Method Article

İn Vitro Histon Chaperonlarının Analitik, Pull-Down ve Chaperoning Testleri Kullanılarak Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/63218

⸱

December 29th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology, KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 5Department of Pharmacology, University of Vermont College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, histon şaperon oligomerizasyonu ve stabilitesini incelemek için analitik boyut dışlama kromatografisini, histon şaperon-histon etkileşimlerini çözmek için aşağı çekme testini, protein komplekslerinin stokiyometrisini analiz etmek için AUC'yi ve in vitro varsayılan bir histon şaperonu işlevsel olarak karakterize etmek için histon chaperoning testini içeren bir dizi yöntemi tanımlamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histon proteinleri, ökaryotik kromatini oluşturmak için DNA ile birleşir. Kromatinin temel birimi, DNA tarafından sarılmış çekirdek histonları H2A, H2B, H3 ve H4'ün iki kopyasından oluşan bir histon oktamerden oluşan bir nükleozomdur. Oktamer, bir H2A / H2B dimerinin iki kopyasından ve bir H3 / H4 tetramerinin tek bir kopyasından oluşur. Yüksek yüklü çekirdek histonları, hücresel sitoplazma ve çekirdekteki çeşitli proteinlerle spesifik olmayan etkileşimlere eğilimlidir. Histon şaperonları, histonlardan çekirdeğe histonları taşıyan ve DNA üzerinde birikmelerine yardımcı olan, böylece nükleozom montaj sürecine yardımcı olan çeşitli bir protein sınıfı oluşturur. Bazı histon şaperonları H2A / H2B veya H3 / H4 için spesifiktir ve bazıları her ikisi için de şaperon olarak işlev görür. Bu protokol, pull-down testleri, analitik boyut dışlama kromatografisi, analitik ultra santrifüjleme ve histon chaperoning testi gibi in vitro laboratuvar tekniklerinin, belirli bir proteinin histon şaperonu olarak işlevsel olup olmadığını doğrulamak için birlikte nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA ve histon proteinlerinden oluşan nükleozomlar, kromatinin yapısal birimini oluşturur ve birkaç kritik hücresel olayı düzenler. Nükleozomlar, DNA'yı replikasyon, transkripsiyon ve çeviri 1,2 gibi çeşitli süreçlere erişilebilir kılmak için dinamik olarak yeniden konumlandırılır ve yeniden şekillendirilir. Son derece bazik olan histonlar ya hücresel ortamdaki asidik proteinlerle etkileşime girme eğilimindedir ya da kümelenmeye uğrar, böylece çeşitli hücresel kusurlara yol açar 3,4,5. Histon şaperonları adı verilen bir grup özel protein, histonların sitoplazmadan çekirdeğe taşınmasına yardımcı olur ve anormal histon-DNA agregasyon olaylarını önler 6,7. Temel olarak, çoğu histon şaperonu, histonları fizyolojik iyonik güçte DNA üzerine depolar ve aktarır, böylece nükleozomların oluşumuna yardımcı olur 8,9. Bazı histon şaperonların histon oligomerleri H2A/H2B veya H3/H410 için kesin bir tercihi vardır.

Histon şaperonları, DNA sentezine bağımlı veya bağımsız nükleozomları birleştirme yeteneklerine dayanarak karakterize edilir11. Örneğin, kromatin montaj faktörü-1 (CAF-1) bağımlıyken, histon regülatörü A (HIRA) DNA sentezi 12,13'ten bağımsızdır. Benzer şekilde, histon şaperonların nükleoplazman ailesi, sperm kromatin dekondensasyonu ve nükleozom montajı14'te rol oynar. Nükleozom montaj proteini (NAP) ailesi üyeleri, in vitro nükleozom benzeri yapıların oluşumunu kolaylaştırır ve sitoplazma ile çekirdek15 arasındaki histonların kesilmesinde rol oynar. Nükleoplazminler ve NAP ailesi proteinlerin her ikisi de fonksiyonel histon şaperonlarıdır, ancak herhangi bir yapısal özelliği paylaşmaz. Temel olarak, tek bir yapısal özellik, bir proteinin histon şaperon16 olarak sınıflandırılmasına izin vermez. Fonksiyonel ve biyofiziksel testlerin yapısal çalışmalarla birlikte kullanımı, histon şaperonları karakterize etmede en iyi sonucu verir.

