Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Göz İçi Tedavi Yardımcı Maddeleri ve İlaçlarının Toksisitesini Değerlendirmek için Organ Kültürü Sistemi

949 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/63176

⸱

7 Ocak 2022

 ,  ,  , 
1School of Optometry and Vision Science, University of Waterloo, 2Centre for Ocular Research & Education, School of Optometry and Vision Science, University of Waterloo, 3Tonomed Inc

Bu makalede

Özet

Bu protokolün amacı, deneysel tedaviye yanıt olarak lensin metabolik aktivitesindeki ve refraktif fonksiyonundaki değişiklikleri değerlendirmektir.

Özet

Körlüğün önde gelen nedeni olan katarakt, dünya çapında bu durumdan etkilenen on milyonlarca insan için önemli bir yüktür. Kimyasal maruziyetler, diğer çevresel faktörlerin yanı sıra, kataraktın yerleşik bir nedenidir. Oküler toksisite testi, farmasötiklerin ve bileşenlerinin katarakta yol açabilecek lens hasarına katkıda bulunup bulunmayacağını veya katarakt tedavisine yardımcı olup olmayacağını değerlendirebilir.

İn vitro çalışmalar ve in vivo hayvan testleri, klinik çalışmalardan önce kimyasalların güvenliğini değerlendirmek için kullanılabilir. Oküler toksisite ve irritansi testi için mevcut in vivo standart olan Draize testi, oküler toksisiteyi belirlemeye yönelik duyarlılık ve objektif ölçümlerin eksikliği nedeniyle eleştirilmiştir. İn vitro hücre bazlı tahliller, hücre kültürleri sağlam bir fonksiyonel lensi uygun şekilde modelleyemediğinden sınırlıdır.

Burada açıklanan yöntem, sağlam sığır merceğinin hem hücresel aktivite düzeyinde hem de genel refraktif performans açısından tedaviye tepkisini değerlendirmek için tasarlanmış, hayvan testlerine hassas bir in vitro alternatiftir. Toksik olmayan reaktif resazurin, hücre aktivitesi seviyesi ile orantılı olarak metabolize edilir. Lens lazer tarayıcı testi, lensin gelen ışık huzmelerini minimum hatayla tek bir noktaya kırma yeteneğini ölçer ve bu da doğal işleviyle doğrudan ilgilidir. Yöntem, lensteki hem akut hem de gecikmiş değişikliklerin yanı sıra lensin kimyasal veya çevresel maruziyetlerden geri kazanılmasını belirlemek için kullanılabilir.

Giriş

20 milyondan fazla insanı etkileyen katarakt, dünya çapında körlüğün en yaygın nedenidir 1,2. Katarakt en sık lensteki yaşa bağlı değişikliklerden kaynaklanır, ancak aynı zamanda travma, genetik durumlar, hastalık veya toksik maruziyetlerden de kaynaklanır2. Şu anda tedavi, esas olarak gelişmiş ülkelerdekiler tarafından erişilebilen pahalı ve invaziv bir prosedür olan lensi değiştirmek için cerrahi müdahaleyi içermektedir. Kataraktın kapsamlı yükü, kataraktın önlenmesine ve cerrahi olmayan tedavinin geliştirilmesine yönelik onlarca yıllık araştırmaları yönlendirmiştir. Her iki durumda da, oftalmik ilaçların toksisitesi, etkinliği ve farmakokinetiği için klinik öncesi testlerin önemi çok önemlidir. Bu ilaç geliştirme süreci, büyük ölçüde hayvanlarda yapılan çalışmaların sağladığı bilgilere dayanır.

