Yöntem makalesi

Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar

2.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63259

⸱

22 Kasım 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Discovery Brain Sciences, University of Edinburgh Medical School: Biomedical Sciences, 2Center for Regenerative Therapies at the TU Dresden

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Bu protokol, larva elleçlemesi için otomatik bir mikroakışkan platform ile birleştirilmiş bir lazer lezyon sistemi kullanarak zebra balığı larvalarında dokuya özgü ve yüksek oranda tekrarlanabilir yaralanmaları indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır.

Özet

Zebra balığı larvaları, döllenmeden sadece birkaç gün sonra yüksek rejeneratif kapasiteye sahip tamamen işlevsel bir merkezi sinir sistemine (CNS) sahiptir. Bu, bu hayvan modelini omurilik yaralanması ve rejenerasyonunu incelemek için çok yararlı kılar. Bu tür lezyonları indüklemek için standart protokol, gövdenin dorsal kısmını manuel olarak transekte etmektir. Bununla birlikte, bu teknik kapsamlı eğitim gerektirir ve ek dokulara zarar verir. Lazerle indüklenen lezyonlar için bu sınırlamaları aşmak için bir protokol geliştirildi ve eğitimsiz bir operatör için bile birçok hayvan üzerinde ve farklı seanslar arasında omurilik transeksiyonunun yüksek tekrarlanabilirliği ve bütünlüğüne izin verdi. Ayrıca, doku hasarı esas olarak omuriliğin kendisi ile sınırlıdır ve cilt, kas ve CNS gibi farklı dokulara zarar vermenin kafa karıştırıcı etkilerini azaltır. Ayrıca, omuriliğin hemi-lezyonları mümkündür. Lazer hasarından sonra doku bütünlüğünün daha iyi korunması, elektrofizyoloji gibi ek analizler için gerekli olan daha ileri diseksiyonları kolaylaştırır. Bu nedenle, bu yöntem manuel olarak ulaşılamayan yaralanma derecesinin hassas kontrolünü sağlar. Bu, gelecekte bu güçlü modelde yeni deneysel paradigmalara izin verir.

Giriş

Memelilerin aksine, zebra balığı (Danio rerio) yaralanmadan sonra merkezi sinir sistemlerini (CNS) onarabilir1. Zebra balığı larvalarının omurilik rejenerasyonu için bir model olarak kullanılması nispeten yenidir. Onarımın altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için değerli olduğu kanıtlanmıştır2. Bunun nedeni, manipülasyon kolaylığı, kısa deneysel döngü (her hafta yeni larvalar), dokuların optik şeffaflığı ve larvaların in vivo floresan mikroskobu için ideal olan küçük boyutudur.

Omurilik rejenerasyonu durumunda, larva kullanmanın iki ek avantajı, iyileşme hızı, yetişkinler için birkaç haftaya kıyasla birkaç gün ve manuel teknikler kullanarak yaralanmaları indükleme kolaylığıdır. Bu, son araştırmalar da dahil olmak üzere birçok çalışmada3,4,5 başarıyla kullanılmıştır6,7. Genel olarak, bu anlamlı veri üretiminin artmasına, deneysel protokollerin yüksek uyarlanabilirliğine ve deneysel maliyetlerin azalmasına neden olur. Döllenmeden sonraki 5 günden daha genç larvaların kullanımı, hayvan araştırmalarında 3R ilkelerini izleyerek hayvanların kullanımını da azaltır8.

Zebra balığı larvalarında omurilik yaralanmasından sonra, enflamatuar yanıt, hücre proliferasyonu, nörogenez, hayatta kalan veya yeni üretilen hücrelerin göçü, fonksiyonel aksonların reformu ve nöral süreç devrelerinin ve omurga dokularının küresel olarak yeniden şekillendirilmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik süreç meydana gelir6,7,9,10 . Başarılı bir şekilde organize edilmek için, bu süreçler bir dizi hücre tipi, hücre dışı matris bileşenleri ve biyokimyasal sinyaller arasında ince bir şekilde düzenlenmiş bir etkileşimi içerir11,12. Omurilik gibi karmaşık bir dokunun bu önemli yeniden yapılanmasının ayrıntılarını çözmek, hassas ve kontrollü deneysel yaklaşımların kullanılmasını ve geliştirilmesini gerektirir.