Bu çalışma, bir proteini nükleozom montajına yardımcı olan bir histon şaperonu olarak karakterize etmek için biyokimyasal ve biyofiziksel yöntemleri açıklamaktadır. İlk olarak, histon şaperonların oligomerik durumunu ve stabilitesini analiz etmek için analitik boyut dışlama kromatografisi yapıldı. Daha sonra, histon şaperon-histon etkileşimlerinin itici güçlerini ve rekabetçi doğasını belirlemek için bir pull-down testi yapıldı. Bununla birlikte, bu etkileşimlerin hidrodinamik parametreleri, proteinin şekli ve kolon boyunca göçlerini etkileyen kompleksleri nedeniyle analitik boyut dışlama kromatografisi kullanılarak doğru bir şekilde hesaplanamamıştır. Bu nedenle, doğru moleküler ağırlık, etkileşimin stokiyometrisi ve biyolojik moleküllerin şeklini içeren çözelti içi makromoleküler özellikler sağlayan analitik ultrasantrifüjleme kullanılmıştır. Geçmiş çalışmalar, yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120 gibi histon şaperonları fonksiyonel olarak karakterize etmek için in vitro histon chaperoning testini yaygın olarak kullanmıştır. Histon chaperoning testi, proteinleri histon şaperonlar olarak fonksiyonel olarak karakterize etmek için de kullanılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Histon şaperonların oligomerik durumunu ve stabilitesini aydınlatmak için analitik boyut dışlama kromatografisi

