Rekombinant uzuvlar, hücre farklılaşma sürecini ve embriyonik sinyallerin etkisi altında kalıpların üretilmesini incelemeye izin veren güçlü bir deneysel modeldir. Bu protokol, farklı organizmalardan elde edilen diğer hücre tiplerine uyarlanabilen, tavuk ekstremite-mezodermal hücrelere sahip rekombinant uzuvlar üretmek için ayrıntılı bir yöntem sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Morfogenez, Desenleme ve Hücre Farklılaşmasında Erken Adımları Anlamak için Tavuk Rekombinant Uzuvları Testi
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre farklılaşması, gelişmekte olan doku ve organların kurulması sırasında farklı uzmanlaşmış hücre tiplerinin oluşumuna yol açan ince ayarlı hücre bağlılığı sürecidir. Bu süreç yetişkinlikte aktif olarak sürdürülür. Hücre farklılaşması, organların gelişimi ve homeostazı sırasında devam eden bir süreçtir. Hücre farklılaşmasının erken adımlarını anlamak, morfogenez gibi diğer karmaşık süreçleri bilmek için gereklidir. Bu nedenle, rekombinant tavuk uzuvları, embriyonik modelleme sinyalleri altında hücre farklılaşması ve desen üretiminin incelenmesine izin veren deneysel bir modeldir. Bu deneysel model in vivo bir ortamı taklit eder; yeniden toplanmış hücreleri, erken bir ekstremite tomurcuğundan elde edilen ektodermal bir örtüye birleştirir. Daha sonra, ektodermler, gelişimine izin vermek için bir civciv embriyo reseptörüne transfer edilir ve implante edilir. Bu tahlil esas olarak mezodermal ekstremite tomurcuk hücrelerini değerlendirmek için kullanılmıştır; Bununla birlikte, diğer organizmalardan diğer kök veya progenitör hücrelere uygulanabilir.
Giriş
Omurgalı uzuv, hücre farklılaşmasını, hücre çoğalmasını, hücre ölümünü, desen oluşumunu ve morfogeneziincelemek için zorlu bir modeldir 1,2. Gelişim sırasında, uzuvlar lateral plaka mezoderm1'den türetilen hücrelerden şişkinlikler olarak ortaya çıkar. Ekstremite tomurcukları, bir ektoderm tarafından kaplanmış mezodermal hücrelerin merkezi bir çekirdeğinden oluşur. Bu erken yapıdan, bütün ve iyi biçimlendirilmiş bir uzuv ortaya çıkar. Ekstremite tomurcuğu ortaya çıktıktan sonra, üç eksen tanınır: (1) proksimo-distal eksen ([PD] omuzdan parmaklara), (2) dorso-ventral eksen ([DV] elin arka....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu araştırma, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México'nun (UNAM, Mexico City, Meksika) Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. Bu protokolün genel adımlarının şematik bir akış şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir.
1. Embriyo inkübasyonu ve canlılığın belirlenmesi
- Döllenmiş tavuk yumurtalarını 38 ° C'de ve% 60 bağıl nemde, 22 HH aşamasına ulaşana kadar yaklaşık üç buçuk gün boyunca inkübe edin (Hamilton ve Hamburger, 1951'e göre)16.
NOT: Ta....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İyi performans gösteren bir rekombinant uzuvun tanınması
Aşılamadan sonra, manipüle edilen embriyolar, RL'nin gelişmesine izin vermek için inkübatöre geri gönderildi. Kuluçka süresi, deneyin gereklilikleri ile ilişkiliydi. Bununla birlikte, RL implantasyonun 12 saatinden sonra kolayca ayırt edilebilir. İmplantasyonun yeterli olup olmadığını belirlemek için RL, donör embriyonun mezodermal duvarına güvenli bir şekilde tutturulmuş bir çıkıntı olarak gözlendi (Şekil 2A). Aksi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Genel olarak, RL protokolü beş adıma ayrılabilir: (1) embriyo inkübasyonu, (2) ektodermleri doldurmak için uzuv mezodermal hücrelerinin elde edilmesi, (3) ektodermlerin elde edilmesi, (4) mezodermal hücrelerin ektodermal kapakların içine monte edilmesi ve (5) doldurulmuş ektodermlerin konakçı embriyolara nakli. RL tekniğinin en büyük sınırlaması, uygun şekilde performans göstermek için sabır gerektiren birçok kritik noktaya sahip olan uzun, ayrıntılı protokoldür. Protokolü başarıyla tamamlamak için kritik anların belirle.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Şekil 2'deki görüntüler için Estefania Garay-Pacheco'ya ve sanat eseri için Maria Valeria Chimal-Montes de Oca'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, JC-M'ye verilen Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [hibe numaraları IN211117 ve IN213314] ve Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [hibe numarası 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] tarafından desteklenmiştir. JC M-L, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología'dan (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887) doktora sonrası burs aldı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Açılı yarık bıçak | Alcon | 2.75mm DB | |
| Künt forseps | Güzel Bilim Araçları | 11052-10 | |
| Kollajenaz tip IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Yumurta kuluçka makinesi | Incumatic de Mexico | Incumatic 1000 | |
| Fetal Sığır Serumu | Gibco | 16000069 | |
| İnce cerrahi forseps | Güzel Bilim Araçları | 9115-10 | |
| Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi | Sigma | H6648 | |
| Mikrosantrifüj | Eppendorf | 5417R | |
| Mikropipet | NA | NA | |
| Paladyum teli | GoodFellow | 7440 05-3 | |
| Petri kabı | Yuva | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Stereomikroskop | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Bant | NA | NA | |
| Tripsin domuz | Merck | 9002 07-7 | |
| Tungsten iğne | GoodFellow | E74-15096/01 |
Kaynaklar
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