Zebra balıklarında omurilik rejenerasyonunu incelemek için kullanılan birincil deneysel paradigma, rezeksiyon, bıçaklama veya kriyoyaralanma yoluyla doku hasarını indüklemek için cerrahi araçlar kullanmaktır3,13. Bu yaklaşımlar, herhangi bir yeni operatör için zaman alıcı olan ve kısa vadeli projelerde kullanılmalarını engelleyebilecek mikrocerrahi becerilerinde özel eğitim gerektirme dezavantajına sahiptir. Ayrıca, genellikle rejenerasyonu etkileyebilecek çevre dokulara zarar verirler.

Başka bir yaklaşım da kimyasal olarak14 veya genetik manipülasyonlarla15 hücre hasarını indüklemektir. İkincisi, yüksek oranda hedeflenmiş hasara izin verir. Bununla birlikte, böyle bir teknik, herhangi bir deney yapmadan önce, her benzersiz bir hücre tipi hedeflendiğinde yenilenen yeni transgenik balıklar üretmek için uzun hazırlık çalışmaları gerektirir.

Bu nedenle, rejenerasyonda çeşitli çalışmalara uygun, hedefe yönelik ancak çok yönlü lezyonlara izin veren bir yönteme ihtiyaç vardır. Bir çözüm, ilgilenilen dokuda lokalize hasarı indüklemek için bir lazer kullanmaktır16,17,18,19,20. Gerçekten de, lazere bağlı doku hasarının kullanımı, birçok avantajı olan omurilik lezyonlarının oluşturulması için sağlam bir yaklaşım sunmaktadır. Bu tür lazer manipülasyon modülleri ile donatılmış mikroskoplar, zamansal kontrolün ekstra yararı ile hücre ablasyonunun gerçekleşeceği özelleştirilmiş şekilli bir alanın belirlenmesine izin verir. Lezyonun boyutu ve pozisyonu böylece herhangi bir soruyu ele almak için uyarlanabilir.

Çoğu lazer lezyon sisteminin eksik özelliği, bir dizi larva için yüksek oranda tekrarlanabilir bir şekilde yaralanmalara neden olma olasılığıdır. Burada, zebra balığı larvalarında yarı otomatik hassas ve kontrollü lezyonları indüklemek için otomatik larva kullanımı için tasarlanmış mikroakışkan bir platforma dayanan orijinal bir protokol açıklanmaktadır21. Dahası, burada sunulan sistemde, larvalar, hayvanın rostrokaudal ekseni etrafında serbest dönmesine izin veren bir cam kılcal damara yerleştirilir. Kullanıcı, larvaların hangi tarafının lazere sunulacağını seçebilirken, floresan görüntülemenin lazer ışınını tam olarak hedeflemesine ve lezyondan sonraki hasarı değerlendirmesine izin verebilir.

Burada açıklanan protokol, UV lazerle donatılmış bir eğirme diski (bundan böyle VAST sistemi olarak anılacaktır) ile birleştirilmiş yarı otomatik bir zebra balığı larva görüntüleme sistemi ile birlikte kullanılmaktadır. Bununla birlikte, protokolün ana noktaları ve tekniğin iddialarının çoğu, iki fotonlu lazer tarama mikroskopları, UV lazerle sağlanan dönen disk mikroskopları (FRAP modülü) veya fotoğraf manipülasyonu için lazer modüllü video mikroskoplar dahil olmak üzere hücre ablasyonu yapabilen bir lazerle donatılmış herhangi bir sistem için geçerlidir. VAST sistemi ile geleneksel numune işleme arasındaki temel farklardan biri, ikincisi için, larvaların 96 delikli bir plakaya yüklenmesi yerine, cam kapaklar / cam tabanlı Petri tabakları üzerine düşük erime noktalı agarozda monte edilmesinin gerekli olmasıdır.

Bu yöntemin sunduğu faydalar, rejenerasyon sürecinde hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında yenilikçi araştırmalar için fırsatlar sunmaktadır. Ayrıca, yüksek veri kalitesi, multidisipliner bir bağlamda nicel araştırmalara izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları, İngiltere İçişleri Bakanlığı'nın onayıyla ve yönetmeliklerine göre, PP8160052 proje lisansı altında gerçekleştirilmiştir. Proje, Edinburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Deneysel analizler için, her iki cinsiyetten 5 güne kadar olan zebra balığı larvaları aşağıdaki mevcut transgenik çizgilerden kullanılmıştır: Tg (Xla.Tubb: DsRed; mpeg1: GFP), Tg (Xla.Tubb: DsRed), Tg (betaaktin: utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) ve Tg (mnx1: gfp) (transgenik zebra balığı hatlarının üretimi ile ilgili Ek Dosya 1'e bakınız). Otomatik zebra balığı larva işleme platformunu kullanan protokolün bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm özel yazılımlar, komut dosyaları ve ayrıntılı deneysel protokoller https://github.com/jasonjearly/micropointpy/ mevcuttur.

