Yöntem makalesi

ACT1-CUP1 Testleri, Tomurcuklanan Mayadaki Splisozomal Mutantların Substrata Özgü Hassasiyetlerini Belirler

DOI:

10.3791/63232

⸱

30 Haziran 2022

1College of Arts and Sciences, Northwest University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir bakır büyüme testi olan ACT1-CUP1 testi, öncü mesajcı RNA (pre-mRNA) eklemesinin ve mutant ekleme faktörlerinin spleozomal fonksiyon üzerindeki etkisinin hızlı bir şekilde okunmasını sağlar. Bu çalışma bir protokol sağlar ve ilgilenilen ekleme sorusunu ele almak için mümkün olan özelleştirmeyi vurgular.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Splisozomda veya substratında ortaya çıkan mutasyonlar, splisozomal fonksiyonun inceliklerini anlamamıza önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Hastalıkla ilişkili veya fonksiyonel olarak seçilmiş olsun, bu mutasyonların çoğu, model organizma Saccharomyces cerevisiae'de (maya) büyüme tahlilleri kullanılarak incelenmiştir. Eklemeye özgü bakır büyüme testi veya ACT1-CUP1 testi, fenotipik düzeyde mutasyonun kapsamlı bir analizini sağlar. ACT1-CUP1 testi, doğru şekilde eklendiğinde bakır toleransı sağlayan muhabirleri kullanır. Bu nedenle, bakır varlığında, maya canlılığındaki değişiklikler, ekleme yoluyla mRNA üretimindeki değişikliklerle ilişkilidir. Tipik bir deneyde, maya ekleme uzmanına, farklı konsensüs dışı ekleme muhabirleri ve ekleme üzerindeki herhangi bir sinerjik veya antitetik etkiyi tespit etmek için ilgi çekici ekleme faktörü mutasyonu ile meydan okunur. Burada bakır levha hazırlama, maya hücrelerinin kaplanması ve veri değerlendirmesinin tam bir açıklaması verilmiştir. ACT1-CUP1 muhabirlerinin çok yönlülüğünü vurgulayan bir dizi ücretsiz deney anlatılmıştır. ACT1-CUP1 testi, mutasyonel etkilerin doğrudan okunması ve sahada devam eden kullanımdan elde edilen karşılaştırmalı olasılıklar sayesinde ekleme araç kutusunda kullanışlı bir araçtır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Splisozom, öncü mesajcı RNA'da (pre-mRNA) intronların, kodlamayan bölgelerin uzaklaştırılmasını katalize eden büyük, biyolojik bir makinedir1,2. Yaklaşık 100 proteinin 1'inde ve 5 kodlamayan RNA'da tek bir nokta mutantının etkisini karakterize etmek, protein veya RNA'yı izole ederken genellikle belirsizdir. Mutasyona uğramış bileşenin işlevindeki değişiklik, tam, işleyen spliceozom bağlamında in vivo olarak en iyi şekilde değerlendirilebilir.

Burada açıklanan bakır büyüme testi, Saccharomyces cerevisiae veya tomurcuklanan mayadaki ekleme verimliliğinin hızlı bir göstergesidir. C.F. Lesser ve C. Guthrie tarafından geliştirilen ve 1993 yılında yayınlanan bu tahlil, basit bir model organizma ile çalışma kolaylığını ve hücre canlılığının doğrudan okunmasınıbirleştirir 3. Canlılık, bu hücrelerdeki splisozomların muhabir transkriptini ne kadar iyi tanıyabileceği ve ekleyebileceği ile ilişkilidir.

Bu bakır büyüme testine daha yaygın olarak ACT1-CUP1 testi denir. ACT1-CUP1 adı, ekleme verimliliğinin bir raporlayıcısını oluşturmak için kaynaşmış iki genden kaynaklanmaktadır. ACT1, mayanın aktin genidir, bu da yüksek oranda eksprese edilir ve verimli bir şekilde eklenmiş bir intron 4,5'e sahiptir. Cup1p, düzenli hücresel fonksiyonlara müdahale edilmesini önlemek için hücredeki bakırı tutan bir bakır şelatördür 6,7,8. ACT1-CUP1 muhabiri bu genleri sırayla içerir, öyle ki CUP1 sadece ACT1'in intronunun mRNA öncesi eklenmesi durumunda uygun okuma çerçevesinde olur (Şekil 1). Elde edilen füzyon proteini, aktinin ilk 21 amino asidini ve bakır bakımından zengin bir ortamda maya canlılığını artıran tam uzunlukta Cup1p proteinini içerir3. Bu nedenle, muhabirin ekleme miktarındaki bir artış, daha yüksek bir Cup1p konsantrasyonu ve daha yüksek bir bakır direnci ile sonuçlanır (Şekil 1). Diğer muhabir genlerle karşılaştırıldığında, CUP1 düşük seviyelerde bile hücre canlılığını etkiler, geniş bir duyarlılık aralığına sahiptir ve 3,6,7 mutasyonlarını eklemek için doğrudan seçmek için kullanılabilir. Ek olarak, CUP1 standart maya büyümesi için gerekli değildir ve bu nedenle hücresel homeostaz bu tahlilin kurulumu sırasında etkilenmez. Delesyon veya sıcaklık büyüme testlerini tamamlayan ACT1-CUP1, aksi takdirde optimal maya büyüme koşulları altında ekleme üzerindeki etkileri hakkında bilgi sağlar.