İn vivo oküler toksisite testi için mevcut standart, bir test bileşiğinin canlı bir hayvanın konjonktival kesesine verilmesini içeren Draize testidir. Test, özellikle hayvan etiği, öznellik, zayıf tekrarlanabilirlik ve değişkenlik ile ilgili olarak önemli ölçüde eleştirilmiştir3. Ek olarak, Draize testinin, test maddelerinin lens üzerindeki etkilerini doğrudan izleyen bir bileşeni yoktur. Alternatif in vitro modellerin geliştirilmesi için önemli çaba harcanmıştır4. Bununla birlikte, hiçbiri Draize testi5'in yerini alacak kadar doğrulanmamıştır. Benzer şekilde, bu modellerin birçoğu katarakt ve diğer karmaşık patolojilere doğrudan uygulama açısından sınırlamalarla karşı karşıyadır6. Örneğin, bir ızgara üzerine yerleştirildiğinde lens saydamlığını derecelendiren yöntemler doğası gereği özneldir7. Hücre kültürü çalışmaları güvenilirdir ve yüksek oranda kullanılır, ancak hücre tek tabaka özellikleri birincil doku kültüründenfarklı olabilir 8.

Bütün lensler hayvanların gözlerinden diseke edilebilir ve orijinal yapılarını ve işlevlerini korumak için kültürlenebilir. Organın durumunu korurken lens fonksiyonunu değerlendirmek için yararlı olan bir test, Kanada'daki Waterloo Üniversitesi'nde geliştirilen bir tarayıcıyı içeren lens lazer tarayıcı testidir. Test, lensin optik kalitesini veya kırılma performansını ölçmek için bir dizi lazer projeksiyon kullanan bir tarama sistemidir. Lensler, özel iki segmentli kültür odalarında taranır ve ışınların aşağıdan lensin içinden geçmesine izin verilir (Şekil 1A). Tarayıcının içine sabitlenmiş bir kamera, lensten çok sayıda noktadan geçen lazerin görüntüsünü yakalar. Tarayıcı yazılımı, merceğin merkezi bir eksenle kesiştiği merceğin arkasındaki mesafeyi hesaplar (arka tepe mesafesi, BVD), merceğin ışığı tek bir noktaya ne kadar tutarlı bir şekilde odakladığını gösteren bir dizi ölçüm üretir (Şekil 1).

Lensin, hücrelerinin sıkı ve düzenli düzenlenmesi gibi hücresel özellikleri, şeffaflığın korunmasına ve saçılmanın en aza indirilmesine yardımcı olur, böylece lens ışığı işlevsel olarak odaklayabilir9. Bu ölçüm, bir kimyasalın gradyan kırılma indisi gibi lensin temel yapısını ne kadar önemli ölçüde bozduğunu ve indüklenen opaklıklar nedeniyle ne kadar işlevin tehlikeye atıldığını yorumlamak için kullanılabilir. Kültürlenmiş lenslerin ve lens veziküllerinin tepkisini takip eden diğer çalışmalar, ışık saçılımının metabolik değişikliklere kıyasla yapısal değişikliklerin bir ürünü olduğunu ve lens lipitleri ve proteinlerindeki bozulmaların kırılma indisini etkileyebileceğini ve sonuç olarak saçılmayı artırabileceğini düşündürmektedir10,11.

Lens lazer tarayıcı, hücre toksisitesinin biyokimyasal ölçümlerini belirlemek için tahlillerde metabolik reaktiflerle birlikte kullanılabilir. Resazurin, aktif hücreler tarafından metabolize edilen toksik olmayan bir kimyasal reaktiftir ve ölçülebilir bir floresan12 ile indirgenmiş bir ürün (resorufin) üretir. Lens, ön epitel içinde yoğunlaşan metabolik olarak aktif mitokondri ve yüzeysel kortikal lif hücreleri dışında büyük ölçüde organellerden yoksundur ve lens enerji gereksinimlerini karşılar13,14. Lensin hücresel düzeyde hasar görmesi metabolizmayı bozabilir ve genellikle patojenik yapısal değişikliklerin ve kataraktın başlamasından önce gelir15.

