İn Vitro Histon Chaperonlarının Analitik, Pull-Down ve Chaperoning Testleri Kullanılarak Karakterizasyonu

DNA ve histon proteinlerinden oluşan nükleozomlar, kromatinin yapısal birimini oluşturur ve birkaç kritik hücresel olayı düzenler. Nükleozomlar, DNA'yı replikasyon, transkripsiyon ve çeviri ^1,2 gibi çeşitli süreçlere erişilebilir kılmak için dinamik olarak yeniden konumlandırılır ve yeniden şekillendirilir. Son derece bazik olan histonlar ya hücresel ortamdaki asidik proteinlerle etkileşime girme eğilimindedir ya da kümelenmeye uğrar, böylece çeşitli hücresel kusurlara yol açar ^3,4,5. Histon şaperonları adı verilen bir grup özel protein, histonların sitoplazmadan çekirdeğe taşınmasına yardımcı olur ve anormal histon-DNA agregasyon olaylarını önler ^6,7. Temel olarak, çoğu histon şaperonu, histonları fizyolojik iyonik güçte DNA üzerine depolar ve aktarır, böylece nükleozomların oluşumuna yardımcı olur ^8,9. Bazı histon şaperonların histon oligomerleri H2A/H2B veya H3/H4¹⁰ için kesin bir tercihi vardır.

Histon şaperonları, DNA sentezine bağımlı veya bağımsız nükleozomları birleştirme yeteneklerine dayanarak karakterize edilir¹¹. Örneğin, kromatin montaj faktörü-1 (CAF-1) bağımlıyken, histon regülatörü A (HIRA) DNA sentezi ^12,13'ten bağımsızdır. Benzer şekilde, histon şaperonların nükleoplazman ailesi, sperm kromatin dekondensasyonu ve nükleozom montajı^14'te rol oynar. Nükleozom montaj proteini (NAP) ailesi üyeleri, in vitro nükleozom benzeri yapıların oluşumunu kolaylaştırır ve sitoplazma ile çekirdek¹⁵ arasındaki histonların kesilmesinde rol oynar. Nükleoplazminler ve NAP ailesi proteinlerin her ikisi de fonksiyonel histon şaperonlarıdır, ancak herhangi bir yapısal özelliği paylaşmaz. Temel olarak, tek bir yapısal özellik, bir proteinin histon şaperon¹⁶ olarak sınıflandırılmasına izin vermez. Fonksiyonel ve biyofiziksel testlerin yapısal çalışmalarla birlikte kullanımı, histon şaperonları karakterize etmede en iyi sonucu verir.

Bu çalışma, bir proteini nükleozom montajına yardımcı olan bir histon şaperonu olarak karakterize etmek için biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemleri açıklamaktadır. İlk olarak, histon şaperonların oligomerik durumunu ve stabilitesini analiz etmek için analitik boyut dışlama kromatografisi yapıldı. Daha sonra, histon şaperon-histon etkileşimlerinin itici güçlerini ve rekabetçi doğasını belirlemek için bir pull-down testi yapıldı. Bununla birlikte, bu etkileşimlerin hidrodinamik parametreleri, proteinin şekli ve kolon boyunca göçlerini etkileyen kompleksleri nedeniyle analitik boyut dışlama kromatografisi kullanılarak doğru bir şekilde hesaplanamamıştır. Bu nedenle, doğru moleküler ağırlık, etkileşimin stokiyometrisi ve biyolojik moleküllerin şeklini içeren çözelti içi makromoleküler özellikler sağlayan analitik ultrasantrifüjleme kullanılmıştır. Geçmiş çalışmalar, yScS116¹⁷, DmACF¹⁸, ScRTT106p¹⁹, HsNPM1²⁰ gibi histon şaperonları fonksiyonel olarak karakterize etmek için in vitro histon chaperoning testini yaygın olarak kullanmıştır. Histon chaperoning testi, proteinleri histon şaperonlar olarak fonksiyonel olarak karakterize etmek için de kullanılmıştır.