Eklem, substratını üç intronic dizi aracılığıyla tanır: 5' ekleme bölgesi (5' SS), dal-site (BS) ve 3' ekleme bölgesi (3' SS). Bu sitelerde fikir birliği olmayan diziler içeren çok sayıda ACT1-CUP1 muhabiri oluşturulmuştur. En yaygın ACT1-CUP1 muhabirlerinin bir seçkisi Şekil 1 ve Tablo 1'de gösterilmiştir. Ekleme döngüsünün farklı noktalarında her bir ekleme bölgesi ile benzersiz bir şekilde etkileşime girdiğinden, spliceosome'un sağlamlığı, konsensüs dışı raporlayıcının kullanıldığı farklı adımlarda test edilebilir. Konsensüs dışı muhabirler, intron içindeki mutasyona uğramış pozisyon ve mutasyona uğradığı taban için adlandırılır. Örneğin, A3c, 5' SS'de bir mutasyona sahip bir muhabirdir, özellikle konsensüs adenozinden bir sitozine kadar 3. konumdadır. Bu muhabir, 5' SS seçimini ve kullanımını etkileyen splisozom mutasyonları ile güçlü bir şekilde etkileşime girecektir. İlk çalışmalarında, Lesser ve Guthrie, hangi 5' SS mutasyonlarının ekleme3'ü inhibe ettiğini belirledi. Aynı yılın ilerleyen zamanlarında, her üç ekleme bölgesinde de fikir birliği olmayan muhabirler, Burgess ve Guthrie tarafından ATPase Prp16p9'daki mutasyonların baskılayıcı bir ekranında yayınlandı. Konsensüsü fikir birliği olmayan muhabirlerle karşılaştıran ACT1-CUP1 testi, maya ekleyicisinin sağlamlığını ve seçiciliğini anlamak ve diğer ökaryotların ek parçalarının işlevini çıkarmak için önemli bir anahtar olmuştur.

Konsensüs dışı ACT1-CUP1 muhabirleri splisozomu daha fazla bozulmaya duyarlı hale getirdikçe, tek bir ekleme faktörü mutasyonunun etkisi, olumlu veya olumsuz etkilediği muhabirler aracılığıyla karakterize edilebilir. Bu, araştırma sorularını çeşitli şekillerde eklemeye uygulanmıştır. İlk olarak, ACT1-CUP1 testi, ekleme faktörlerindeki mutasyonlar için genetik bir tarama olarak kullanılabilir ve kullanılmıştır. Örneğin, en büyük ekleme proteini olan Prp8p, splisozomun RNA çekirdeğinin ekleme reaksiyonunu katalize ettiği bir platform görevi görür. Bu, kısmen, Prp8p mutantlarının farklı ACT1-CUP1 muhabirlerinin 10,11,12,13,14,15,16,17 eklenmesini nasıl geliştirdiği veya azalttığı ile çıkarıldı. Eklemlemenin diğer protein bileşenleri de Hsh155p, Cwc2p, Cef1p ve Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25 dahil olmak üzere ACT1-CUP1 kullanılarak araştırılmıştır. Prp16p ve spliceosomal geçişte yer alan diğer dört ATPazın enerjik eşikleri de bu tahlil 9,26,27,28,29,30 ile incelenmiştir. Küçük nükleer RNA'lar (snRNA'lar), koordine ettikleri pre-mRNA dizilerini ve snRNA'ların 3,31,32,33,34,35,36,37 ekleme sırasında maruz kaldıkları ikincil yapıdaki değişiklikleri tanımlamak için ACT1-CUP1 kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir.

ACT1-CUP1 testi, CUP1 geninin tüm kopyalarının nakavt edildiği bir maya suşu gerektirir. CUP1, 6,38 kopya numarasına sahip olabileceğinden, tam bir nakavt suşunun hazırlanması birden fazla tur veya kapsamlı tarama gerektirebilir. Sonuç olarak, cup1Δ maya suşları, muhabirler gibi laboratuvarlar arasında sıklıkla paylaşılmıştır.

Bir ekleme faktöründeki mutasyon (lar) bir plazmid kopyasından değerlendiriliyorsa, bu faktör için vahşi tip gen nakavt edilmelidir. Ek olarak, maya arka planı, biri ACT1-CUP1 muhabiri içeren, tarihsel olarak bir lösin besin seçimi plazmidi üzerinde ve diğeri çalışılacak ekleme makinesinde bir mutasyon veya pertürbasyon içeren en az iki plazmidin seçilmesine izin vermelidir (Şekil 2). Genellikle, tek bir tahlilde, her biri sorgu ekleme pertürbasyonunu (QSP) ve farklı bir raporlayıcıyı taşıyan birden çok maya türü, sorgunun ekleme üzerindeki etkisini test eder.