1. Numune hazırlama

  1. Döllenme sonrası 5 saatte, embriyoları doğru gelişim aşaması için sıralayın21. Ölü yumurtaları ve zayıf gelişmiş ve aşırı gelişmiş embriyoları atın.
  2. Döllenme sonrası 3 günde (dpf), 90 mm'lik bir Petri kabında 50 mL balık tesisi suyuna 2 mL% 0.4 aminobenzoik-asit-etil-ester ekleyerek larvaları uyuşturun. Bir sorun olması durumunda cilt pigmentasyonunu önlemek için feniltiourea (PTU) ile yetiştirilen hayvanları kullanın (bkz. materyal tablosu), bu protokolde açıklanan 3 dpf larvalarında omurilik yaralanmaları için geçerli değildir.
    NOT: Bu nispeten yüksek anestezik konsantrasyon, lazer darbesini takiben larvaların hareketlerini önlemek için kullanılır.
  3. Embriyoları floresan muhabir ekspresyonu için tarayın (Ek Dosya 1).
    NOT: Yaralanmanın etkinliğini değerlendirmek için omurilik (veya diğer ilgi çekici yapı) için bir floresan muhabir sıklıkla gereklidir. Tg (Xla.Tubb: DsRed) kullanımı omuriliğin tanımlanmasına yardımcı olur.
  4. Seçilen larvaları, kuyu başına 300 μL balık tesisi suyu ile VAST sisteminde kullanılmak üzere 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Doğrudan 90 mm Petri kabından anestezi içeren ortamı kullanın. Kuyu başına sadece bir larva olduğundan emin olun. Lezyonlu larvaları toplamak için fazladan bir boş 96 kuyucuklu plaka hazırlayın.
    NOT: Başka bir lazer lezyon sistemi kullanıyorsanız, larvaları uygun bir gözlem odasında% 1 Düşük Erime Noktası (LMP) agaroz jeline monte edin.

2. Mikroskop hazırlama

  1. Ablasyon için lazer de dahil olmak üzere tüm sistem bileşenlerini (VAST, mikroskop, lazer, PC) açın.
  2. Donanım tamamen başlatıldıktan sonra, mikroskop yazılımını, ImageJ / Fiji'yi, piton entegre geliştirme ortamını (IDE) ve bu platformu kullanıyorsanız otomatik zebra balığı görüntüleme (VAST sistemi) yazılımını başlatın (bkz.
  3. Aşağıdaki adımları izleyerek VAST yazılımını kurun.
    1. VAST yazılımı başlatıldığında, ilk pencerede Plate'i seçin ve Bitti düğmesine tıklayın (Şekil 2A). Kılcal damarın boş ve temiz olup olmadığını soran başka bir küçük pencere açılacaktır. İçinde herhangi bir hava kabarcığı varsa kılcal damarın görüntüsüne bakarak doğrulayın. Değilse, Evet'e tıklayın. Herhangi bir kabarcık varsa, Hayır'a tıklayın ve 2.3.2-2.3.3 adımını izleyin (Şekil 2B).
    2. Büyük Parçacık (LP) Örnekleyici penceresinde, hava kabarcıklarını gidermek için Prime'a tıklayın (Şekil 2C).
    3. Ana yazılım penceresine gidin (kılcal görüntü ile) ve resme sağ tıklayın. Açılır menüden Boş kılcal görüntüyü kaydet'i seçin (Şekil 2B).
    4. LP Örnekleyici penceresinde, Dosya menüsüne gidin ve Komut Dosyası Aç seçeneğini belirleyin. Gerçekleştirilecek denemeye karşılık gelen komut dosyasını içeren bir dosya seçin.
    5. Ana VAST yazılım penceresinde Dosya'ya gidin ve Denemeyi Aç'ı seçin. Planlanan denemeye karşılık gelen deneme dosyasını seçin.
      NOT: Otomatik boşaltma ve Atıklara toplu çıkış kutularının işaretli OLMADIĞINDAN emin olun.
  4. Görüntüleme için mikroskop yazılımını kurun.
    1. Donanımı başlatmak için mikroskop görüntüleme yazılımını başlatın (bkz. Bu işlem, sisteme bağlı olarak birkaç dakika sürebilir.
    2. Edinme ayarlarına gidin ve larvalarda ifade edilen floroforu görüntülemek için mikroskopu kurun. Odak hacminin, omuriliğin veya hedeflenen dokunun tüm derinliğini lezyona uğratmak için optik eksen boyunca yeterince uzadığından emin olmak için 10x NA 0.5 su daldırma hedefi kullanın.
  5. Lazer lezyonları için ImageJ/Fiji'yi kurun.
    1. Dosya menüsüne gidin, komut dosyası penceresini açmak için Yeni/Komut Dosyası'nı seçin.
    2. Yeni pencerede, Dosya menüsüne gidin ve lazer lezyonu komut dosyasını (Manual_MP_Operation.ijm) yüklemek için Aç'ı seçin.
  6. Python IDE'yi ayarlayın.
    1. Python IDE'yi başlatın.
    2. Dosya menüsüne gidin ve lazeri yönetmek üzere komut dosyasını yüklemek için Dosya Aç'ı seçin (Watch_for_ROIs_py3.py).
    3. Çalıştır menüsüne gidin ve komut dosyasını çalıştırmak için Hata Ayıklama Yapmadan Çalıştır'ı seçin. Lazer zayıflatıcı başlatılırken TERMINAL panelindeki bir dizi iletinin bir miktar gürültüyle birlikte göründüğünden emin olun (Şekil 2D).