1. Histon şaperonların oligomerik durumunu ve stabilitesini aydınlatmak için analitik boyut dışlama kromatografisi

1. Histon şaperonların oligomerik durumunun analizi
   1. 24 mL'lik bir analitik boyut dışlama kromatografisi (SEC) kolonunu 1,2 sütun hacmi (CV), yani 28,8 mL gazdan arındırılmış SEC tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl ve 1 mM β-merkaptoetanol (β-ME)] ile 4 °C'de dengeleyin (bkz.
      NOT: Sütun tipi, tampon bileşimi ve tampon pH'ı, ilgili proteine göre seçilebilir. Numune enjeksiyon hacmi, 24 mL'lik bir sütun için 500 μL'yi geçmemelidir. Ayrıca, kolon basıncının 5 MPa'nın altında tutulması gerekir.
   2. Daha yüksek konsantrasyonlu bir protein stok çözeltisinden, gazdan arındırılmış SEC tamponunda 500 μL 0.5 mg / mL protein numunesi hazırlayın ve 500 μL'lik bir enjeksiyon döngüsü kullanarak önceden dengelenmiş kolona enjekte edin. Kromatografi çalışmasının, 4 ° C'de SEC tamponu ile 0.2-0.3 mL / dak izokratik akış hızında ilerlemesine izin verin.
   3. 280 nm dalga boyunda absorbansı ölçerek proteinin elüsyon profilini izleyin. Aromatik kalıntıları olmayan proteinlerle uğraşırken, absorbansı 214 nm'de ölçün.
   4. Standart kalibrasyon eğrisi^21'i kullanarak kDa cinsinden yaklaşık moleküler ağırlığını hesaplamak için proteinin elüsyon hacmini kullanın.
      NOT: Kalibrasyon eğrisi, bilinen moleküler ağırlıklı proteinlerin tutma hacminin, aynı sütun kullanılarak salınan ilgili moleküler ağırlıklarının kütüğüne (log Mr) karşı çizilmesiyle hazırlanır.
2. Histon şaperonların termal stabilitesinin analizi
   1. Gazdan arındırılmış SEC tamponunda (1.1.1'de kullanılanla aynı) hazırlanan protein örneğinin 500 μL'sini ayrı ayrı mikrosantrifüj tüplerinde alın ve her tüpü bir su banyosunda 10 dakika boyunca 20 °C ile 90 °C (20 °C, 40 °C, 60 °C ve 90 °C) arasında değişen belirli bir sıcaklığa ısıtın.
   2. Daha sonra, ısıl işlem görmüş numuneleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüj edin, süpernatantı bir mikropipetle toplayın ve 4 ° C'de SEC tamponu ile önceden dengelenmiş analitik kolona 500 μL'lik bir enjeksiyon döngüsü kullanarak her numuneyi ayrı ayrı enjekte edin.
   3. Kromatografi çalışmasının, 4 ° C'de SEC tamponu ile 0.2-0.3 mL / dak izokratik akış hızında ilerlemesine izin verin.
   4. Elüsyon zirvelerinin konumunu ve yüksekliğini gözlemleyin ve farklı numuneler için ek piklerin görünümünü arayın.
3. Histon şaperonların kimyasal stabilitesinin analizi
   1. Histon şaperonların tuz stabilitesini incelemek için, bir Tris tamponunda [20 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 1 mM β-ME] hazırlanan 500 μL 0.5 mg / mL protein numunesini, 4 ° C'de 30 dakika boyunca ayrı mikrosantrifüj tüplerinde artan NaCl konsantrasyonları (300 mM, 600 mM, 1 M, 1.5 M ve 2 M) ile desteklenmiş olarak inkübe edin. Numuneleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı koruyun.
   2. Daha sonra, protein numunelerini farklı NaCl konsantrasyonlarında ayrı ayrı yükleyin, 500 μL'lik bir enjeksiyon döngüsünü kullanarak, 4 ° C'de artan NaCl konsantrasyonlarını içeren ilgili tamponun 1.2 CV'si (28.8 mL) ile önceden dengelenmiş analitik kolona yerleştirin.
   3. Kromatografi çalışmasının, 4 ° C'de ilgili tamponun 1 CV'si (24 mL) ile 0.2-0.3 mL / dak'lık izokratik akış hızında ilerlemesine izin verin.
   4. Elüsyon zirvelerinin konumunu ve yüksekliğini gözlemleyin ve farklı numuneler için ek piklerin görünümünü arayın.
   5. Benzer şekilde, üre stabilite analizi için, bir Tris tamponunda [20 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 1 mM β-ME] hazırlanan 500 μL 0.5 mg / mL protein numunesini, oda sıcaklığında 16 saat boyunca ayrı mikrosantrifüj tüplerinde artan üre konsantrasyonları (1 M, 2 M, 3 M, 4 M ve 5 M) ile desteklenmiş olarak inkübe edin. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı saklayın.
   6. Daha sonra, üre ile muamele edilmiş protein numunelerini, oda sıcaklığında farklı üre konsantrasyonları içeren karşılık gelen tamponun 1.2 CV'si (28.8 mL) ile önceden dengelenmiş analitik sütuna 500 μL'lik bir enjeksiyon döngüsü kullanarak ayrı ayrı yükleyin.
   7. Kromatografi çalışmasının, oda sıcaklığında ilgili tamponun 1 CV'si (24 mL) ile 0.2-0.3 mL / dak izokratik akış hızında ilerlemesine izin verin.
      DİKKAT: Üre kristalleşme ve kolona zarar verme eğiliminde olduğundan üre içeren tampon ile deneyleri daha düşük bir sıcaklıkta yapmayın.
   8. Elüsyon zirvelerinin konumunu ve yüksekliğini gözlemleyin ve farklı numuneler için ek piklerin görünümünü arayın.