ACT1-CUP1 tahlilindeki bağımsız değişkenler, bir araştırmacının QSP'nin ciddiyetini değerlendirmesine izin verir. Bu bağımsız değişkenler, bakır konsantrasyonu ve birden fazla konsensüs dışı ekleme muhabirinin seçimidir. İlk olarak, maya suşları bir dizi bakır konsantrasyonu içeren plakalar üzerinde yetiştirildiğinden (Şekil 2), tahlilin kurulması, kullanılan konsantrasyonların gradyanının seçilmesini içerir. Çalışmalar, canlılığın ilk okumasını elde etmek için bir kurs bakır konsantrasyon gradyanı kullanabilir ve daha sonra ince canlılık farklılıklarını tanımlamak için tahlili daha ince bir gradanla tekrarlayabilir. İkinci değişken, test edilmesi mümkün olan çok çeşitli ACT1-CUP1 muhabirleridir (Şekil 1 ve Tablo 1). QSP, yabani tipe karşı fikir birliği olmayan bir muhabirin varlığında maya canlılığını farklı şekilde etkilerse, QSP'nin, intron'un bu bölgesinin tanınması veya işlenmesi sırasında önemli olan eklemedeki bir adımı veya spliceosome'un bir bölgesini etkilediği sonucuna varılabilir.

Maya alet kutusu kapsamlıdır ve ACT1-CUP1 testi, ekleme araştırmasının ayrılmaz bir parçasıdır. ACT1-CUP1 testi genellikle bir QSP'nin etkisi üzerinde daha derinlemesine genetik, yapısal ve / veya biyokimyasal bir analizle birlikte gerçekleştirilir. Bu daha ayrıntılı çalışmalar genellikle daha uzun bir prosedüre ve / veya daha yüksek fiyat etiketine sahip olduğundan, sık bir yaklaşım ilk önce ACT1-CUP1 ile ilginç mutantları taramaktır.

Burada bakır levha hazırlığı da dahil olmak üzere bir ACT1-CUP1 tahlil protokolü verilmiştir. Bu tahlil, araştırmacılara QSP'nin ekleme üzerindeki etkisine ve hangi intronic bölgelerinin pertürbasyondan en çok etkilendiğine dair ilk cevabı verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Maya suşu yapımı

  1. Arka planı leu2 ve cup1Δ içeren bir S. cerevisiae suşu oluşturun veya elde edin. Bu arka planı oluşturmak için, lityum asetat ve tek sarmallı DNA39 kullanan köklü maya yöntemini kullanın.
    NOT: Haploid maya suşları CUP1 6,38'in bir, iki veya daha fazla kopyasını içerebilir. CUP1 gen konumlarını kuşatmak için nakavt primerler tasarlarken seçilen maya suşu için genomik bilgilere bakın.
  2. QSP'yi genomik birleştirme yoluyla veya bir plazmid üzerinde birleştirmek için bir maya dönüşümü gerçekleştirin. Önceki araştırmalarda açıklananlar gibi köklü bir protokol kullanın40,41,42.
  3. Adım 1.2'den itibaren ortaya çıkan suş(lar) ile bir maya dönüşümü gerçekleştirin. İstenilen ACT1-CUP1 muhabir plazmidini eklemek için.
    NOT: Bu dönüşümü takiben ACT1-CUP1 muhabir plazmidlerinin tutulmasını sağlamak için hücreler lösin bırakma (-Leu) plakaları ve ortam üzerinde tutulmalıdır.
  4. 1.2 adımlarını gerçekleştirin. ve 1.3. kontrol suşları da dahil olmak üzere test edilecek her QSP ve her ACT1-CUP1 muhabir plazmidi için.