3. VAST sisteminde lazer lezyonlarının yapılması

  1. VAST yazılımının ana penceresindeki ok düğmelerine tıklayarak sahneyi hareket ettirerek kılcal damarı mikroskop hedefine göre ortalayın (Şekil 2B).
  2. Göz merceklerinden bakarak ve mikroskopun iletilen ışığını kullanarak kılcal damarın tepesine odaklanın.
    DİKKAT: Kılcal damar çok kırılgandır ve hedefe dokunulduğunda kırılabilir. İçeri ve dışarı odaklanırken mikroskop düğmesini yavaşça hareket ettirin.
  3. 96 delikli plakaları, VAST sisteminin LP Örnekleyicisinin plaka tutucusuna yerleştirin. Larva içeren plakayı sol tutucuya ve toplama plakasını sağa yerleştirin. Plakaların doğru yönlendirildiğinden emin olun: A1 kuyusu, tutucunun sol ön köşesinde olmalıdır.
  4. VAST yazılımında, LP Örnekleyici penceresinde, Plaka Şablonu düğmesine tıklayın ve larva içeren tüm kuyucukları seçin. Pencereyi doğrulamak ve kapatmak için Tamam düğmesine tıklayın (Şekil 2C).
  5. LP Örnekleyici penceresinde, larva yüklemeye başlamak için Plakayı Çalıştır düğmesine tıklayın.
    NOT: Bir süre sonra, larva kılcal damarda pozisyonda (deney tanım dosyasında önceden tanımlanmış) görünür olmalı ve omuriliğe zarar vermelidir. VAST tepsi ışığı, larvayı mikroskop hedefine bakan yanal tarafla ayarlamak için birkaç rotasyondan sonra kapanacaktır.
  6. Mikroskop yazılımına gidin ve larvaları görüntülemek için Canlı düğmesine tıklayın.
  7. Mikroskop odak düğmesini omurilik merkezi kanalı görünene kadar çevirin.
    NOT: Önce iletilen ışığı kullanarak odaklamak ve ardından floresan ile rafine etmek daha kolay olabilir.
  8. Floresan bir anlık görüntü alın ve görüntüyü özel bir klasöre kaydedin.
  9. Görüntüyü ImageJ'de açın ve gerekirse kontrastı ayarlayın ( ImageJ'deki Image/Adjust/Brightness/contrast... menüsünü kullanarak).
  10. İlgi Çekici Bölge (ROI) çizgi aracına tıklayın ve omuriliğe ortalanmış kısa bir çizgi (20 μm) çizin (Şekil 3A).
  11. Mikroskobu %100 yansıtıcı ayna konumuna getirin.
  12. ImageJ komut dosyasını yükleyin ve Çalıştır düğmesine tıklayın. Aşağıdaki parametreleri kullanın: Tekrarlama - 2; Örnek - 1; Genişlik - 40 mikron; Zayıflama - 89 (Tam lazer gücü) (Şekil 3C).
  13. Lazer atış sırası tamamlandığında, görüntüleme yazılımında floresan görüntülemeye geçin ve gerekirse odağı ayarlayın.
    NOT: Lazere maruz kalma sırasında kuyruk yer değiştirmesi nedeniyle odakta bir kayma sıklıkla gözlenir.
  14. Yeni bir anlık görüntü alın ve kaydedin.
  15. Bu yeni görüntüyü ImageJ'de açın ve omuriliğin kendisinden (~ 80 μm) daha büyük olması gereken, notochord'un üst kısmındaki omuriliğin ventral tarafının altından başlayıp omurilik ile cilt arasındaki boşlukta sona erecek şekilde dorsal tarafa doğru giden yeni bir çizgi çizin (Şekil 3B).
  16. Mikroskobu %100 yansıtıcı ayna konumuna getirin.
  17. ImageJ komut dosyası penceresine gidin ve Çalıştır düğmesine tıklayın. Aşağıdaki parametreleri kullanın: Tekrarlama - 2; Örnek - 1; Genişlik - 40 mikron; Zayıflama - 89 (Tam lazer gücü).
  18. (Daha uzun) lazer atış sırası bittikten sonra, floresan görüntüleme ve odaklama ile transeksiyon kalitesini doğrulayın. Lezyon bölgesinde hiçbir hücre veya aksonun bozulmadan kalmadığından emin olun, bu da karanlık veya soluk ve homojen bir floresan alan olarak görünmelidir (Şekil 3D, alt panel).
  19. Lezyonlu larvaları, ana VAST yazılım penceresine gidip Topla düğmesine tıklayarak boş 96 delikli plakaya (orijinal kuyununkiyle aynı kuyu koordinatlarına sahip) toplayın .
  20. Pencerenin sol alt köşesindeki Tepsi Işığı onay kutusunu tıklatarak VAST sistem ışığını tekrar açın.
  21. Yaralanacak her yeni larva için adım 3.3-3.17'yi tekrarlayın.