2. Histon oligomerleri ve histon şaperon arasındaki karmaşık formasyona katkıda bulunan etkileşimlerin türünü anlamak için tuz gradyanı tabanlı pull-down testleri

1. Pull-down testinin her reaksiyonu için, 40 μL Ni-NTA reçinesini bir spin kolonuna pipet edin ve steril çift damıtılmış su ile yıkayın. Daha sonra, reçineyi 100 CV (4 mL) denge tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 10 μg / mL BSA ve 1 mM β-ME] ile dengeleyin (bkz.
   NOT: Pull-down, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde de gerçekleştirilebilir.
2. His etiketli histon şaperonun 5 μM'sini denge tamponunda 20 μM histon H2A/H2B dimer veya H3/H4 tetramer ile karıştırarak numuneyi hazırlayın. Numuneyi 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   NOT: H2A/H2B dimer ve H3/H4 tetramer, rekombinant insan histonları^21'den hazırlanır ve oligomerlerin bütünlüğü, analitik ultrasantrifüjleme (AUC) ile tahmini moleküler kütlelere dayanarak doğrulanır. Aşağıda belirtilen tüm deneyler için aynı histon oligomerler kullanılmıştır.
3. Numuneleri, her biri belirli bir tuz konsantrasyonu için etiketlenmiş adım 2.1'den itibaren Ni-NTA reçinesi ile ayrı önceden dengelenmiş spin kolonlarına yükleyin ve sütunları 4 ° C'de 30 dakika boyunca saklayın. Kolonları 1 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj yapın.
4. Daha sonra, sütunları farklı tuz konsantrasyonları (yani, 300 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM ve 1 M NaCl) içeren 100 CV (4 mL) yıkama tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 500 mM, 500 mM, 800 mM, 900 mM ve 1 mM β-ME] ile yıkayın. Her sütunu belirli bir tuz konsantrasyonuna sahip bir tamponla yıkayın.
5. Tuz yıkama adımından sonra, 100 μL elüsyon tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 300 mM imidazol ve 1 mM β-ME] kullanarak proteini farklı sütunlardan süzün.
6. Daha sonra, salınan numuneleri %18 SDS-PAGE^22'ye tabi tutun ve Coomassie Brilliant Blue R250 ile boyandıktan sonra jeli görselleştirin (bkz. Alternatif olarak, bağlı proteini Ni-NTA reçinesinden salmak yerine reçineyi doğrudan SDS-PAGE jeline yükleyebilirsiniz.
   NOT: Dengeleme, yıkama ve elüsyon tampon bileşimleri ve pH, ilgilenilen proteine bağlı olarak değiştirilebilir.