2. Bakır levha hazırlama

  1. Test edilecek muhabirlere uygun bir bakır konsantrasyon aralığı seçin (sık kullanılan muhabirlerin öldürücülüğü için Tablo 1'e bakınız).
    NOT: Kapsamlı bir bakır konsantrasyon aralığına örnek olarak 0 mM, 0,025 mM, 0,05 mM, 0,075 mM, 0,1 mM, 0,15 mM, 0,2 mM, 0,25 mM, 0,3 mM, 0,35 mM, 0,4 mM, 0,45 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM, 0,9 mM, 1,0 mM, 1,1 mM, 1,2 mM, 1,3 mM, 1,4 mM, 1,5 mM, 1,6 mM, 1,7 mM, 1,8 mM, 1,9 mM, 2,0 mM, 2,25 mM ve 2,5 mM Cu2+.
  2. 0,22 μm PES (polietersülfon) steril filtreden 1 M CuSO4 ve steril filtreden oluşan bir stok çözeltisi yapın.
  3. İstenilen bakır plaka başına, CuSO4 stoğunun steril suda 2 mL'lik bir seyreltilmesini hazırlayın.
    NOT: 0 mM Cu 2+ plaka her zaman referans olarak analiz edileceğinden ve görüntüleneceğinden, biri kaplama adımının başında diğeri sonunda olmak üzere iki adet 0 mM Cu2+ plaka yapılması önerilir (adım 3.4.).
    1. Plaka hacminin 40 mL'sinde istenen son bakır konsantrasyonu için stok miktarını hesaplayın (Ek Tablo 1).
    2. Hesaplanan miktarda steril su ve 1 M CuSO4 stoğunu steril, 2 mL'lik bir tüpe ekleyin.
  4. ACT1-CUP1 testi için plakaları dökün.
    NOT: Aşağıdaki protokole bir alternatif, her plaka için farklı bakır konsantrasyonları elde etmek için başlangıçta medyayı ve agar'ı büyük bir kapta ve daha küçük kaplara otoklavlamadan sonra aliquot'ta birleştirmektir. Hangi yöntem alınırsa alınsın, her biri farklı bir bakır konsantrasyonuna sahip olmasına rağmen, ortam konsantrasyonunun tüm plakalar arasında tutarlı olmasını sağlamak önemlidir.
    1. Dökülecek her boş plakayı, içereceği son bakır konsantrasyonu ile etiketleyin. Test edilecek bakır konsantrasyonu başına en az bir kare plaka hazırlayın.
    2. Test edilecek bakır konsantrasyonu başına 100 mL'lik bir şişeyi etiketleyin.
    3. Her şişeye 790 mg agar (% 2 w / v agar) ve bir karıştırma çubuğu ekleyin.
    4. Büyük bir beherde, dökülecek tüm bakır plakalar için -Leu büyüme ortamını birleştirin. Yapılacak plaka başına, 265 mg maya azot bazını (YNB) ve 64 mg damlama karışımı eksi lösin (ve QSP plazmidini hücrelerde tutmak için gerekli olabilecek diğer besin maddelerini) 34 mL deiyonize suda çözün.
    5. Hazırlanan her 100 mL şişeye 34 mL -Leu büyüme ortamı çözeltisi ekleyin ve alüminyum folyo ile kapağa ekleyin. Folyoyu amaçlanan bakır konsantrasyonu ile etiketleyin.
    6. Otoklav için önerilen sıvı döngüsünü kullanarak agar'ı sterilize etmek ve çözmek için otoklav.
    7. Mümkün olan en kısa sürede, her şişeye 4 mL% 20 w / v glikoz (steril filtrelenmiş) ekleyin.
    8. Etiketleri eşleştirin ve CuSO4'ün 2 mL seyreltilerini amaçlanan şişeye ekleyin.
      NOT: Her biri farklı bir konsantrasyona sahip onlarca bakır plaka aynı anda yapılabildiğinden, tüm şişeleri, tüpleri ve plakaları amaçlanan bakır konsantrasyonuyla açıkça etiketlemek, plaka dökme sırasında karışıklığı önleyecektir.
    9. ~ 30 sn karıştırmak için bir karıştırma plakası kullanın ve kabarcıkları önleyerek etiketli plakaya 35 mL dökün veya pipetleyin. Saklamadan veya kullanmadan önce soğumaya bırakın.
      NOT: Sıklıkla, plakalar tahlilden 1 gün veya 2 gün önce yapılır ve kullanımdan birkaç saat öncesine kadar 4 ° C'de saklanır. Kaplama başlamadan önce plakalar oda sıcaklığında (RT) olmalıdır (adım 3.4.).

