Yöntem makalesi

Zebra Balığı Larvalarında Kimyasal Olarak İndüklenen Kemik Kaybını Tespit Etmek için Alizarin Kırmızı Boyama Kullanımı

DOI:

10.3791/63251

⸱

28 Aralık 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Toxicology, School of Public Health, Jiangsu Key Laboratory of Preventive and Translational Medicine for Geriatric Diseases, Medical College of Soochow University, 2Department of Occupational Disease Prevention, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, 3Jiangsu Preventive Medicine Association, Nanjing, China

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, kurşun asetat maruziyetinin zebra balığı larvalarında kemik kütlesi değişikliğine neden olduğunu göstermek için alizarin kırmızısı boyamayı kullandık. Bu boyama yöntemi, diğer tehlikeli toksik maddelerin neden olduğu zebra balığı larva kaybındaki kemik kaybının araştırılmasına uyarlanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kurşun (Pb) maruziyetine bağlı kimyasal olarak indüklenen kemik kaybı, hem insan hem de hayvan iskelet sistemleri üzerinde bir dizi olumsuz etkiyi tetikleyebilir. Bununla birlikte, zebra balığındaki spesifik etkiler ve mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Alizarin kırmızısı, kalsiyum iyonları için yüksek bir afiniteye sahiptir ve kemiği görselleştirmeye ve iskelet mineral kütlesini göstermeye yardımcı olabilir. Bu çalışmada zebra balığı larvalarında kurşun asetat (PbAc) kaynaklı kemik kaybını alizarin kırmızısı boyama yöntemi kullanarak saptamayı amaçladık. Zebra balığı embriyoları, döllenme sonrası 2 ila 120 saat arasında bir dizi PbAc konsantrasyonu (0, 5, 10, 20 mg / L) ile tedavi edildi. Döllenmeden 9 gün sonra larvalar üzerinde tam montajlı iskelet boyama yapıldı ve toplam lekeli alan ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü. Sonuçlar, mineralize dokuların kırmızıyla boyandığını ve lekeli alanın PbAc'a maruz kalma grubunda önemli ölçüde azaldığını ve kemik mineralizasyonunda doza bağlı bir değişiklik olduğunu göstermiştir. Bu yazıda PbAc'a bağlı kemik defektlerindeki iskelet değişikliklerini araştırmak için bir boyama protokolü sunulmaktadır. Bu yöntem, zebra balığı larvalarında, diğer kimyasalların neden olduğu kemik kaybının tespiti için de kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son zamanlarda yapılan çalışmalar, glukokortikoidlere, aromataz inhibitörlerine ve aşırı alkol tüketimine bağlı osteoporozun yaygın olduğunu doğrulamıştır 1,2. Kurşun (Pb) bitkilerde, toprakta ve su ortamlarında bulunan toksik bir metaldir3. Pb'nin insan vücudu üzerindeki olumsuz etkileri çok dikkat çekmiş olsa da, kemik üzerindeki geri dönüşü olmayan etkisinin daha fazla araştırılması gerekmektedir. Kurşun zehirlenmesi, hem gelişmekte olan hem de yetişkin iskeletinde normal yaşam aktivitelerini etkileyen çeşitli patolojik değişikliklere neden olur. Çalışmalar, kronik Pb maruziyeti ile kemik hasarı4 arasında, bozulmuş kemik yapıları5,6, azalmış kemik mineral yoğunluğu ve hatta artmış osteoporoz riski dahil olmak üzere bir ilişki bulmuştur7.

Mineralize doku kemik gücü8 için büyük önem taşır ve kemik mineralizasyon matriks birikimi kemik oluşumunun kritik bir indeksidir9. Alizarin kırmızısı, kalsiyum iyonları için yüksek bir afiniteye sahiptir ve alizarin kırmızısı boyama, kemik oluşumunu değerlendirmek için standart bir prosedürdür10. Bu yönteme göre, mineralize doku kırmızıya boyanırken, diğer tüm dokular şeffaf kalır. Lekeli alan daha sonra dijital görüntü analizi11 ile ölçülür.