3. H2A/H2B veya H3/H4 için histon şaperon tercihini belirlemek için rekabetçi pull-down testi

1. Döndürme sütununu adım 2.1'de açıklandığı gibi hazırlama
2. Histon şaperonun 5 μM'sini, buz üzerinde 30 dakika boyunca 300 μL denge tamponunda (adım 2.1'de hazırlanan) 20 μM H2A/H2B dimer ile inkübe edin.
   NOT: Reaksiyondaki histon oligomerin histon şaperona oranı, bilinen bağlayıcı stokiyometri verilerine dayanarak seçilebilir; bilgi yoksa beş kat fazla histon kullanın.
3. Herhangi bir çökeltiyi gidermek için histon şaperon-H2A / H2B kompleksini 16.200 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Daha sonra, numuneyi denge tamponu (adım 2.1'de hazırlanan) ile önceden dengelenmiş spin kolonuna yükleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
4. Fazla H2A/H2B dimerini gidermek için kolonu 100 CV (4 mL) yıkama tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 50 mM imidazol, %0.2 Tween-20 ve 1 mM β-ME] ile yıkayın. Daha sonra, histon şaperon-H2A / H2B kompleksini 20-60 μM H3 / H4 tetramer ile karıştırın ve buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.
5. Kolonu 100 CV (4 mL) yıkama tamponu (adım 3.4'te hazırlanmış) ile yeniden yıkayarak bağlanmamış H3/H4 tetramerini çıkarın ve numuneyi elüsyon tamponu (adım 2.5'te hazırlanmış) kullanarak süzün. Salınan numuneleri %18 SDS-PAGE'e tabi tutun ve Coomassie Brilliant Blue R250 ile boyandıktan sonra görselleştirin.
   NOT: Tahlil tersine çevrilebilir, burada ilk önce H3 / H4 tetrameri şaperon ile karıştırılabilir, kompleks Ni-NTA boncuklarına bağlanmasına izin verilir ve kompleks daha sonra değişen konsantrasyonlarda H2A / H2B dimer ile inkübe edilebilir.

4. Histon şaperonlar ve histonlar arasındaki bağlanma stokiyometrisini analiz etmek için analitik ultrasantrifüjleme - sedimantasyon hızı (AUC-SV) deneyleri