  1. Histon şaperonların oligomerik durumunun analizi
    1. 24 mL'lik bir analitik boyut dışlama kromatografisi (SEC) kolonunu 1,2 sütun hacmi (CV), yani 28,8 mL gazdan arındırılmış SEC tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl ve 1 mM β-merkaptoetanol (β-ME)] ile 4 °C'de dengeleyin (bkz.
      NOT: Sütun tipi, tampon bileşimi ve tampon pH'ı, ilgili proteine göre seçilebilir. Numune enjeksiyon hacmi, 24 mL'lik bir sütun için 500 μL'yi geçmemelidir. Ayrıca, kolon basıncının 5 MPa'nın altında tutulması gerekir.
    2. Daha yüksek konsantrasyonlu bir protein stok çözeltisinden, gazdan arındırılmış SEC tamponunda 500 μL 0.5 mg / mL protein numunesi hazırlayın ve 500 μL'lik bir enjeksiyon döngüsü kullanarak önceden dengelenmiş kolona enjekte edin. Kromatografi çalışmasının, 4 ° C'de SEC tamponu ile 0.2-0.3 mL / dak izokratik akış hızında ilerlemesine izin verin.
    3. 280 nm dalga boyunda absorbansı ölçerek proteinin elüsyon profilini izleyin. Aromatik kalıntıları olmayan proteinlerle uğraşırken, absorbansı 214 nm'de ölçün.
    4. Standart kalibrasyon eğrisi21'i kullanarak kDa cinsinden yaklaşık moleküler ağırlığını hesaplamak için proteinin elüsyon hacmini kullanın.
      NOT: Kalibrasyon eğrisi, bilinen moleküler ağırlıklı proteinlerin tutma hacminin, aynı sütun kullanılarak salınan ilgili moleküler ağırlıklarının kütüğüne (log Mr) karşı çizilmesiyle hazırlanır.
  2. Histon şaperonların termal stabilitesinin analizi
    1. Gazdan arındırılmış SEC tamponunda (1.1.1'de kullanılanla aynı) hazırlanan protein örneğinin 500 μL'sini ayrı ayrı mikrosantrifüj tüplerinde alın ve her tüpü bir su banyosunda 10 dakika boyunca 20 °C ile 90 °C (20 °C, 40 °C, 60 °C ve 90 °C) arasında değişen belirli bir sıcaklığa ısıtın.
    2. Daha sonra, ısıl işlem görmüş numuneleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüj edin, süpernatantı bir mikropipetle toplayın ve 4 ° C'de SEC tamponu ile önceden dengelenmiş analitik kolona 500 μL'lik bir enjeksiyon döngüsü kullanarak her numuneyi ayrı ayrı enjekte edin.
    3. Kromatografi çalışmasının, 4 ° C'de SEC tamponu ile 0.2-0.3 mL / dak izokratik akış hızında ilerlemesine izin verin.
    4. Elüsyon zirvelerinin konumunu ve yüksekliğini gözlemleyin ve farklı numuneler için ek piklerin görünümünü arayın.
  3. Histon şaperonların kimyasal stabilitesinin analizi
    1. Histon şaperonların tuz stabilitesini incelemek için, bir Tris tamponunda [20 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 1 mM β-ME] hazırlanan 500 μL 0.5 mg / mL protein numunesini, 4 ° C'de 30 dakika boyunca ayrı mikrosantrifüj tüplerinde artan NaCl konsantrasyonları (300 mM, 600 mM, 1 M, 1.5 M ve 2 M) ile desteklenmiş olarak inkübe edin. Numuneleri 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı koruyun.
    2. Daha sonra, protein numunelerini farklı NaCl konsantrasyonlarında ayrı ayrı yükleyin, 500 μL'lik bir enjeksiyon döngüsünü kullanarak, 4 ° C'de artan NaCl konsantrasyonlarını içeren ilgili tamponun 1.2 CV'si (28.8 mL) ile önceden dengelenmiş analitik kolona yerleştirin.
    3. Kromatografi çalışmasının, 4 ° C'de ilgili tamponun 1 CV'si (24 mL) ile 0.2-0.3 mL / dak'lık izokratik akış hızında ilerlemesine izin verin.
    4. Elüsyon zirvelerinin konumunu ve yüksekliğini gözlemleyin ve farklı numuneler için ek piklerin görünümünü arayın.
    5. Benzer şekilde, üre stabilite analizi için, bir Tris tamponunda [20 mM Tris-HCl (pH 7.5) ve 1 mM β-ME] hazırlanan 500 μL 0.5 mg / mL protein numunesini, oda sıcaklığında 16 saat boyunca ayrı mikrosantrifüj tüplerinde artan üre konsantrasyonları (1 M, 2 M, 3 M, 4 M ve 5 M) ile desteklenmiş olarak inkübe edin. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı saklayın.
    6. Daha sonra, üre ile muamele edilmiş protein numunelerini, oda sıcaklığında farklı üre konsantrasyonları içeren karşılık gelen tamponun 1.2 CV'si (28.8 mL) ile önceden dengelenmiş analitik sütuna 500 μL'lik bir enjeksiyon döngüsü kullanarak ayrı ayrı yükleyin.
    7. Kromatografi çalışmasının, oda sıcaklığında ilgili tamponun 1 CV'si (24 mL) ile 0.2-0.3 mL / dak izokratik akış hızında ilerlemesine izin verin.
      DİKKAT: Üre kristalleşme ve kolona zarar verme eğiliminde olduğundan üre içeren tampon ile deneyleri daha düşük bir sıcaklıkta yapmayın.
    8. Elüsyon zirvelerinin konumunu ve yüksekliğini gözlemleyin ve farklı numuneler için ek piklerin görünümünü arayın.

2. Histon oligomerleri ve histon şaperon arasındaki karmaşık formasyona katkıda bulunan etkileşimlerin türünü anlamak için tuz gradyanı tabanlı pull-down testleri