Bu yöntemin amacı, katarakt gelişimine katkıda bulunabilecek ksenobiyotik ve çevresel maruziyetlerin lens üzerindeki etkisini değerlendirmektir. Protokol, kültürlenmiş sığır lensi kullanılarak yapılan bir tedavinin etkisini değerlendirmek için iki test içerir. Bu yaklaşımın avantajı, birincil doku olarak lensin tedaviye nasıl yanıt verdiğinin hem hücresel hem de fonksiyonel bir değerlendirmesini sağlamasıdır. Diğer yaygın yöntemlere kıyasla lensin hassas ve objektif bir değerlendirmesidir 16,17,18.

Model, yüzey aktif maddeler, tüketici ürünleri, alkoller ve ultraviyole radyasyon 17,19,20 dahil olmak üzere çeşitli maruziyetlerin etkilerini değerlendirmek için başarıyla kullanılmıştır. Optik kalitedeki değişiklikler, toksik maruziyete bir yanıt olarak kültürlenmiş lenslerde sürekli olarak mevcuttur21. Bu yöntemin uzun süreli lens kültürünü sürdürme yeteneği, bir bileşiğin potansiyel olarak gecikmiş etkisinin izlenmesi ve lensin indüklenen hasar veya katarakttan kurtarılması için çok uygundur22,23. Bu protokolün uygulanmasından elde edilen sonuçlar, oftalmik ürünlerin geliştirilmesinde hayvan testlerine olan bağımlılığı azaltmak için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel protokoller, hayvan dokusu kullanılarak yapılan araştırmalar için Waterloo Üniversitesi etik politikalarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için sığır gözleri, mezbaha tarafından sağlandı, ölümden birkaç saat sonra süt ürünü olmayan elde edildi ve hemen diseke edildi, bu da gözlerin elde edilmesinden itibaren 8 saat kadar süren bir süreçti. Steriliteyi ve diseksiyon kalitesini korumak için gözler derhal diseke edilmelidir. Kültür ortamı 7.4 pH'a hazırlanır ve FBS21 ile takviye edilmeden önce steril olarak filtrelenir. Tüm işlemler steril koşullarda, Malzeme Tablosunda listelenen malzeme ve ekipman kaynakları ile gerçekleştirilmektedir.

1. Sığır lens kültürü

  1. Skleradan ekstraoküler kasları ve dokuyu çıkararak, kürenin ve vitreusun arka yarısını çıkararak, iris ve siliyer gövdeyi lensle birlikte çıkararak, ardından zonüler ekleri keserek lensleri diseksiyon yapın ve son kesim lens orta dolu kültür odasına düşecek şekilde konumlandırıldı.
  2. Diseke edilmiş lensleri, 37 ° C ve% 5 CO2'de 21 mL steril filtrelenmiş ortam ile lazer tarama sistemine uyacak şekilde uyarlanmış bir tabana sahip özel odalarda kültürleyin. % 1 penisilin-streptomisin, 9.4 g / L M-199, 0.1 g / L L-glutamin, 5.96 g / L HEPES, 2.2 g / L sodyum bikarbonat ve 7 mL / L NaOH ile% 3 fetal sığır serumu (FBS) takviyeli kültür ortamı kullanın. Kullanılmayan kültür ortamını buzdolabında 7 güne kadar saklayın.
  3. Kültür ortamını her 1-2 günde bir değiştirin. Kullanmadan önce kültür ortamını 37 ° C'de bir saat ısıtın. Besiyerini ayrı bir kültür odasından aspire etmek için emme bağlantılı steril bir Pasteur pipeti kullanın ve takviye edilen besiyeri ile hemen doldurun.
  4. Fiziksel hasarın ortaya çıkması için zaman tanımak için lensleri diseksiyondan sonra 48 saat boyunca kültürleyin. Bir deneye dahil edilmeden önce lensleri bölüm 4'e göre optik kalite açısından inceleyin ve tarayın.
    NOT: Lensler, lazer tarayıcı testine hazırlanırken yüzü aşağı bakacak şekilde yönlendirilir.