1. AUC için numune hazırlama
   1. Yeniden yapılandırılmış histon H2A/H2B dimer, H3/H4 tetramer ve histon şaperonu ayrı ayrı 7 kDa kesilmiş diyaliz tüpü²³ aracılığıyla, diyaliz tamponuna [20 mM Tris (pH 7.5), 300 mM NaCl ve 1 mM β-ME] karşı diyaliz edin (bkz. Arabellek uyuşmazlığından kaynaklanan arka plan hatasını en aza indirmek için, diyaliz tamponuna karşı, tercihen 24 saatlik bir süre boyunca üç kez diyalizi kapsamlı bir şekilde gerçekleştirin.
      NOT: Protein örneklerinin ilk OD 280'i, 0.3-0.5'lik son OD_280'i elde etmek için iki ila üç kat daha yüksek bir değere sahip olmalıdır. Bu aslında seyreltmenin etkilerini geçersiz kılmak için yapılır.
   2. H2A/H2B dimer, H3/H4 tetramer ve histon şaperonu diyaliz tamponu ile ayrı ayrı saflaştırın, analitik boyut dışlama kromatografisini kullanarak (1. adımda belirtildiği gibi). Daha sonra daha fazla seyreltme hazırlamak ve AUC hücresinde referans olarak kullanmak için arabelleği çalıştırmadan kaydedin.
2. AUC için örnek yükleme
   1. Saflaştırılmış proteinleri, 0.3-0.6'lık bir OD_280'e ulaşmak için adım 4.1.1'den diyaliz tamponunu kullanarak 450 μL'lik son bir hacimde karıştırın. Ayrı reaksiyon tüplerinde kompleks oluşum için histon şaperonu H2A/H2B dimer veya H3/H4 tetramer ile karıştırın. Protein karışımlarını 2-3 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Alternatif olarak, çökeltme verileri analitik ultrasantrifüjdeki parazitli optik tarama sistemi ile elde edilebilir. Ayrı olarak, saflaştırılmış proteinleri karıştırmak için, histon şaperon konsantrasyonunu sabitleyin ve tam stokiyometriyi elde etmek için histon oligomerlerinin artan konsantrasyonlarıyla inkübe edin.
   2. AUC-SV deneyi için hücreyi, daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi analitik ultrasantrifüjün bir absorbans dedektörünü kullanarak çift sektörlü bir merkez parçası ve kuvars pencerelerle birleştirin²⁴.
   3. 400 μL numune çözeltisini ve 420 μL diyaliz tamponunu hücrenin iki sektörüne (sırasıyla numune ve referans sektörleri) doldurun.
      NOT: Referans menisküsünü numunenin menisküsünün üzerinde tutmak için referans sektöründe daha büyük hacimli tampon kullanılır. Bununla birlikte, bir optik girişim sistemi kullanırken, iki sektörü eşit hacimle doldurun.
   4. Hücreleri tartın ve doğru bir şekilde dengeleyin ve dört yerli titanyum rotora yükleyin ( bkz. Hücrelerin ve rotorun altında verilen işaretleri kullanarak hücreleri hizalayın. Rotoru santrifüje yükleyin, kapağı kapatın ve basınç 15 mikrondan daha az Hg'ye düşene ve rotor sıcaklığı 20 ° C'ye sabitlenene kadar (genellikle 2-2,5 saat sürer) bir vakum gelişmesine izin verin.
      NOT: AUC çalışma parametreleri deneysel sıcaklığı, rotor hızını, taramalar arasındaki aralığı ve toplanacak tarama sayısını içerir. SV deneylerinde, tarama aralığı proteinin moleküler kütlesine göre verilir; daha küçük proteinler, taramalar arasında daha büyük zaman aralıkları gerektirir. Rotor hızı da proteinin beklenen moleküler kütlesine göre ayarlanır ve deney 20 ° C'de gerçekleştirilir. Absorbans verileri 280 nm'de izlenir.
   5. Tam stokiyometriyi elde etmek için, histon şaperon konsantrasyonunu sabit tutun ve doygunluğa ulaşmak için artan histon oligomer konsantrasyonları ile inkübe edin.
3. AUC veri analizi
   1. Veri analizini daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirin²⁵. Kısaca, SEDNTERP²⁶ programını kullanarak tampon bileşenlerinin yoğunluğunu ve viskozitesini hesaplayın (bkz. Benzer şekilde, SEDNTERP kullanarak amino asit bileşimine dayanarak proteinin kısmi spesifik hacmini hesaplayın.
   2. AUC makinesindeki verileri SEDFIT²⁷ programına yükleyin ve menisküs (kırmızı çizgi), hücre alt kısmı (mavi çizgi) ve veri analizi sınırlarını (yeşil çizgiler) tanımlayın. Model olarak sürekli C(s) dağılımını seçin.
   3. Ardından, çözünürlüğü maksimum 100'e kadar ayarlayın; set çökeltme katsayısı (lar), s min: 0 ve s max: 10-15; sürtünme oranını başlangıçta 1,2 olarak ayarlayın ve oranın verilerden türetilmesi için yüzmeyi tercih edin; 1 sigma düzenlileştirme için güven seviyesini (F-oranı; düzenlileştirmenin büyüklüğünü belirleyen) 0,68'e ayarlayın; SEDNTERP'den elde edilen kısmi spesifik hacim, tampon yoğunluğu ve tampon viskozite değerlerini ayarlayın.
   4. Yazılımın Lamm denklemi^27'yi çözmesine izin vermek için RUN tuşuna basın. Önemli bir veri uyuşmazlığı varsa parametreleri ayarlayın. Parametreleri ayarladıktan sonra, tüm parametreleri hassaslaştırmak için FIT tuşuna basın. Uyum kalitesini, 0,01 sinyal biriminden az olması gereken kök-ortalama-kare sapma (RMSD) değerine göre değerlendirin.
   5. Seçeneği seçerek zirvelerin moleküler kütlelerini tahmin edin: molekülün / kompleksin 's'si hakkında bilgi sağlayacak olan ana araç çubuğunun görüntüleme işlevinde "Mw in c(s)" tepe noktasını gösterin.