3. ACT1-CUP1 testi

  1. İstenilen suşları -Leu plakaları üzerinde çizin.
    NOT: Kriyografya stoklarından çalışıyorsanız, kaplamadan önce hücrelerin depolamadan yeterince canlandırılmasını sağlamak için özen gösterilmelidir. Bunun için önerilen bir prosedür, kriyojenik stoktan çizgi çizmek ve 30 ° C'de 3-5 gün boyunca büyümesine izin vermektir. Ardından, küçük bir renk örneğini dinlendirin ve 30 ° C'de 2-3 gün daha büyümesine izin verin.
  2. 10 mL medyada bir gecede kültürler yetiştirin.
    1. Adım 2.4.2'de açıklananlarla aynı oranları kullanarak -Leu büyüme ortamını hazırlayın. 10 mL ortam başına, 9 mL deiyonize suya 66 mg maya azot baz (YNB) ve 16 mg damlama karışımı eksi lösin ekleyin. 0,22 μm PES steril filtreden geçirin.
    2. Maya suşu başına, steril 50 mL konik tüpe 9 mL -Leu büyüme ortamı ve 1 mL w / v glikoz (steril filtrelenmiş) % 20 ekleyin.
    3. Steril bir çubuk veya pipet ucu kullanarak, küçük (~ 1 mm yuvarlak) bir maya örneği toplayın ve ortamı aşılayın.
    4. Tüm gece kültürlerini 180 rpm ve 30 ° C'de çalkalayın.
      NOT: Varsa, çalkalayıcı yerine rotatörler kullanılabilir.
  3. Suşları% 10 gliserol içinde OD600 0.5 ± 0.05'e seyreltin.
    1. Suş başına, 900 μL su içeren bir küvete 100 μL kültür ekleyin.
    2. OD600'ü bir spektrofotometre ile ölçün.
    3. 2 mL'lik son hacimdeOD 600 / 0,5'te olması gereken seyreltmeyi hesaplayın.
    4. Her suşu %10 gliserol (steril) içinde OD600 0.5'e kadar seyreltin.
    5. Hücre yoğunluğunun istenen0,5 ± 0,05 aralığında olduğunu doğrulamak için OD 600'ü yeniden ölçün.
  4. Bakır plakalar üzerindeki suşları plakalayın.
    NOT: Suşları plakalamak için 5-10 μL hacimlerde elle pipetleme, tekrarlama veya çok kanallı pipetleyici kullanma veya pim çoğaltıcıyla damgalama gibi çeşitli yöntemler kullanılabilir. Bu son yöntem aşağıda açıklanmıştır, ancak çoğu adım yöntemden bağımsız olarak benzer olacaktır.
    1. Steril bir çalışma yeri ve yanan bir Bunsen brülörü ayarlayın.
    2. 48 pimli bir çoğaltıcı için, seyreltilmiş her bir gerinimin 200 μL'sini 96 delikli bir plakanın ayrı bir kuyucuğuna pipetleyin. 6 x 8 ızgaradaki boş alanları 200 μL% 10 gliserol (steril) ile doldurun.
      NOT: Dokuz maya suşu için bir kaplama şeması örneği Ek Tablo 2'dedir.
    3. Sterilize etmek için çoğaltıcıyı% 95 (v / v) etanol ve alevden oluşan sığ bir kaba batırın. Isı hücreleri şok etmesini önlemek için alev söndükten sonra en az 2 dakika soğumaya bırakın.
    4. Brülörün yanına dört plaka yerleştirin ve kapakları çıkarın.
    5. Çoğaltıcıyı 96 delikli plakaya batırın ve tek bir hızlı hareketle yukarı kaldırın.
    6. Yavaşça plakaya yerleştirin ve iyi bir aktarımı kolaylaştırmak için hafifçe ileri geri sallayın.
    7. Tek bir hızlı hareketle yukarı kaldırın ve 96 delikli plakaya tam olarak aynı yönde yerleştirin.
    8. En fazla üç plaka için tekrarlayın. Çoğaltıcıyı etanol içine batırma, sterilize etmek için alevlendirme ve her dört plakada bir soğumayı bekleme işlemini tekrarlayın.
    9. Bir plaka kaplandıktan sonra, yana doğru yumuşak bir hareketle hareket edin, ancak yine de alevin sterilizasyon şemsiyesi içinde hareket edin.
      NOT: Maya seyreltmelerinin ve kaplamanın bir alevin yakınında yapılması önerilir. Plakalar kururken kolayca kirlenebilir.
    10. Kapakları yerleştirmeden önce plakaları tamamen kurumaya bırakın, genellikle 3-5 dakika.
    11. Plakaları 30 ° C'de 3 gün boyunca inkübe edin.