2. Kontrol prosedürü

  1. Kimyasal bileşik ve kültür ortamı ile uyumlu bir çözündürücü ajanın istenen konsantrasyonuna sahip bir çözelti hazırlayın.
  2. Çözündürücü maddeyi takviye edilmiş ortama ekleyerek bir araç kontrol çözeltisi hazırlayın. Deneyden önce kontrol solüsyonunu 37 °C'de bir saat ısıtın.
  3. Kültür ortamını kontrol lensi odalarından aspire etmek için emişe bağlı bir Pasteur pipeti kullanın. Odaları kontrol solüsyonu ile doldurun. Gerekirse, bu adımı üç nüsha halinde numunelerle gerçekleştirin.
    NOT: Lensi ön yüzü yukarı pozisyonda tamamen kaplamak için minimum 7 mL'lik bir hacim gereklidir. Mevcut çalışmadaki kontrol koşulları, 21 mL işlenmemiş ortam kontrolü, 21 mL araç kontrol ortamı ve 7 mL fosfat tamponlu salin (PBS) idi.
  4. Lensleri 2 gün boyunca kontrol ortamında kültürleyin, ardından bölüm 1'e göre yeni kontrol ortamıyla değiştirin. Kısa süreli maruziyetler için, kontrol solüsyonunu odalardan aspire edin ve bölüm 1.0'da açıklandığı gibi lens kültürü protokolüne devam etmeden önce takviyesiz kültür ortamı ile en az üç kez durulama yapın.
  5. Optik kalite değerlendirmesinden önce lenslerin inkübatörde 37 °C ve %5CO2'de en az 3,5 saat alışmasına izin verin.

3. Maruz kalma prosedürü

  1. Kimyasal bileşik ve kültür ortamı ile uyumlu bir çözündürücü ajanın istenen konsantrasyonuna sahip bir çözelti hazırlayın. Kimyasalı çözündürücü madde ile birleştirin ve gerekirse etkileşim için uygun zamanı tanıyın.
    NOT: Mevcut çalışmada lanosterolün (0.033 g/L) ortamdaki çözünürlüğünü arttırmak için 2-Hidroksipropil-β-siklodekstrin kullanılmıştır. Benzalkonyum klorür (BAK %0.0075) çözeltisi PBS kullanılarak hazırlandı.
  2. Çözündürülmüş kimyasalı kültür ortamına dahil edin. Tüm lens örneklerine 21 mL ortam sağlamak için yeterli bir toplam hacim hazırlayın. Deneyden önce deney ortamını 37 °C'de bir saat ısıtın.
  3. Kültür ortamını lens odalarından aspire etmek için emişe bağlı bir Pasteur pipeti kullanın. Odaları hemen test çözeltisi ile doldurun. Maruz kalma aralığından sonra, gerekirse önce bir durulama gerçekleştirerek takviye edilmiş kültür ortamı ile değiştirin. Gerekirse, bu adımı üç nüsha halinde numunelerle gerçekleştirin.
    NOT: Mevcut çalışmada, test koşulları 21 mL lanosterol takviyeli ortam ve 7 mL BAK %0.0075 çözeltisiydi. Lensi tamamen kaplamak için minimum 7 mL'lik bir hacim gereklidir. Bu durumda lenslerin öncelikle ön yüzü yukarı bakacak şekilde yönlendirilmesi gerekir. Lensi yeniden konumlandırmak için çevredeki kültür ortamının bir kısmı ile kültür odasında bir akım oluşturmak için bir Pasteur pipeti kullanılabilir.
  4. Optik kalite değerlendirmesinden önce alışması için lensleri en az 3.5 saat inkübatöre geri koyun.
    NOT: Lensler, lazer tarayıcı testine hazırlanırken yüzü aşağı bakacak şekilde yönlendirilir.