5. Histon chaperoning fonksiyonunu doğrulamak için plazmid süper sarma testi

1. Nükleozom montaj reaksiyonu
   1. Bir montaj tamponunda 2 μM H3/H4 tetramer ve 4 μM H2A/H2B dimerini artan konsantrasyonlarla karıştırın [20 mM Tris HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 1 mM MgCl₂, 0.1 mg/mL BSA ve 100 mM NaCl] 50 μL'lik son hacme kadar karışımı 4 °C'de 30 dk.
   2. Aynı zamanda, ayrı bir reaksiyonda, negatif süper sarmal pUC19 plazmidinin 500 ng'sini, montaj tamponunda 50 μL'lik son bir hacimde 1 μg topoizomeraz I enzimi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile ön işlemden geçirin ve 30 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Topoizomeraz I, tek sarmallı bir çentik üreterek süper sarmal çift sarmallı plazmid DNA'sını gevşetir. Ticari olarak temin edilebilen buğday tohumu topoizomeraz I veya rekombinant olarak eksprese edilen Drosophila melanogaster topoizomeraz I gibi ökaryotik kökenli bir topoizomeraz I enzimi kullanılabilir.
   3. Daha sonra, H3 / H4 tetramer, H2A / H2B dimer, histon şaperon karışımı (adım 5.1.1'den itibaren), gevşemiş plazmid DNA reaksiyon karışımını (adım 5.1.2'den itibaren) birleştirin ve 90 dakika boyunca 30 ° C'de daha fazla inkübe edin.
      NOT: Tahlil için iki kontrol reaksiyonu ayarlayın; biri histon şaperon ve gevşemiş plazmid DNA'sına (ancak histonlara değil), diğeri histon oligomerlerine ve gevşemiş plazmid DNA'sına (ancak histon şaperona değil) sahiptir.
   4. 100 μL 2x durdurma tamponu (40 mM EDTA, %2 SDS ve 0,4 mg/mL proteinaz K) ekleyerek montaj reaksiyonunu durdurun ve 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Stop buffer, bağlı histonların denatürasyonu ve proteolizi ile plazmid DNA'sını deproteinize eder.
2. Fenol-kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesi
   1. Adım 5.1.4'ten itibaren reaksiyon karışımını içeren tüpe eşit miktarda Tris doymuş fenol ekleyin ve iyice karıştırın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüjleme yapın.
   2. Plazmid DNA'sına sahip üst sulu fazı bir mikropipetle nazikçe toplayın ve eşit miktarda kloroform ile karıştırın. Karışımı vorteks edin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüj yapın.
      NOT: İzoamil alkol, sulu ve organik fazlar arasında bulanık bir arayüzden kaçınmak için bu adıma dahil edilebilir.
   3. Daha sonra, üst sulu fazı toplayın, 1/10 hacim 3 M sodyum asetat (pH 5.5) ve 2.5 hacim buz gibi soğuk etanol ekleyin (bkz. Tüpü 3-4 kez ters çevirerek çözeltiyi iyice karıştırın ve plazmid DNA'sının tamamen çökelmesi için karışımı -20 ° C'lik bir dondurucuda 30 dakika boyunca saklayın.
   4. Numuneyi 16200 x g'de 5.2.3 adımından 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı yavaşça atın. Tüpleri, eser miktarda etanol buharlaşana kadar oda sıcaklığında açık tutun ve çökelmiş plazmid DNA'sını tüpte bırakın.
3. Plazmid süper sarmal etkisini gözlemlemek için agaroz jeli elektroforezini gerçekleştirin.
   1. Çökeltilmiş plazmid DNA'sını 5.2.4 adımından steril çift damıtılmış suda çözün.
   2. Numuneleri 1x Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponunda (40 mM Tris, 20 mM asetik asit ve 1 mM EDTA) %1'lik bir agaroz jeli üzerinde çözün (bkz.
   3. Jeli 0.2-0.5 μg / mL ethidyum bromür konsantrasyonu ile lekeleyin ve jel üzerindeki DNA bantlarını görselleştirmek için UV altında gözlemleyin.

Arabidopsis thaliana'dan FKBP53 proteininin rekombinant N-terminal nükleoplazmin alanı analitik SEC'e tabi tutuldu. Elüsyon tepe hacmi, oligomerik durumunu tanımlamak için standart eğriye karşı çizildi. Analitik SEC sonuçları, alanın çözelti içinde yaklaşık 58 kDa'lık bir moleküler kütleye sahip bir pentamer olarak var olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 1A, B). Ayrıca, nükleoplazmin alanı, analitik SEC ile birlikte termal ve kimyasal stabilite için analiz edildi. 90 ° C'ye kadar ısıl işleme tabi tutulan nükleoplazman numunesi, 20 ° C'de tutulan numunelere kıyasla elüsyon hacminde ve tepe yüksekliğinde belirgin bir kayma göstermedi, bu da alanın oldukça termostabil olduğunu düşündürmektedir (Şekil 1C). Benzer şekilde, nükleoplazman alanı 2 M'ye kadar NaCl (Şekil 1D) tuz stabilitesi ve 4 M'ye kadar üre stabilitesi göstermiştir (Şekil 1E). Bununla birlikte, nükleoplazmin pentameri daha yüksek üre konsantrasyonlarında ayrışmaya başladı.