4. Veri toplama ve analizi

  1. Plakaları inkübatörden çıkarın ve görsel olarak inceleyin.
  2. Plakaların görüntülerini mevcut bir kamera veya başka bir dijital görüntüleme sistemi ile kaydedin.
  3. Her bir suş için rekor (veya skor) son bakır konsantrasyonu gözle görülür büyüme gözlenir.
    NOT: Hücreler bu konsantrasyona kadar eklenebilir ve canlı kalabilir. Tutarlılık için, en son uygulanabilir bakır konsantrasyonunu puanlamak için her zaman gözle veya plaka görüntülerinden aynı yöntemi kullanın. Çok küçük koloniler bazen gözle görülebilir, ancak görüntüde görünmez. Doğrudan görsel inceleme veya görüntülerden kayıt arasındaki fark küçüktür, genellikle gradyanda bir adımdır. Kolonilerin görüntüleri yayınlarda sıklıkla kullanıldığından, görüntülerin puanlanması önerilir.
  4. QSP'nin eklemeyi nasıl etkilediği hakkında sonuçlar çıkarmak için aynı suş için birden fazla ACT1-CUP1 tahlilinden elde edilen verileri birleştirin.
    NOT: Yayın rakamları geleneksel olarak maya kolonilerinin görüntülerini 0 mM Cu2+ konsantrasyonunda, son uygulanabilir bakır konsantrasyonunda ve koloninin öldüğü sonraki konsantrasyonda gösterir. Veriler, çoğaltmalar arasındaki standart sapma için hata çubukları içeren bir çubuk grafik olarak da görüntülenebilir. Verilerin normalleştirilmesine gerek yoktur, ancak WT ekleme faktörü kontrolünün uygulanabilirliğini 1'e ayarlayarak ve ortaya çıkan mutasyonların etkisini karşılaştırarak olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ACT1-CUP1 gibi büyüme tahlilleri, çoklu kolonilerin görsel, karşılaştırmalı değerlendirmesini gerektirir. Burada, her bir suş gece boyunca doygunluğa büyütüldü, 0.5'lik bir OD600'e seyreltildi ve 0 mM ila 1.1 mM CuSO4 arasında bir dizi bakır konsantrasyonu içeren 20 plaka üzerine kaplandı (Şekil 3). Bu aralık, aşağıda kullanılan ve açıklanan QSP'lerin ve ACT1-CUP1 muhabirlerinin etkisinin tam olarak değerlendirilmesine izin verdiği için protokolde listelenenden daha küç...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ACT1-CUP1 bir büyüme testidir ve gözlemlenen büyüme farklılıklarının yalnızca ekleme kusurlarına atfedilebilmesini sağlamak için özen gösterilmelidir. Tüm suşlar, benzer uzunluk ve büyüme ve depolama koşullarına sahip olmak da dahil olmak üzere, kaplamadan önce benzer bir şekilde ele alınmalıdır. Sıcaklığa duyarlı suşlar kullanılıyorsa, ACT1-CUP1 testleri yalnızca bu suşların vahşi tiple karşılaştırılabilir şekilde büyüdüğü koşullar altında yapılmalıdır. İlgili olarak, QSP bileşeni için, sonuçların yorumlanmasını bulanık...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aaron Hoskins ve Wisconsin-Madison Üniversitesi'ndeki Hoskins laboratuvar üyelerine, şekil 3-5 neslinde maya suşlarının ve ekipmanlarının kullanımı için teşekkür ederiz. Harpreet Kaur ve Xingyang Fu'ya el yazması hakkındaki anlayışlı yorumları için teşekkür ederiz. Northwest University'deki destekleyici öğrencilere, personele ve fakülteye bu makalenin yazılması, düzenlenmesi ve filme alınması sırasında teşekkür ederiz. Bu yöntemin filme alınmasında yardım için Isabelle Marasigan'a teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL steril mikrosantrifüj tüpleriFisher Scientific05-408-129Veya farklı bir üreticiden benzer ürün.
2 mL steril mikrosantrifüj tüpleriFisher Scientific05-408-138Veya farklı bir üreticiden karşılaştırılabilir ürün.
50 mL steril santrifüj tüpleriFisher Scientific07-201-332Veya farklı bir üreticiden benzer ürün.
96 oyuklu yuvarlak tabanlı mikroplakaFisher Scientific07-200-760Veya farklı bir üreticiden karşılaştırılabilir ürün.
190 geçirmez etanolFisher Scientific22-032-600Veya farklı bir üreticiden karşılaştırılabilir ürün.
500 mL Filtre Sistemi (0.22 & mikro; m)CellTreat Scientific Products229707Veya farklı bir üreticiden karşılaştırılabilir ürün.
AgarFisher ScientificBP1423-500Herhangi bir moleküler dereceli agar işe yarayacaktır.
OtoklavTuttnauer3870EAVeya farklı bir üreticiden benzer ürün.
Bunsen brülörHumboldtPN6200.1Veya farklı bir üreticiden benzer ürün.
Hücre Yoğunluk ÖlçerVWR490005-906Veya 595 nm'de absorbansı ölçebilen başka bir spektral cihaz.
Bakır sülfat PentahidratFisher ScientificLC134051Veya farklı bir üreticiden karşılaştırılabilir ürün.
Dijital görüntüleme sistemiCytiva29399481ImageQuant 4000 (Şekil 3 için kullanılır),  Amersham ImageQuant 800 veya farklı bir üreticiden benzer ürün.
Bırakma karışımı (-Leu)USBiolojik Yaşam BilimleriD9525Deneyiniz için uygun bırakma karışımını kullanın. Sorgu bozulmanız için de bir maya besin belirteci kullanıyor olabilirsiniz. Bu durumda, bırakma karışımı o işaretleyici ve Leu
D-GlucoseFisher ScientificAAA1682836Veya farklı bir üreticiden karşılaştırılabilir bir ürün
Jel bant niceleme yazılımıCytiva29-0006-05ImageQuant TL v8.1 (şekil 5A için kullanılır) veya farklı bir üreticiden benzer ürün.
El tipi fotoğraf makinesiNikonD3500Veya farklı bir üreticiden benzer ürün.
Yakın kızılötesi jel görüntüleme cihazıCytiva29238583Amersham Typhoon NIR (Şekil 5a için kullanılır) veya farklı bir üreticiden benzer bir ürün.
Laboratuvar sınıfı kelepçeFisher Scientific05-769-7QVeya farklı bir üreticiden karşılaştırılabilir ürün.
Laboratuvar sınıfı stand ve kelepçeFisher Scientific12-000-101Veya farklı bir üreticiden benzer ürün.
Manyetik karıştırma çubuklarıFisher Scientific14-513-51Veya farklı bir üreticiden benzer ürün.