4. Optik kalite tahlili (lens lazer tarayıcı)

  1. Gerekirse lensin konumunu ayarlamak için adım 3.3'teki tekniği kullanarak, lenslerin ön yüzü aşağı bakacak ve kültür odasında görsel olarak düz olacak şekilde yönlendirildiğinden emin olun.
    NOT: Bu konum, gelen ışının haznenin altından yukarı yansıtılmasını ve lensten ön yüzeyden arka yüzeye geçmesini sağlar.
  2. Lazer tarayıcıya, hazne taşıyıcı pimi hazne tabanındaki yuvaya oturacak şekilde bir lens kültürü haznesi yerleştirin.
  3. Taramanın gerçekleştirileceği lensi ve tarama noktasını seçin, tarama lensine sağ tıklayın ve tarayıcının ışının bulunması ve hizalanması için uyarılarını bekleyin. Merceğin arkasındaki ışın için iyi mesafeli başlangıç ve bitiş noktaları seçin. Tarayıcı yazılımındaki kaba ve ince ayar düğmelerini ve tarayıcı üzerindeki ayar düğmesini kullanarak merkezi ışının hizalandığından emin olun. Işın hizalandığında , kalibre edin ve uygun bir radyal adım seçimi ve ışın ayrımı girin.
    NOT: Sığır lensi kullanılarak yapılan bu çalışma için, radyal adımlar ve ışın ayırma ayarları sırasıyla 10 adım ve 0,5 mm olarak ayarlanmıştır. Tarayıcının gerçekleştirdiği ilk tarama, lazer tarayıcıyı kalibre etmeye yarar. Bu bir kez gereklidir ve tüm ek lens taramaları hizalamadan hemen sonra gerçekleştirilebilir.
  4. Tarayıcı kalibre edildikten sonra tara'ya tıklayın. Lens taraması tamamlandıktan ve ışının kapsamı ayarlandıktan sonra bir eksen boyunca BVD ortalaması, standart sapma ve hata için değerlerin oluşturulmasını bekleyin. Işınların mercekten çıktığı yerden dürbünü istenen uç noktaya ayarlayın ve herhangi bir görünür paraziti hariç tutarken merceğin arkasındaki maksimum mesafeyi seçin.
  5. Her bir ışın için ayrı ayrı arka köşe mesafelerini görüntülemek için oluşturulan grafiği kullanın.
    NOT: Lens dikişlerinden geçen ışınları hariç tutun. Bir ışını hariç tutmak için, tek bir ışına sağ tıklamak için ekrandaki göstergeyi kullanın ve hariç tut'u seçin.
  6. Tarayıcının içindeki kültür odası tabanının konumunu, ön lens yüzeyi boyunca ikinci tarama önceki taramaya dik olacak şekilde manuel olarak 90° döndürün. Merkezi huzmenin adım 4.3'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi hizalandığından emin olun ve ardından lensi tarayın.

5. Metabolik aktivite testi (resazurin)

  1. Ortamı FBS olmadan hazırlayın. Ortamı 37 °C'de bir saat ısıtın. Takviye edilmemiş ortamda 50 mL% 8 resazurin reaktifi hazırlayın.
    NOT: 12 oyuklu bir plakada tüm kuyucukları doldurmak için 50 mL hazırlamak yeterlidir. Çözelti, resazurin ışığa duyarlı olduğu için opak bir kapta loş koşullar altında steril olarak hazırlanmalıdır.
  2. Lensi kaplamak için şeffaf tabanlı, steril 12 oyuklu bir plaka içinde her bir oyuğa 3.8 mL% 8 resazurin çözeltisi ekleyin.
  3. Lensleri arka yüzeyin altından dikkatlice kaldırmak için steril metal kepçeler kullanın ve lensi küçük bir hacimde takviye edilmemiş kültür ortamı ile yıkamak için bir Pasteur pipeti kullanarak durulama yapın. Lensleri her bir oyuğa ayrı ayrı yerleştirin.
  4. Kuyu plakasını 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 5 saat inkübe edin. Kuluçka işleminden sonra, lensleri metal kepçelerle kuyulardan çıkarın ve bir hayvan atığı imha kabına koyun. Her bir oyuktan 100 μL'lik bir numuneyi steril, şeffaf tabanlı, 96 oyuklu bir plakaya aktarın.
    NOT: Lensler metabolik aktivite testi ile birden çok kez değerlendirilebilir. Bu durumda, lensleri inkübasyon için taze besiyeri olan kültür odalarına geri koyun. Metabolik aktivite testi, boya BVD ölçümlerini etkileyebileceğinden, tüm taramalar tamamlandıktan sonra en iyi şekilde gerçekleştirilir.
  5. Uyarma ve emisyon dalga boyları sırasıyla 560 nm ve 590 nm'ye ayarlanmış bir floresan plaka okuyucu kullanarak 100 μL'lik numunelerin son nokta floresansını ölçün.