Histon şaperon (AtFKBP53'ün nükleoplazmazmin alanı) ile histon oligomerleri H2A / H2B dimer ve H3 / H4 tetramer arasındaki karmaşık formasyona katkıda bulunan etkileşimlerin tipini belirlemek için gradyan tuz yıkama kullanılarak bir pull-down testi yapıldı. Nükleoplazmin alanının H2A/H2B dimer ile etkileşimi 0.4 M NaCl tuz konsantrasyonuna kadar stabildi (Şekil 2A). Buna karşılık, H3 / H4 ile ilişki 0.7 M NaCl'ye kadar oldukça kararlıydı (Şekil 2B). Şaperon-histon komplekslerinin yüksek tuz konsantrasyonuna dayanma kabiliyeti, komplekslerin stabilize edilmesinde hidrofobik etkileşimlerin rolünü düşündürmektedir. H3 / H4'ün yüksek tuz konsantrasyonlarında bile stabil olduğu şaperon kompleksi, kompleks oluşumunda hidrofobik etkileşimlerin baskın bir rol oynadığını göstermektedir. H2A/H2B-şaperon kompleksinin yüksek tuz konsantrasyonlarındaki düşük stabilitesi, kompleks oluşumunda elektrostatik etkileşimler için önemli bir rol oynadığını ortaya koymaktadır. Başka bir deneyde, aşağı çekme testi, şaperonun H2A / H2B dimerini mi yoksa H3 / H4 tetramerini mi tercih ettiğini incelemek için kullanıldı. Sonuçlar, şaperonun H2A/H2B dimer ve H3/H4 tetramerine aynı anda ve şaperona eklenme sırasına bakılmaksızın bağlandığını ortaya koymuştur (Şekil 2C,D). Bu, şaperonun histon oligomerlerle etkileşimi için ayrı bölgelere sahip olduğunu gösterdi.

AUC-SV deneyleri (Şekil 3), histon oligomerleri ve şaperonlar arasındaki etkileşimin stokiyometrisini incelemek için yapıldı. AUC-SV veri analizi, 104 kDa'lık bir moleküler kütleye karşılık gelen H2A / H2B ile kompleks halindeki AtFKBP53 nükleoplazman alanı için 5.40 S'lik bir çökeltme katsayısı (s) değeri sağlamıştır. H3 / H4 ile nükleoplazmin alanının kompleksi, 129 kDa'ya karşılık gelen 7.35 S'lik bir çökeltme katsayısı değeri verdi. Komplekslerin tahmini moleküler kütlesi, pentamerik nükleoplazmanın 1: 1 stokiyometride hem H2A / H2B dimer hem de H3 / H4 tetramer ile kompleks oluşturduğunu ortaya koymaktadır.

Proteinin, bir histon şaperon olduğunu doğrulamak için histon oligomerleri DNA üzerine biriktirebileceğini göstermek önemlidir. Bu amaçla plazmid süperbobinleme testi kabul edilmiştir (Şekil 4). Gevşemiş dairesel plazmid, H2A/H2B ve H3/H4 histon oligomerleri ile NAP ailesinin rekombinant bitki histon şaperonları - AtNRP1 veAtNRP2 28 ile inkübe edildi. Şaperonun varlığı, süper sarmal plazmid miktarını arttırdı, bu da nükleozomları oluşturmak için DNA'ya histonlar bırakabileceğini ve DNA süper sarılmasına neden olabileceğini düşündürdü.