Pin çoğaltıcıVP ScientificVP 407AH
Yarı mikro tek kullanımlık küvetlerVWR97000-590Veya farklı bir üreticiden benzer ürün.
ShakerJEIO TechIST-3075Veya farklı bir üreticiden benzer ürün.
Spektrofotometre Biyodalga80-3000-45Veya 600 nm'de absorbansı ölçebilen herhangi bir spektofotometre.
Kare plakalarVWR102091-156Dairesel plakalar da kullanılabilir, ancak bir pim çoğaltıcı kullanılıyorsa daha zordur.
Karıştırma plakasıFisher Scientific11-520-16SVeya farklı bir üreticiden benzer ürün.
Maya azot bazlıUSBiolojik Yaşam BilimleriY2025Veya farklı bir üreticiden karşılaştırılabilir ürün.
için olmalıdır.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Luhrmann, R. The spliceosome: Design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 359-388 (2020).
  3. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
  4. Ng, R., Abelson, J. Isolation and sequence of the gene for actin in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (7), 3912-3916 (1980).
  5. Gallwitz, D., Sures, I. Structure of a split yeast gene: Complete nucleotide sequence of the actin gene in I. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2546-2550 (1980).
  6. Fogel, S., Welch, J. W., Cathala, G., Karin, M. Gene amplification in yeast: CUP1 copy number regulates copper resistance. Current Genetics. 7 (5), 347-355 (1983).
  7. Hamer, D. H., Thiele, D. J., Lemontt, J. E. Function and autoregulation of yeast copperthionein. Science. 228 (4700), 685-690 (1985).
  8. Winge, D. R., Nielson, K. B., Gray, W. R., Hamer, D. H. Yeast metallothionein. Sequence and metal-binding properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14464-14470 (1985).
  9. Burgess, S. M., Guthrie, C. A mechanism to enhance mRNA splicing fidelity: The RNA-dependent ATPase Prp16 governs usage of a discard pathway for aberrant lariat intermediates. Cell. 73 (7), 1377-1391 (1993).
  10. Collins, C. A., Guthrie, C. Allele-specific genetic interactions between Prp8 and RNA active site residues suggest a function for Prp8 at the catalytic core of the spliceosome. Genes & Development. 13 (15), 1970-1982 (1999).
  11. Siatecka, M., Reyes, J. L., Konarska, M. M. Functional interactions of Prp8 with both splice sites at the spliceosomal catalytic center. Genes & Development. 13 (15), 1983-1993 (1999).
  12. Umen, J. G., Guthrie, C. Mutagenesis of the yeast gene PRP8 reveals domains governing the specificity and fidelity of 3' splice site selection. Genetics. 143 (2), 723-739 (1996).
  13. Grainger, R. J., Beggs, J. D. Prp8 protein: At the heart of the spliceosome. RNA. 11 (5), 533-557 (2005).
  14. Query, C. C., Konarska, M. M. Suppression of multiple substrate mutations by spliceosomal prp8 alleles suggests functional correlations with ribosomal ambiguity mutants. Molecular Cell. 14 (3), 343-354 (2004).
  15. Konarska, M. M., Vilardell, J., Query, C. C. Repositioning of the reaction intermediate within the catalytic center of the spliceosome. Molecular Cell. 21 (4), 543-553 (2006).
  16. Liu, L., Query, C. C., Konarska, M. M. Opposing classes of prp8 alleles modulate the transition between the catalytic steps of pre-mRNA splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (6), 519-526 (2007).
  17. MacRae, A. J., et al. Prp8 positioning of U5 snRNA is linked to 5' splice site recognition. RNA. 24 (6), 769-777 (2018).
  18. Query, C. C., Konarska, M. M. CEF1/CDC5 alleles modulate transitions between catalytic conformations of the spliceosome. RNA. 18 (5), 1001-1013 (2012).
  19. Tang, Q., et al. SF3B1/Hsh155 HEAT motif mutations affect interaction with the spliceosomal ATPase Prp5, resulting in altered branch site selectivity in pre-mRNA splicing. Genes & Development. 30 (24), 2710-2723 (2016).
  20. Carrocci, T. J., Zoerner, D. M., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. SF3b1 mutations associated with myelodysplastic syndromes alter the fidelity of branchsite selection in yeast. Nucleic Acids Research. 45 (8), 4837-4852 (2017).
  21. Kaur, H., Groubert, B., Paulson, J. C., McMillan, S., Hoskins, A. A. Impact of cancer-associated mutations in Hsh155/SF3b1 HEAT repeats 9-12 on pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 15 (4), 0229315(2020).
  22. vander Feltz, C., et al. Saccharomyces cerevisiae Ecm2 modulates the catalytic steps of pre-mRNA splicing. RNA. 27 (5), 591-603 (2021).
  23. Carrocci, T. J., Paulson, J. C., Hoskins, A. A. Functional analysis of Hsh155/SF3b1 interactions with the U2 snRNA/branch site duplex. RNA. 24 (8), 1028-1040 (2018).
  24. Hogg, R., de Almeida, R. A., Ruckshanthi, J. P., O'Keefe, R. T. Remodeling of U2-U6 snRNA helix I during pre-mRNA splicing by Prp16 and the NineTeen Complex protein Cwc2. Nucleic Acids Research. 42 (12), 8008-8023 (2014).
  25. Hansen, S. R., Nikolai, B. J., Spreacker, P. J., Carrocci, T. J., Hoskins, A. A. Chemical inhibition of pre-mRNA splicing in living Saccharomyces cerevisiae. Cell Chemical Biology. 26 (3), 443-448 (2019).
  26. Xu, Y. Z., Query, C. C. Competition between the ATPase Prp5 and branch region-U2 snRNA pairing modulates the fidelity of spliceosome assembly. Molecular Cell. 28 (5), 838-849 (2007).
  27. Staley, J. P., Guthrie, C. An RNA switch at the 5' splice site requires ATP and the DEAD box protein Prp28p. Molecular Cell. 3 (1), 55-64 (1999).