Zebra balığı, ilaç keşfi ve hastalık modellerinde yaygın olarak kullanılan önemli bir model organizmadır. Zebra balığı ve insanlarda yapılan genetik çalışmalar, iskelet morfogenezinin altında yatan mekanizmalarda moleküler düzeydebenzerlikler göstermiştir 12. Ayrıca, zebra balıklarının büyük kavramalarında murin modellerinden daha yüksek verimli ilaç veya biyomolekül taraması yapılabilir ve proosteojenik veya osteotoksik moleküllerin mekanik çalışmasını kolaylaştırır13. Toto 10'daki iskeletin diferansiyel boyanması, küçük omurgalılar ve memeli fetüslerinde iskelet displazisinin incelenmesinde sıklıkla kullanılır. Alizarin kırmızısı boyama, zebra balığı larvalarındaki kimyasalların kemik gelişimsel toksisitesini araştırmak için yapıldı. Burada, zebra balığı larvalarında kurşun asetat kaynaklı kemik defektlerini tespit etmek için bir protokolü tanımlamak için kurşunu örnek olarak kullandık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada özetlenen tüm hayvan prosedürleri, Soochow Üniversitesi Etik Komitesi Hayvan Bakım Enstitüsü tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Balık yetiştiriciliği ve embriyo toplama 14

  1. Balıkları her gün üç kez besleyin; Zebra balıklarının 14:10 saat açık/karanlık döngüsüyle 28,5 ± 0,5 °C'de muhafaza edilmesini sağlayın.
  2. Erkek ve dişi yetişkin balıkları, akşamları 2: 1 erkek-dişi oranında yumurtlama tanklarındaki izolasyon tahtalarıyla ayırın.
  3. Ertesi sabah, izolasyon tahtalarını saat 09: 00'da çıkarın ve embriyoları 2 saat sonra toplayın.
  4. Embriyoları deneyden önce 28.5 ° C'de tutulan bir biyokimyasal inkübatöre yerleştirin.

2. Kimyasal maruziyet

  1. Ana stoğu hazırlayın: kurşun asetat trihidratı (5 g) tartın ve karıştırarak ultra saf suda (50 mL) çözün.
    DİKKAT: PbAc toksiktir. Uygun toz maskeleri, koruyucu giysiler ve eldivenler giyin. Deneyi bir duman başlığı altında gerçekleştirin.
  2. Zebra balığı embriyolarını seçin ve rastgele 6 delikli plakalara dağıtın (3 mL zebra balığı yetiştirme suyunda kuyu başına 30 embriyo; bileşimi için Tablo 1'e bakınız). Embriyoları döllenme sonrası 2 ila 120 saat arasında PbAc (0, 5, 10, 20 mg / L) ile tedavi edin (hpf).
    NOT: PbAc konsantrasyonları, doz aralığı bulma deneylerine göre seçilmiştir. Sonuçlar, zebra balığı embriyolarındaki LC50 kurşun asetatın 120 hpf'de 41.044 mg / L olduğunu gösterdi. Bu nedenle, en yüksek konsantrasyon LC50'nin yarısına ve 2 kat seyreltme ile hazırlanan bir dizi çözeltiye ayarlandı.
  3. Larvaları döllenmeden 5 gün sonra günde iki kez besleyin (dpf). Zebra balığı embriyolarını 14:10 saat açık / karanlık döngüsü ile 28,5 ± 0,5 ° C'de tutun.
  4. Pb'siz ortamı (zebra balığı yetiştirme suyu) her 24 saatte bir 9 dpf'ye kadar yenileyin.
    NOT: Deneylerin tamamlanmasının ardından, kurşun içeren tüm çözeltiler belirlenmiş bir sıvı tankına döküldü ve deney yönetim merkezi tarafından muamele edildi.

3. Alizarin kırmızısı boyama

NOT: Tüm boyama işlemi boyunca uygun toz maskeleri, koruyucu giysiler ve eldivenler giyin. Tüm çözeltilerin bileşimleri Tablo 1'de gösterilmiştir.