  1. Pull-down testinin her reaksiyonu için, 40 μL Ni-NTA reçinesini bir spin kolonuna pipet edin ve steril çift damıtılmış su ile yıkayın. Daha sonra, reçineyi 100 CV (4 mL) denge tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 10 μg / mL BSA ve 1 mM β-ME] ile dengeleyin (bkz.
    NOT: Pull-down, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde de gerçekleştirilebilir.
  2. His etiketli histon şaperonun 5 μM'sini denge tamponunda 20 μM histon H2A/H2B dimer veya H3/H4 tetramer ile karıştırarak numuneyi hazırlayın. Numuneyi 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.
    NOT: H2A/H2B dimer ve H3/H4 tetramer, rekombinant insan histonları21'den hazırlanır ve oligomerlerin bütünlüğü, analitik ultrasantrifüjleme (AUC) ile tahmini moleküler kütlelere dayanarak doğrulanır. Aşağıda belirtilen tüm deneyler için aynı histon oligomerler kullanılmıştır.
  3. Numuneleri, her biri belirli bir tuz konsantrasyonu için etiketlenmiş adım 2.1'den itibaren Ni-NTA reçinesi ile ayrı önceden dengelenmiş spin kolonlarına yükleyin ve sütunları 4 ° C'de 30 dakika boyunca saklayın. Kolonları 1 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj yapın.
  4. Daha sonra, sütunları farklı tuz konsantrasyonları (yani, 300 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM ve 1 M NaCl) içeren 100 CV (4 mL) yıkama tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 500 mM, 500 mM, 800 mM, 900 mM ve 1 mM β-ME] ile yıkayın. Her sütunu belirli bir tuz konsantrasyonuna sahip bir tamponla yıkayın.
  5. Tuz yıkama adımından sonra, 100 μL elüsyon tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 300 mM imidazol ve 1 mM β-ME] kullanarak proteini farklı sütunlardan süzün.
  6. Daha sonra, salınan numuneleri %18 SDS-PAGE22'ye tabi tutun ve Coomassie Brilliant Blue R250 ile boyandıktan sonra jeli görselleştirin (bkz. Alternatif olarak, bağlı proteini Ni-NTA reçinesinden salmak yerine reçineyi doğrudan SDS-PAGE jeline yükleyebilirsiniz.
    NOT: Dengeleme, yıkama ve elüsyon tampon bileşimleri ve pH, ilgilenilen proteine bağlı olarak değiştirilebilir.

3. H2A/H2B veya H3/H4 için histon şaperon tercihini belirlemek için rekabetçi pull-down testi

  1. Döndürme sütununu adım 2.1'de açıklandığı gibi hazırlama
  2. Histon şaperonun 5 μM'sini, buz üzerinde 30 dakika boyunca 300 μL denge tamponunda (adım 2.1'de hazırlanan) 20 μM H2A/H2B dimer ile inkübe edin.
    NOT: Reaksiyondaki histon oligomerin histon şaperona oranı, bilinen bağlayıcı stokiyometri verilerine dayanarak seçilebilir; bilgi yoksa beş kat fazla histon kullanın.
  3. Herhangi bir çökeltiyi gidermek için histon şaperon-H2A / H2B kompleksini 16.200 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Daha sonra, numuneyi denge tamponu (adım 2.1'de hazırlanan) ile önceden dengelenmiş spin kolonuna yükleyin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Fazla H2A/H2B dimerini gidermek için kolonu 100 CV (4 mL) yıkama tamponu [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 50 mM imidazol, %0.2 Tween-20 ve 1 mM β-ME] ile yıkayın. Daha sonra, histon şaperon-H2A / H2B kompleksini 20-60 μM H3 / H4 tetramer ile karıştırın ve buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  5. Kolonu 100 CV (4 mL) yıkama tamponu (adım 3.4'te hazırlanmış) ile yeniden yıkayarak bağlanmamış H3/H4 tetramerini çıkarın ve numuneyi elüsyon tamponu (adım 2.5'te hazırlanmış) kullanarak süzün. Salınan numuneleri %18 SDS-PAGE'e tabi tutun ve Coomassie Brilliant Blue R250 ile boyandıktan sonra görselleştirin.
    NOT: Tahlil tersine çevrilebilir, burada ilk önce H3 / H4 tetrameri şaperon ile karıştırılabilir, kompleks Ni-NTA boncuklarına bağlanmasına izin verilir ve kompleks daha sonra değişen konsantrasyonlarda H2A / H2B dimer ile inkübe edilebilir.