6. Veri analizi

  1. Optik kalite testi için, her bir zaman noktasında gerçekleştirilen iki taramadan BVD hatası24 için yazılım tarafından hesaplanan değerlerin ortalamasını hesaplayın. Bu hesaplamayı tüm lensler ve tüm tarama noktaları için gerçekleştirin.
  2. Metabolik aktivite testi için, plaka okuyucu tarafından üretilen son nokta bağıl floresan değerlerini toplayın. Bir tarama noktasındaki tüm kontrol değerlerinin ortalamasını %100'e ayarlayarak verileri normalleştirin. Her bir merceğin etkinliğini, o tarama noktası için ortalama kontrol değerinin yüzdesi olarak hesaplayın.
  3. Tüm deney grupları için bir normallik testi gerçekleştirin. Verilerin normal olduğunu varsayarsak, iki yönlü ANOVA'yı kullanarak kontrol ve deneysel lensler arasındaki BVD hata farklarını analiz edin. Ek olarak, Tukey'in post-hoc çoklu karşılaştırma testini gerçekleştirin. Metabolik aktivite verileri için tek yönlü bir ANOVA ve Dunnett'in post-hoc testini gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 2 ve Şekil 3 (n = 6), kimyasal işlemin (lanosterol) sığır lensi üzerindeki etkisini test eden bir çalışmanın sonuçlarını göstermektedir. Lanosterol, bir zamanlar katarakt25 için potansiyel bir farmasötik müdahale olarak umut verici sonuçlar gösteren, lenste doğal olarak oluşan bir steroldür, ancak bu henüz kanıtlanmamıştır26. Çalışma tasarımı, bileşik için bir ortam ve araç kontrolünü içeriyordu. Araç (2-hidr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokolün amacı, primer doku kültüründe kimyasalların veya çevresel maruziyetlerin lens üzerindeki etkilerini doğrudan değerlendirmektir. İlk olarak, lensler optik kalite için parçalara ayrılır ve taranır. Kontaminasyonun önlenmesi ve diseksiyon kalitesinin sağlanması kritik öneme sahiptir. Lensler, kontrol grubuna veya ön pozlama durumuna göre kırma işlevindeki değişiklikleri sürekli olarak izlemek için periyodik aralıklarla taranır. Metabolik aktivite testi, maruziyetlerin hücresel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu projenin fonları için Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi'ne (NSERC) ve Kanada Optometrik Eğitim Güven Fonu'na (COETF) teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
(2-Hidroksipropil)-β-siklodekstrinSigma-AldrichH107Toz
1 L şişe üstü filtrasyon sistemiVWR97066-204Tam Montaj, şişe üstü, 0.2 & mu; m
100 mm Petri kabıVWR89022-320Kayabilir, medya koruyucu tarzı, steril
12 kuyulu plakaCorning353043Steril, şeffaf tabanlı
35 mm petri kabıVWR25373-041Falcon tek kullanımlık petri kapları, steril, Corning
96 kuyu plakasıVWR29442-072Steril, şeffaf tabanlı
Alamar mavisi (resazurin)Fischer ScientificDAL1100Moleküler Problar hücre canlılığı reaktifi
Benzalkonyum klorür çözeltisiSigma-Aldrich63249H20 içinde %50
Biyogüvenlik kabini
Sitasyon 5 plaka okuyucuBioTekCYT5MPVHücre görüntüleme çok modlu okuyucu
Fetal sığır serumuThermoFischer Scientific12484028Nitelikli, ısı inaktive edilmiş, Kanada
HEPESSigma-AldrichH3375Hücre kültürü için, toz
İnkübatör
LanosterolSigma-AldrichL5768≥ % 93, toz
L-glutaminSigma-AldrichHücre kültürü için, toz
Orta (M-199)Sigma-AldrichM3769Modifiye, Earle & prime ile; s tuzları, L-glutamin, sodyum bikarbonat ve fenol kırmızısı içermez, toz, hücre kültürü için uygun
Pasteur pipetleri5 3/4'', pamuklu ve pamuksuz
Penisilin-StreptomisinThermoFischer Scientific15140122Sıvı (10.000 U/mL)
Fosfat tampon salin (PBS)sıvı, steril, hücre kültürü
için uygunPipet uçları (100 & mikro; L, 1.000 ve mikro; L, 5.000 ve mikro; L)VWRSteril
ScanTox (lens lazer tarayıcı)Özel olarak geliştirilmiş şirket içiN / ALens optik kalitesini belirlemek için lensi lazerle tarar
ScanTox kültür odasıÖzel olarak şirket içiN / ATest ve kültürleme sırasında sığır lensini yerinde tutar
Sodyum bikarbonatSigma-AldrichS5761Hücre kültürü, toz
içinSodyum hidroksitSigma-AldrichS27701.0 N, BioReagent, hücre kültürü için uygun
geliştirilmiş