Şekil 1: AtFBP53'ün nükleoplazman alanının oligomerik durumu ve stabilitesi. (A) AtFKBP53 nükleoplazman alanının analitik boyut-dışlama kromatografi profili. (B) Bilinen moleküler kütlenin küresel proteinleri kullanılarak elde edilen kalibrasyon eğrisi. Mavi noktalar bilinen proteinlerin moleküler kütlesini temsil ederken, kırmızı nokta AtFKBP53 nükleoplazman alanını temsil eder. (440 kDa - ferritin, 158 kDa-aldolaz, 75 kDa-con albümin, 44 kDa-ovalbümin, 6.5 kDa-aprotinin). (C) Farklı sıcaklıklarda ısıl işleme tabi tutulan 0,5 mg/mL AtFKBP53 nükleoplazmin alanının 500 μL'lik analitik boyut dışlama kromatogramı: 20 °C (yeşil), 40 °C (turuncu), 60 °C (siyah), 90 °C (açık mavi). (D) Farklı NaCl konsantrasyonları içeren tamponlarda 0,5 mg/mL AtFKBP53 nükleoplazmazmin alanının 500 μL'lik analitik boyut dışlama kromatogramı: 0,3 M (mor), 0,6 M (kırmızı), 1,0 M (açık mavi), 1,5 M (yeşil), 2,0 M (siyah). (E) Farklı üre konsantrasyonlarına sahip tamponlarda AtFKBP53 nükleoplazman alanının analitik boyut dışlama kromatogramı: 0 M (kontrol; açık mavi), 1.0 M (pembe), 2.0 M (siyah), 3.0 M (koyu mavi), 4.0 M (yeşil), 5.0 M (kahverengi). Nükleoplazmain pentameri, termal ve kimyasal stres koşullarına karşı yüksek stabilite gösterir. Şekil Referans21'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: AtFKBP53'ün nükleoplazman alanının histon oligomerlerle etkileşimi için aşağı çekme testleri. Tahlillerden elde edilen elüsyon fraksiyonlarının% 18'lik SDS-PAGE görüntüleri burada sunulmuştur. Burada negatif kontrol olarak ( A ) 20 μM H2A/H2B dimer ve (B) 5 μM AtFKBP53 nükleoplazmazmin alanına sahip 20 μM H3/H4 tetramer için 0,3 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,8 M, 0,9 M ve 1,0 M. 5 μM AtFKBP53 FKBD aralığında artan konsantrasyonlarda pull-down testi kullanılmıştır. Rekabetçi bağlama deneyi için, ( C ) 20-60 μM H2A/H2B dimer aralığında inkübe edilmiş 5 μM AtFKBP53 nükleoplazman alanı ve 20 μM H3/H4 tetramer karışımı ve (D) 20-60 μM H3/H4 tetramer aralığı ile inkübe edilmiş 5 μM AtFKBP53 nükleoplazmazmin alanı ve 20 μM H2A/H2B dimer karışımı kullanılmıştır. AtFKBP53 etiketi, AtFKBP53'ün nükleoplazman alanına karşılık gelir. Elüsyon fraksiyonları, her iki histon oligomerinin nükleoplazmine eşzamanlı bağlandığını gösterir. Şekil Referans21'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Histon oligomerlerinin, AtFKBP53'ün nükleoplazmazmin alanının ve komplekslerinin analitik ultrasantrifüjleme - sedimantasyon hızı (AUC-SV) deneyi. AUC mesafe dağılımı ve çökeltme katsayısı (S) grafiği. Elde edilen sedimantasyon katsayısı/katsayısı değerleri ve moleküler kütleler de sağlanır. AtFKBP53 etiketi, AtFKBP53'ün nükleoplazman alanına karşılık gelir. Tahmini moleküler kütleler, histon oligomerleri H2A / H2B dimer ve H3 / H4 tetramer ile AtFKBP53 nükleoplazmazmin alanı için 1: 1 stokiyometri ortaya koymaktadır. AUC-SV deneyleri için OD280 değeri 0.3-0.5 olan tüm protein örneklerinin 450 μL'si kullanılmıştır. Şekil Referans21'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Plazmid süper sarmal testi. Histon şaperonlar AtNRP1 ve AtNRP2 için plazmid süper sarma testi. Deney için 500 ng pUC19 plazmid DNA'sı 1 μg Topoizomeraz I ile ön işlemden geçirildi. 4 μM AtNRP1, 4 μM AtNRP2 ve 4 μM H2A / H2B dimer ve 2 μM H3 / H4 tetramer karışımı, önceden işlenmiş pUC19 DNA ile inkübe edildiğinde süper sarma aktivitesi göstermeyen kontrol olarak görülmüştür. 4 μM H2A / H2B dimer ve 2 μM H3 / H4 tetramer karışımı ve AtNRP1 ve AtNRP2'nin her biri 4 μM karışımına sahip şeritler, önceden işlenmiş pUC19 DNA ile inkübasyon üzerine süper sarmal DNA oluşumunu gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.