  28. Bousquet-Antonelli, C., Presutti, C., Tollervey, D. Identification of a regulated pathway for nuclear pre-mRNA turnover. Cell. 102 (6), 765-775 (2000).
  29. Villa, T., Guthrie, C. The Isy1p component of the NineTeen complex interacts with the ATPase Prp16p to regulate the fidelity of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 19 (16), 1894-1904 (2005).
  30. Mayas, R. M., Maita, H., Staley, J. P. Exon ligation is proofread by the DExD/H-box ATPase Prp22p. Nature Structure and Molecular Biology. 13 (6), 482-490 (2006).
  31. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutations in U6 snRNA that alter splice site specificity: Implications for the active site. Science. 262 (5142), 1982-1988 (1993).
  32. McPheeters, D. S. Interactions of the yeast U6 RNA with the pre-mRNA branch site. RNA. 2 (11), 1110-1123 (1996).
  33. Perriman, R. J., Ares, M. Rearrangement of competing U2 RNA helices within the spliceosome promotes multiple steps in splicing. Genes & Development. 21 (7), 811-820 (2007).
  34. Mefford, M. A., Staley, J. P. Evidence that U2/U6 helix I promotes both catalytic steps of pre-mRNA splicing and rearranges in between these steps. RNA. 15 (7), 1386-1397 (2009).
  35. Hilliker, A. K., Mefford, M. A., Staley, J. P. U2 toggles iteratively between the stem IIa and stem IIc conformations to promote pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (7), 821-834 (2007).
  36. Wu, G., et al. Pseudouridines in U2 snRNA stimulate the ATPase activity of Prp5 during spliceosome assembly. EMBO Journal. 35 (6), 654-667 (2016).
  37. Crotti, L. B., Bacikova, D., Horowitz, D. S. The Prp18 protein stabilizes the interaction of both exons with the U5 snRNA during the second step of pre-mRNA splicing. Genes & Development. 21 (10), 1204-1216 (2007).
  38. Fogel, S., Welch, J. W. Tandem gene amplification mediates copper resistance in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5342-5346 (1982).
  39. Gardner, J. M., Jaspersen, S. L. Manipulating the yeast genome: Deletion, mutation, and tagging by PCR. Methods Molecular Biology. 1205, 45-78 (2014).
  40. JoVE. Yeast Transformation and Cloning. In Biology I: yeast, Drosophila and C. Elegant. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2021).
  41. Gietz, R. D., Woods, R. A. Yeast transformation by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Molecular Biology. 313, 107-120 (2006).
  42. Gietz, R. D., Woods, R. A. Genetic transformation of yeast. Biotechniques. 30 (4), 816(2001).
  43. Mayerle, M., et al. Structural toggle in the RNaseH domain of Prp8 helps balance splicing fidelity and catalytic efficiency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 4739-4744 (2017).
  44. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  45. Beier, D. H., et al. Dynamics of the DEAD-box ATPase Prp5 RecA-like domains provide a conformational switch during spliceosome assembly. Nucleic Acids Research. 47 (20), 10842-10851 (2019).
  46. vander Feltz, C., DeHaven, A. C., Hoskins, A. A. Stress-induced pseudouridylation alters the structural equilibrium of yeast U2 snRNA Stem II. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 524-536 (2018).
  47. Rodgers, M. L., Didychuk, A. L., Butcher, S. E., Brow, D. A., Hoskins, A. A. A multi-step model for facilitated unwinding of the yeast U4/U6 RNA duplex. Nucleic Acids Research. 44 (22), 10912-10928 (2016).
  48. Stutz, F., Rosbash, M. A functional interaction between Rev and yeast pre-mRNA is related to splicing complex formation. EMBO Journal. 13 (17), 4096-4104 (1994).
  49. Libri, D., Lescure, A., Rosbash, M. Splicing enhancement in the yeast rp51b intron. RNA. 6 (3), 352-368 (2000).
  50. Libri, D., Stutz, F., McCarthy, T., Rosbash, M. RNA structural patterns and splicing: Molecular basis for an RNA-based enhancer. RNA. 1 (4), 425-436 (1995).
  51. Howe, K. J., Kane, C. M., Ares, M. Perturbation of transcription elongation influences the fidelity of internal exon inclusion in Saccharomyces cerevisiae. RNA. 9 (8), 993-1006 (2003).
  52. Cuenca-Bono, B., et al. SUS1 introns are required for efficient mRNA nuclear export in yeast. Nucleic Acids Research. 39 (19), 8599-8611 (2011).
  53. Scherrer, F. W., Spingola, M. A subset of Mer1p-dependent introns requires Bud13p for splicing activation and nuclear retention. RNA. 12 (7), 1361-1372 (2006).
  54. Hálová, M., et al. Nineteen complex-related factor Prp45 is required for the early stages of cotranscriptional spliceosome assembly. RNA. 23 (10), 1512-1524 (2017).
  55. Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3' splice site selection. Genes & Development. 9 (7), 855-868 (1995).
  56. Crotti, L. B., Horowitz, D. S. Exon sequences at the splice junctions affect splicing fidelity and alternative splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 18954-18959 (2009).
  57. Perriman, R., Ares, M. Invariant U2 snRNA nucleotides form a stem loop to recognize the intron early in splicing. Molecular Cell. 38 (3), 416-427 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ACT1 CUP1 AnaliziMaya Ekleme SplicingBak r B y me AnaliziEkleme Fakt r MutasyonuSaccharomyces CerevisiaePre mRNA EklenmesiB y me FenotipiRaport r AnaliziEkleme Duyarl l

İlgili makaleler