  1. Özel boyama adımları
    NOT: Boyama işlemi, oda sıcaklığında 24 delikli bir plakada gerçekleştirilmiştir. Her çözelti eklendikten sonra, 24 delikli plakayı düşük hızda ayarlanmış sallama masasına yerleştirin.
    1. 9 dpf'de her gruptan rastgele 10 zebra balığı larvasını çıkarın ve balıkları 2 saat boyunca 1 mL% 2 paraformaldehit / 1x fosfat tamponlu salin içinde sabitleyin.
    2. Çözeltiyi boşaltın ve zebra balığı larvalarını 10 dakika boyunca 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 10 mM MgCl2 ile yıkayın.
    3. Çözeltiyi boşaltın ve larvaları aşağıdaki çözeltilerde her biri 5 dakika boyunca destaining için inkübe edin: susuz etanol (EtOH) çözeltisi (% 80 EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) / 10 mM MgCl2,% 50 EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH = 7.5) ve% 25 EtOH / 100mM Tris-HCl (pH = 7.5).
    4. Çözeltiyi boşaltın,% 3H2O 2 ve% 0.5 KOH'dan oluşan bir çözelti ile ağartarak pigmenti çıkarın ve pigment tamamen çıkarılana kadar her 10 dakikada bir gözlemleyin.
    5. Zebra balığı larvalarını, kabarcık kalmayana kadar her biri 10 dakika boyunca% 25 gliserin ve% 0.1 KOH ile birkaç kez durulayın.
      NOT: Kabarcıklardan kaçınmak önemlidir; Aksi takdirde, zebra balığı gövdesindeki kabarcıklar mikroskop altında siyah bir görüş alanı olarak görünecek ve bu da gözlemleri ve nicel analizleri etkileyecektir.
    6. Larvaları 50 dakika boyunca% 0.01 alizarinin 1 mL'sine batırarak lekeleyin.
    7. Çözeltiyi boşaltın ve arka planı temizlemek için 10 dakika boyunca 1mL% 50 gliserin / % 0.1 KOH ekleyin. Daha sonraki gözlemler için balıkları taze% 50 gliserin / % 0.1 KOH içinde saklayın.

4. Görüntü toplama

  1. Her seferinde bir larvayı cam slayta aktarın ve larvaları sıvı damlasının ortasında tutun.
  2. Larvaları stereo mikroskop altında gözlemleyin.
  3. Fotoğraf makinesini açın, yazılımı açın ( Malzeme Tablosu'na bakın) ve varsayılan ayarları koruyun.
  4. AE'ye tıklayın ve en iyi görüntüyü elde etmek için uygun bir pozlama süresi (bu deneyde 60 ms) seçin.
  5. Tüm görüntüleri aynı ayarlar altında yakalayın. Daha sonra analiz etmek üzere görüntüleri .tif biçiminde kaydedin.

5. Görüntü analizi

NOT: Görüntü analizi için bir dizi örnek grafik içeren bir örnek için Ek dosyaya bakın.

