak bir iğne sokuldu ve daha sonra balıklar intrakardiyal olarak perfüze edildi ve beyinleri diseke edildi. Bu dokular daha sonra kriyoseksiyona tabi tutuldu ve uygun NSC proliferasyonu ve farklılaşma belirteçlerine karşı immün boyama kullanılarak değerlendirildi. Bu tektum yaralanma modeli, hem zebra balığı hem de medaka'da sağlam ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar ve yaralanma sonrası NSC yanıtlarını karşılaştırmaya olanak tanır. Bu yöntem, zebra balığı, medaka ve Afrika killifish dahil olmak üzere küçük teleostlar için mevcuttur ve rejeneratif kapasitelerini karşılaştırmamızı ve benzersiz moleküler mekanizmaları araştırmamızı sağlar.

Giriş

Zebra balığı (Danio rerio), diğer memelilere kıyasla merkezi sinir sistemini (CNS) yenileme yeteneğinde artışa sahiptir ^1,2,3. Son zamanlarda, bu artan rejeneratif kapasitenin altında yatan moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için, yeni nesil dizileme teknolojisi kullanılarak doku rejenerasyonunun karşılaştırmalı analizleri yapılmıştır ^4,5,6. Zebra balığı ve tetrapodlardaki beyin yapıları oldukça farklıdır ^7,8,9....

Protokol

Tüm deneysel protokoller, Ulusal İleri Endüstriyel Bilim ve Teknoloji Enstitüsü'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Zebra balığı ve medaka standart prosedürlere göre muhafaza edildi²⁸.

1. Yetişkin optik tektumda bıçak yarası yaralanması

1. Anestezi için% 0.4 (w / v) trikain stok çözeltisi hazırlayın. 100 mL'lik bir stok çözeltisi için, 400 mg trikain metansülfonatı ( Malzeme Tablosuna bakınız) 90 mL damıtılmış suda çözün ve 1 M Tris HCl tamponu (pH 9.0) kullanarak pH'ı 7.0'a ayarlayın. pH ayarlandıktan sonra, 100 mL'ye kadar su ekleyin,....

Sonuçlar

Sağ yarımküreye iğne sokulması kullanılarak optik tektumda bıçak yarası yaralanması (Şekil 1, Şekil 4A ve Şekil 5A), radyal glial hücre (RGC) proliferasyonu ve yenidoğan nöronlarının oluşumu dahil olmak üzere çeşitli hücresel yanıtları indükler. Benzer şekilde, zebra balığı ve medaka'nın yaşlı popülasyonları, rejeneratif yanıttaki yaşlanma etkilerine karşı koymak için kullanılmıştır. Daha sonra dondurulmuş kesitlerde floresan immüno.......

Tartışma

Burada, beyin hasarı sonrası RGC proliferasyonunun ve farklılaşmasının değerlendirilmesini kolaylaştırmak için bir iğne kullanarak optik tektumda bıçak yarası yaralanmalarını indüklemek için kullanılabilecek bir dizi yöntem açıklanmaktadır. İğne aracılı bıçak yaraları, standart bir alet seti kullanılarak birçok deneysel örneğe uygulanabilen basit, verimli bir şekilde uygulanan bir yöntemdir. Zebra balığı beyninin çeşitli bölgeleri için bıçak yarası yaralanma modelleri geliştirilmiştir ^{3,19,29.......}

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
10 mL şırınga	TERUMO	SS-10ESZ
1M Tris-HCl (pH 9.0)	NIPPON GENE	314-90381
30 G iğne	Dentronics	HS-2739A
%4 Paraformaldehit Fosfat Tampon Çözeltisi	Wako	163-20145
Alüminyum blok			115 x 80 x 37 mm (G x D x Y) 6 kriyomoldu dondurmak için yeterli boyuttur
Anti-BLBP	Millipore	ABN14	1:500
Anti-BrdU	Abcam	ab1893	1:500
Anti-HuC	Invitrogen	A21271	1:100
Anti-PCNA	Santa Cruz Biyoteknoloji	sc-56	1:200
Brmodeoksiüridin	Wako	023-15563
Konfokal mikroskop C1 plus	Nikon
Cryomold	Sakura Finetek Japonya	4565	10 x 10 x 5 mm (G x D x Y)
Kriyostat	Leica	CM1960
Danio rerio WT suşları RW
Uzatma tüpü	TERUMO	SF-ET3520
Floresan boya lekeli dokularla kullanım için Floromount (TM) Sulu Montaj Ortamı	SIGMA-ALDRICH	F4680-25ML
Forseps	DUMONT	11252-20
Keçi Anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723
Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035
Hoechst 33342 çözeltisi	Dojindo	23491-52-3
Hidroklorik Asit	Wako	080-01066
10 slayt için Kuluçka Odası Koyu Turuncu COSMO	BIO CO., LTD.	10DO
MAS kaplama sürgülü cam	Matsunami cam	MAS-01
Mikro kapak camı	Matsunami cam	C024451
Mikroskobu	Nikon	SMZ745T
Normal at serumu engelleme solüsyonu	VEKTÖR LABRATORIES	S-2000-20
OCT Bileşik	Sakura Finetek Japonya	83-1824
Oryzias latipes WT suşları Kabin
PAP Kalem Süper Sıvı Engelleyici	DAIDO SANGYO	PAP-S
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) Tabletleri, pH 7.4	TaKaRa	T9181
Strafor tepsi			100 x 100 x 10 mm (G x D x Y) strafor levha tepsi olarak mevcuttur
Sucrose	Wako	196-00015	%30 (a/h) PBS'de sükroz
Trikain (MS-222)	nacarai tesque	14805-24
Trisodyum Sitrat Dihidrat	Wako	191-01785
Triton X-100	Wako	04605-250