Kaynaklar

  1. Khairallah, M., et al. Number of people blind or visually impaired by cataract worldwide and in world regions, 1990 to 2010. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6762-6769 (2015).
  2. Priority eye diseases. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/blindness/causes/priority/en/index1.html (2014).
  3. Wilhelmus, K. R. The Draize eye test. Survey of Ophthalmology. 45 (6), 493-515 (2001).
  4. Jester, J. V. Extent of corneal injury as a biomarker for hazard assessment and the development of alternative models to the Draize rabbit eye test. Cutaneous and Ocular Toxicology. 25 (1), 41-54 (2006).
  5. Vinardell, M. P., Mitjans, M. Alternative methods for eye and skin irritation tests: an overview. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (1), 46-59 (2008).
  6. Bonneau, N., Baudouin, C., Reaux-Le Goazigo, A., Brignole-Baudouin, F. An overview of current alternative models in the context of ocular surface toxicity. Journal of Applied Toxicology. , (2021).
  7. Bree, M., Borchman, D. The optical properties of rat, porcine and human lenses in organ culture treated with dexamethasone. Experimental Eye Research. 170, 67-75 (2018).
  8. Leist, C. H., Meyer, H. P., Fiechter, A. Potential and problems of animal cells in suspension culture. Journal of Biotechnology. 15 (1-2), 1-46 (1990).
  9. Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
  10. Alghamdi, A. H. S., Mohamed, H., Sledge, S. M., Borchman, D. Absorbance and light scattering of lenses organ cultured with glucose. Current Eye Research. 43 (10), 1233-1238 (2018).
  11. Tang, D., et al. Light scattering of human lens vesicles in vitro. Experimental Eye Research. 76 (5), 605-612 (2003).
  12. O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
  13. Bantseev, V., Sivak, J. G. Confocal laser scanning microscopy imaging of dynamic TMRE movement in the mitochondria of epithelial and superficial cortical fiber cells of bovine lenses. Molecular Vision. 11, 518-523 (2005).
  14. Remington, L. A., McGill, E. C. Clinical Anatomy of the Visual system. , Butterworth-Heinemann. Boston. (1998).
  15. Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-44 (2000).
  16. Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high through-put screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
  17. Bantseev, V., et al. Mechanisms of ocular toxicity using the in vitro bovine lens and sodium dodecyl sulfate as a chemical model. Toxicological Sciences. 73 (1), 98-107 (2003).
  18. Sivak, J. G., Herbert, K. L., Segal, L. Ocular lens organ culture as a measure of ocular irritancy: The effect of surfactants. Toxicology Methods. 4 (1), 56-65 (1994).
  19. Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology In Vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
  20. Sivak, J. G., Stuart, D. D., Herbert, K. L., Van Oostrom, J. A., Segal, L. Optical properties of the cultured bovine ocular lens as an in vitro alternative to the Draize eye toxicity test: Preliminary validation for alcohols. Toxicology Methods. 2 (4), 280-294 (1992).
  21. Wong, W., Sivak, J. G., Moran, K. L. Optical response of the cultured bovine lens; testing opaque or partially transparent semi-solid/solid common consumer hygiene products. Toxicology In Vitro. 17 (5-6), 785-790 (2003).