4. Histon şaperonlar ve histonlar arasındaki bağlanma stokiyometrisini analiz etmek için analitik ultrasantrifüjleme - sedimantasyon hızı (AUC-SV) deneyleri

  1. AUC için numune hazırlama
    1. Yeniden yapılandırılmış histon H2A/H2B dimer, H3/H4 tetramer ve histon şaperonu ayrı ayrı 7 kDa kesilmiş diyaliz tüpü23 aracılığıyla, diyaliz tamponuna [20 mM Tris (pH 7.5), 300 mM NaCl ve 1 mM β-ME] karşı diyaliz edin (bkz. Arabellek uyuşmazlığından kaynaklanan arka plan hatasını en aza indirmek için, diyaliz tamponuna karşı, tercihen 24 saatlik bir süre boyunca üç kez diyalizi kapsamlı bir şekilde gerçekleştirin.
      NOT: Protein örneklerinin ilk OD 280'i, 0.3-0.5'lik son OD280'i elde etmek için iki ila üç kat daha yüksek bir değere sahip olmalıdır. Bu aslında seyreltmenin etkilerini geçersiz kılmak için yapılır.
    2. H2A/H2B dimer, H3/H4 tetramer ve histon şaperonu diyaliz tamponu ile ayrı ayrı saflaştırın, analitik boyut dışlama kromatografisini kullanarak (1. adımda belirtildiği gibi). Daha sonra daha fazla seyreltme hazırlamak ve AUC hücresinde referans olarak kullanmak için arabelleği çalıştırmadan kaydedin.
  2. AUC için örnek yükleme
    1. Saflaştırılmış proteinleri, 0.3-0.6'lık bir OD280'e ulaşmak için adım 4.1.1'den diyaliz tamponunu kullanarak 450 μL'lik son bir hacimde karıştırın. Ayrı reaksiyon tüplerinde kompleks oluşum için histon şaperonu H2A/H2B dimer veya H3/H4 tetramer ile karıştırın. Protein karışımlarını 2-3 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Alternatif olarak, çökeltme verileri analitik ultrasantrifüjdeki parazitli optik tarama sistemi ile elde edilebilir. Ayrı olarak, saflaştırılmış proteinleri karıştırmak için, histon şaperon konsantrasyonunu sabitleyin ve tam stokiyometriyi elde etmek için histon oligomerlerinin artan konsantrasyonlarıyla inkübe edin.
    2. AUC-SV deneyi için hücreyi, daha önce ayrıntılı olarak açıklandığı gibi analitik ultrasantrifüjün bir absorbans dedektörünü kullanarak çift sektörlü bir merkez parçası ve kuvars pencerelerle birleştirin24.
    3. 400 μL numune çözeltisini ve 420 μL diyaliz tamponunu hücrenin iki sektörüne (sırasıyla numune ve referans sektörleri) doldurun.
      NOT: Referans menisküsünü numunenin menisküsünün üzerinde tutmak için referans sektöründe daha büyük hacimli tampon kullanılır. Bununla birlikte, bir optik girişim sistemi kullanırken, iki sektörü eşit hacimle doldurun.