  1. ImageJ simgesine çift tıklayın ve adım 4.5'te kaydedilen görüntüleri analiz edin.
    1. Dosya'ya tıklayın | Adım 4.5'te kaydedilen görüntüleri açmak için açın.
    2. Resme Tıklayın | Yazın, 8 bit'i seçin.
    3. Düzenle'ye tıklayın | Ters çevir.
    4. Analiz Et'e tıklayın | Kalibre et, açılır arayüzde Kalibre edilmemiş OD'yi seçin, alt arayüzün sol alt köşesindeki Global kalibrasyon'u kontrol edin ve Tamam'ı tıklatın.
    5. Analiz Et'e tıklayın | Ölçeği Ayarla | Açılır arayüzde ölçeği kaldırmak için tıklayın, aşağıdaki Global'i kontrol edin ve Tamam'ı tıklayın.
    6. Analiz Et'e tıklayın | Ölçümler'i ayarlayın, açılır arayüzde öğe alanını seçin, aşağıdaki Eşik sınırını kontrol edin (yalnızca seçilen aralığı ölçmek için) ve Tamam'ı tıklayın.
    7. Resme Tıklayın | Ayarla| Eşik, bir görüntüde test edilecek tüm hedeflerin seçilmesi için uygun eşiği seçmek üzere açılır arabirimin ortasındaki kaydırıcıyı kaydırın (her görüntünün eşiğini değiştirin) ve Ayarla'yı tıklatın.
    8. Analiz Et'e tıklayın | Ölçün. Her grubun tarihlerini kaydedin.
  2. Farklılıkları analiz etmek için tek yönlü ANOVA'yı ve ardından Tukey'in çoklu karşılaştırma testini kullanın ve anlamlılık seviyesini p < 0.001 (***) olarak ayarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alizarin kırmızı boyama, zebra balığı larvalarında kemik mineralizasyonundaki değişiklikleri ölçmek için hassas ve spesifik bir yöntemdir. Bu çalışmada, PbAc'ın zebra balığı larvaları üzerinde ölüm, malformasyon, azalmış kalp atış hızı ve vücut uzunluğu kısalması gibi olumsuz etkileri olduğunu gözlemledik. Ayrıca, zebra balığı larvalarının mineral iskelet alanları, PbAc'ın neden olduğu kemik kaybını incelemek için değerlendirildi. 9 dpf'de (Şekil 1A), kafa iskeletinin birçok kemiği mineraliz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı, kemik metabolik hastalığını incelemek için uygun bir modeldir. Kemirgen modelleriyle karşılaştırıldığında, zebra balığı modellerinin kurulması nispeten hızlıdır ve hastalığın ciddiyetinin ölçülmesi daha kolaydır. Vahşi tip zebra balığı larvalarında, kafa iskeletinin mineralizasyonu 5 dpf'de ve eksenel iskelet 7 dpf15'te gerçekleşir. Böylece, PS, OP, CB ve NC gibi kraniyal kemikler 9 dpf'de iyi gelişmiştir. Larvalar tamamen lekelendikten ve ağartıldıktan sonra, yumuşak dokular temizle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81872646; 81811540034; 81573173) ve Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirme (PAPD) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 M Tris-HCl (pH = 7.5)Solarbio, Pekin, ÇinÇözeltisini tutuklamak için21
BBI, Şangay, Çin14sabitleme mendili
10x PBS tamponuBBI, Şangay, Çin%
35 H < sub > 2 < / sub > O < > < / sub >Yonghua, Jiangsu, Çin8pigment çıkarma
50 mL Santrifüj tüpüAKX, Jiangsu, Çin4
95 Susuz etanolEnox, Jiangsu, Çin2leke giderici
Alizarin kırmızısı (Saflık% 99,5)Solarbio, Pekin, Çin1boyama
Biyokimyasal inkübatörYiheng, Şangay, Çin3yükselen zebra balığı embriyoları
Elektronik ölçekSartorius, Almanya5Katı hammaddelerin tartılması
Gliserin (Saflık% 99,5)BBI, Şangay, Çin7lekeli balıkların saklanması
ImageJ (yazılım)ABD9dijital analiz
KOH (Saflık% 99,9)Sigma, Amerika10ağartma çözeltisi
Kurşun asetat trihidrat (Saflık% 99,5)Aladdin, Şangay, Çin11
MgCl < sub>2 (Saflık% 99.9)Aladdin, Şangay, Çin12temizleme solüsyonu
NIS-Elements F (yazılım)Nikon, Japonya13gözlemleme ve fotoğraf çekme
PipeAKX, Jiangsu, Çin18embriyo ve çözelti plakalarının çıkarılması
(24 oyuklu)Corning,AmerikaEmbriyo plakalarını boyamak için17
(6 oyuklu)Corning,AmerikaEmbriyo yetiştirmek için16
Silkeleme masasıBeyotime, Çin19çözeltiyi karıştırma
Stereo mikroskopNikon, Japonya20gözlem ve fotoğraf çekme
Zebra balığıSoochow Üniversitesi Zebra Balığı Deney Merkezi, Suzhou, Çin22deney hayvanı
% 4 Paraformaldehit Düzeltme % kap konteyner

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
  2. Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
  3. Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).
  4. Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147(2020).
  5. Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
  6. Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
  7. Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
  8. Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
  9. Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
  10. Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
  11. Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
  12. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  13. Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
  14. Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).
  15. Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).
  16. Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
  17. Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).
  18. Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kemik Kayb TespitiKur un Asetat Maruziyetiskelet BoyamaKemik MineralizasyonuKimyasal Kemik ToksisitesiStereo MikroskopiImageJ AnaliziOsteoporoz Modeli

İlgili makaleler