  22. Sivak, J. G., Stuart, D. D., Weerheim, J. A. Optical performance of the bovine lens before and after cold cataract. Applied Optics. 31 (19), 3616-3620 (1992).
  23. Stuart, D. D., Sivak, J. G., Cullen, A. P., Weerheim, J. A., Monteith, C. A. UV-B radiation and the optical properties of cultured bovine lenses. Current Eye Research. 10 (2), 177-184 (1991).
  24. Dovrat, A., Sivak, J. G. Long-term lens organ culture system with a method for monitoring lens optical quality. Photochemistry and Photobiology. 81 (3), 502-505 (2005).
  25. Zhao, L., et al. Lanosterol reverses protein aggregation in cataracts. Nature. 523 (7562), 607-611 (2015).
  26. Daszynski, D. M., et al. Failure of oxysterols such as lanosterol to restore lens clarity from cataracts. Scientific Reports. 9 (1), 8459(2019).
  27. Baudouin, C., Denoyer, A., Desbenoit, N., Hamm, G., Grise, A. In vitro and in vivo experimental studies on trabecular meshwork degeneration induced by benzalkonium chloride (an American Ophthalmological Society thesis). Transactions of the American Ophthalmological Society. 110, 40-63 (2012).
  28. Schartau, J. M., Kroger, R. H., Sjogreen, B. Short-term culturing of teleost crystalline lenses combined with high-resolution optical measurements. Cytotechnology. 62 (2), 167-174 (2010).
  29. Truscott, R. J. Age-related nuclear cataract-oxidation is the key. Experimental Eye Research. 80 (5), 709-725 (2005).
  30. Deeley, J. M., et al. Human lens lipids differ markedly from those of commonly used experimental animals. Biochimica et Biophysica Acta. 1781 (6-7), 288-298 (2008).
  31. Bantseev, V., et al. Effect of hyperbaric oxygen on guinea pig lens optical quality and on the refractive state of the eye. Experimental Eye Research. 78 (5), 925-931 (2004).
  32. Choh, V., Sivak, J. G. Lenticular accommodation in relation to ametropia: the chick model. Journal of Vision. 5 (3), 165-176 (2005).
  33. Oriowo, O. M., et al. Evaluation of a porcine lens and fluorescence assay approach for in vitro ocular toxicological investigations. Alternatives to Laboratory Animals: ATLA. 30 (5), 505-513 (2002).
  34. van Doorn, K. L., Sivak, J. G., Vijayan, M. M. Optical quality changes of the ocular lens during induced parr-to-smolt metamorphosis in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss). Ocular lens optical quality during induced salmonid metamorphosis. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 191 (7), 649-657 (2005).
  35. Herbert, K. L., Sivak, J. G., Bell, R. C. Effect of diabetes and fructose/non-fructose diet on the optical quality (cataracts) of the rat lens. Current Eye Research. 19 (4), 305-312 (1999).
  36. Wormstone, I. M., Collison, D. J., Hansom, S. P., Duncan, G. A focus on the human lens in vitro. Environmental Toxicology and Pharmacology. 21 (2), 215-221 (2006).
  37. Oyster, C. W. The human eye: structure and function. Sinauer Associates. , Sunderland, Massachussetts. (1999).
  38. Xu, M., McCanna, D. J., Sivak, J. G. Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Oküler ToksisiteKatarakt DeğerlendirmesiLens Toksisite TestiIn Vitro AnalizSığır LensiRezazurin MetabolizmasıLens Lazer TarayıcıRefraktif Performans

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.