    4. Hücreleri tartın ve doğru bir şekilde dengeleyin ve dört yerli titanyum rotora yükleyin ( bkz. Hücrelerin ve rotorun altında verilen işaretleri kullanarak hücreleri hizalayın. Rotoru santrifüje yükleyin, kapağı kapatın ve basınç 15 mikrondan daha az Hg'ye düşene ve rotor sıcaklığı 20 ° C'ye sabitlenene kadar (genellikle 2-2,5 saat sürer) bir vakum gelişmesine izin verin.
      NOT: AUC çalışma parametreleri deneysel sıcaklığı, rotor hızını, taramalar arasındaki aralığı ve toplanacak tarama sayısını içerir. SV deneylerinde, tarama aralığı proteinin moleküler kütlesine göre verilir; daha küçük proteinler, taramalar arasında daha büyük zaman aralıkları gerektirir. Rotor hızı da proteinin beklenen moleküler kütlesine göre ayarlanır ve deney 20 ° C'de gerçekleştirilir. Absorbans verileri 280 nm'de izlenir.
    5. Tam stokiyometriyi elde etmek için, histon şaperon konsantrasyonunu sabit tutun ve doygunluğa ulaşmak için artan histon oligomer konsantrasyonları ile inkübe edin.
  3. AUC veri analizi
    1. Veri analizini daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirin25. Kısaca, SEDNTERP26 programını kullanarak tampon bileşenlerinin yoğunluğunu ve viskozitesini hesaplayın (bkz. Benzer şekilde, SEDNTERP kullanarak amino asit bileşimine dayanarak proteinin kısmi spesifik hacmini hesaplayın.
    2. AUC makinesindeki verileri SEDFIT27 programına yükleyin ve menisküs (kırmızı çizgi), hücre alt kısmı (mavi çizgi) ve veri analizi sınırlarını (yeşil çizgiler) tanımlayın. Model olarak sürekli C(s) dağılımını seçin.
    3. Ardından, çözünürlüğü maksimum 100'e kadar ayarlayın; set çökeltme katsayısı (lar), s min: 0 ve s max: 10-15; sürtünme oranını başlangıçta 1,2 olarak ayarlayın ve oranın verilerden türetilmesi için yüzmeyi tercih edin; 1 sigma düzenlileştirme için güven seviyesini (F-oranı; düzenlileştirmenin büyüklüğünü belirleyen) 0,68'e ayarlayın; SEDNTERP'den elde edilen kısmi spesifik hacim, tampon yoğunluğu ve tampon viskozite değerlerini ayarlayın.
    4. Yazılımın Lamm denklemi27'yi çözmesine izin vermek için RUN tuşuna basın. Önemli bir veri uyuşmazlığı varsa parametreleri ayarlayın. Parametreleri ayarladıktan sonra, tüm parametreleri hassaslaştırmak için FIT tuşuna basın. Uyum kalitesini, 0,01 sinyal biriminden az olması gereken kök-ortalama-kare sapma (RMSD) değerine göre değerlendirin.
    5. Seçeneği seçerek zirvelerin moleküler kütlelerini tahmin edin: molekülün / kompleksin 's'si hakkında bilgi sağlayacak olan ana araç çubuğunun görüntüleme işlevinde "Mw in c(s)" tepe noktasını gösterin.

5. Histon chaperoning fonksiyonunu doğrulamak için plazmid süper sarma testi

  1. Nükleozom montaj reaksiyonu
    1. Bir montaj tamponunda 2 μM H3/H4 tetramer ve 4 μM H2A/H2B dimerini artan konsantrasyonlarla karıştırın [20 mM Tris HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 0.1 mg/mL BSA ve 100 mM NaCl] 50 μL'lik son hacme kadar karışımı 4 °C'de 30 dk.
    2. Aynı zamanda, ayrı bir reaksiyonda, negatif süper sarmal pUC19 plazmidinin 500 ng'sini, montaj tamponunda 50 μL'lik son bir hacimde 1 μg topoizomeraz I enzimi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile ön işlemden geçirin ve 30 dakika boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Topoizomeraz I, tek sarmallı bir çentik üreterek süper sarmal çift sarmallı plazmid DNA'sını gevşetir. Ticari olarak temin edilebilen buğday tohumu topoizomeraz I veya rekombinant olarak eksprese edilen Drosophila melanogaster topoizomeraz I gibi ökaryotik kökenli bir topoizomeraz I enzimi kullanılabilir.
    3. Daha sonra, H3 / H4 tetramer, H2A / H2B dimer, histon şaperon karışımı (adım 5.1.1'den itibaren), gevşemiş plazmid DNA reaksiyon karışımını (adım 5.1.2'den itibaren) birleştirin ve 90 dakika boyunca 30 ° C'de daha fazla inkübe edin.
      NOT: Tahlil için iki kontrol reaksiyonu ayarlayın; biri histon şaperon ve gevşemiş plazmid DNA'sına (ancak histonlara değil), diğeri histon oligomerlerine ve gevşemiş plazmid DNA'sına (ancak histon şaperona değil) sahiptir.
    4. 100 μL 2x durdurma tamponu (40 mM EDTA, %2 SDS ve 0,4 mg/mL proteinaz K) ekleyerek montaj reaksiyonunu durdurun ve 30 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: Stop buffer, bağlı histonların denatürasyonu ve proteolizi ile plazmid DNA'sını deproteinize eder.
  2. Fenol-kloroform ekstraksiyonu ve etanol çökeltmesi
    1. Adım 5.1.4'ten itibaren reaksiyon karışımını içeren tüpe eşit miktarda Tris doymuş fenol ekleyin ve iyice karıştırın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüjleme yapın.
    2. Plazmid DNA'sına sahip üst sulu fazı bir mikropipetle nazikçe toplayın ve eşit miktarda kloroform ile karıştırın. Karışımı vorteks edin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 16.200 x g'de santrifüj yapın.
      NOT: İzoamil alkol, sulu ve organik fazlar arasında bulanık bir arayüzden kaçınmak için bu adıma dahil edilebilir.
    3. Daha sonra, üst sulu fazı toplayın, 1/10 hacim 3 M sodyum asetat (pH 5.5) ve 2.5 hacim buz gibi soğuk etanol ekleyin (bkz. Tüpü 3-4 kez ters çevirerek çözeltiyi iyice karıştırın ve plazmid DNA'sının tamamen çökelmesi için karışımı -20 ° C'lik bir dondurucuda 30 dakika boyunca saklayın.
    4. Numuneyi 16200 x g'de 5.2.3 adımından 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı yavaşça atın. Tüpleri, eser miktarda etanol buharlaşana kadar oda sıcaklığında açık tutun ve çökelmiş plazmid DNA'sını tüpte bırakın.
  3. Plazmid süper sarmal etkisini gözlemlemek için agaroz jeli elektroforezini gerçekleştirin.
    1. Çökeltilmiş plazmid DNA'sını 5.2.4 adımından steril çift damıtılmış suda çözün.
    2. Numuneleri 1x Tris-asetat-EDTA (TAE) tamponunda (40 mM Tris, 20 mM asetik asit ve 1 mM EDTA) %1'lik bir agaroz jeli üzerinde çözün (bkz.
    3. Jeli 0.2-0.5 μg / mL ethidyum bromür konsantrasyonu ile lekeleyin ve jel üzerindeki DNA bantlarını görselleştirmek için UV altında gözlemleyin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arabidopsis thaliana'dan FKBP53 proteininin rekombinant N-terminal nükleoplazmin alanı analitik SEC'e tabi tutuldu. Elüsyon tepe hacmi, oligomerik durumunu tanımlamak için standart eğriye karşı çizildi. Analitik SEC sonuçları, alanın çözelti içinde yaklaşık 58 kDa'lık bir moleküler kütleye sahip bir pentamer olarak var olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 1A, B). Ayrıca, nükleoplazmin alanı, analitik SEC ile birlikte termal ve kimyasal stabilite için analiz edildi. 90 °...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, varsayılan bir histon şaperonun biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonu için kapsamlı bir protokol setini göstermekte ve doğrulamaktadır. Burada, protokolleri göstermek için rekombinant olarak eksprese edilen ve saflaştırılan NAP ailesi proteinleri, AtNRP1 ve AtNRP2 ve AtFKBP53'ün N-terminal nükleoplazman alanı kullanılmıştır. Aynı deney seti, herhangi bir organizmadan daha önce karakterize edilmemiş histon şaperonların fonksiyonel özelliklerini tanımlamak için çok iyi kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhangi bir çıkar çatışması ilan edilmedi.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Hindistan Hükümeti [CRG / 2018 / 000695 / PS] ve Biyoteknoloji Bölümü, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Hindistan Hükümeti [BT / INF / 22 / SP33046 / 2019] 'dan Dileep Vasudevan'a yapılan ekstramural hibelerin yanı sıra Yaşam Bilimleri Enstitüsü, Bhubaneswar'ın intramural desteği büyük ölçüde kabul edilmektedir. Bayan Sudeshna Sen ve Bayan Annapurna Sahoo'ya histon hazırlama konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Meslektaşlarımız Dr. Chinmayee Mohapatra, Bay Manas Kumar Jagdev ve Dr. Shaikh Nausad Hossain ile yapılan görüşmeler de kabul edilmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Asetik asit (buzul)SigmaA6283
AkrilamidMP Biyomedikaller814326
AgaroseMP Biyomedikaller193983
AKTA Saf 25M FPLCCytiva29018226Protein saflaştırma cihazı
Amonyum persülfat (APS)SigmaA3678
An-60Ti rotorAnalitikultrasantrifüjleme için361964
Sığır serum albümini (BSA)SigmaA7030
KloroformSigmaC2432
Coomassie parlak mavi R 250Sigma1.15444
Diyaliz tüpü (7 kDa kesme)Thermo Fisher68700Protein örneklerini diyaliz etmek için
Dithiothreitol ( DTT)MP Biyomedikal100597
DNA Yükleme BoyasıNew England BiolabsB7025S
EDTA disodyum tuzuMP Biyomedikal194822
Elektronik teraziShimadzuATX224R
EtanolSigmaE7023
Etidyum bromür (EtBr)SigmaE8751
Jel Doc SistemBio-Rad12009077Boyama sonrası jelleri görüntülemek için
Yatay jel elektroforez aparatıBio-Rad1704405Agaroz jel elektroforezi için alet
Hidroklorik asit (HCl)Sigma320331
İmidazolMP Biyomedikaller102033
Magnezyum klorür (MgCl2)SigmaM8266
Mikro pipetlerEppendorfZ683779Mikro hacimlerin pipetlenmesi için
Mini-PROTEAN elektroforez sistemiBio-Rad1658000SDS-PAGE
N,N-metilen-bis-akrilamidMP
damlaThermo FisherND-2000Protein ve DNA konsantrasyonlarının
Ni-NTA agarozInvitrogenR901-15Aşağı çekme tahlili için reçine boncukları
Optima AUC analitik ultrasantrifüjBeckman CoulterB86437Analitik ultrasantrifüjleme cihazı
pH MetreMettler ToledoMT30130863
FenolSigmaP4557
Plazmid izolasyon kitiQiagen27104
Proteinaz KSigma-Aldrich1.07393
pUC19Thermo FisherSD0061Süper sarma deneyi için Plazmid
Soğutmalı yüksek hızlı santrifüjThermo Fisher75002402
SDS-PAGE protein işaretleyiciBio-Rad1610317
SEDFITAnalitik ultrasantrifüj verileri için ücretsiz yazılım programı analiz
SEDNTERPTamponun viskozitesini ve yoğunluğunu ve bir proteinin kısmi spesifik hacmini tahmin etmek için ücretsiz yazılım programı
SigmaPrep Spin SütunlarıSigmaSC1000Aşağı çekme tahlili için
Sodyum asetatSigmaS2889
Sodyum klorür (NaCl)MerckS9888
Sodyum dodesil sülfat (SDS)MP Biyomedikal102918
Superdex 200 10/300 GLCytiva28990944Analitik boyut dışlama kromatografisi için sütun
Superdex 75 Artış 10/300 GLCytiva29148721Analitik boyut dışlama kromatografisi için sütun
TEMEDSigma1.10732
Topoizomeraz IInspiralisWGT102Enziminde kullanılır plazmid süper sarma deneyi
Tris bazMerckT1503
Tween-20SigmaP1379
ÜreMP Biyomedikal191450
Su banyosuNü veNB 5Protein örneklerinin ısıl işlemi için
beta;-merkaptoetanol (β-ME)SigmaM6250
Beckman Coulter Rotor için cihaz Nano damla Thermo Fisher ND-2000 800172 Nanoölçümü için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D'Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111(2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530(2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625(2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 20, Unit20.12 (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258(2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809(2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487(2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608(2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone ChaperonesChromatin AssemblyPull Down AssayAnalytical UltracentrifugationSize Exclusion ChromatographyPlasmid Super CoilingNucleosome AssemblyH2A H2B DimerH3 H4 TetramerProtein DNA Interaction

Related Articles