4. Lezyon sonrası elleçleme ve ek deneyler

  1. Larvaları 96 kuyucuklu plakadan mümkün olan en kısa sürede çıkarın ve larvaların lezyon sonrası iyileşmesi için taze balık tesisi suyu ile temiz bir Petri kabına aktarın. Petri kabını 28 ° C'de bir inkübatöre koyun.
    NOT: Hasar genellikle lezyondan sonraki ilk saat içinde yayılmaya devam eder. Bu nedenle lezyonun gerçek boyutu, yaklaşık 1 saatlik bir gecikmeden sonra floresan görüntüleme ile değerlendirilmelidir.

5. Sorun Giderme

  1. VAST sisteminin tüplerinde ve kılcal damarlarında hava kabarcıkları varsa, bunları çıkarmak için LP Örnekleyici penceresindeki Prime düğmesine tıklayın.
  2. Başarısız lezyonları göz önünde bulundurun (lezyon bölgesinde kalan floresandan değerlendirildiği gibi, beklenen kalıntı ve homojen arka plan dışında), aşağıda belirtilen çeşitli nedenlerden kaynaklanabilir.
    1. Düşük lazer gücü: Bu olduğunda, daha yüksek bir değerle deneyin.
      NOT: VAST sistemi bir boya lazeri ile donatılmıştır. Bu, lazer ışığı üretimi için kullanılan boya çözeltisinin konsantrasyonunun zamanla değişebileceği ve lazer gücünde bir azalmaya yol açabileceği anlamına gelir. Yeni bir çözümle değiştirmek genellikle sorunu çözer22.
    2. Kötü kalibrasyon: Bu olduğunda, lazer sisteminin kalibrasyonunu ve gücünü adım 5.2.2.1-5.2.2.4'e göre doğrulayın. Doğru şekilde kalibre edilmezse, lazer istenen yere yönlendirilmez, böylece başarısız lezyonlara veya komşu dokularda istenmeyen hasara yol açar.
      1. Kılcal haznenin üstüne bir ayna kaydırağı yerleştirin. Kaplanmış tarafa odaklanın (hedefe bakmalıdır). Daha kolay odaklanmak için slaytta önceki bir varsayılanı kullanın.
      2. Bir kalibrasyon betiği kullanarak bir lazer ablasyon paterni uygulayın.
      3. Desenin kalitesini değerlendirin. Noktalar veya çizgiler keskin görünmeli ve bulanık olmamalıdır.
      4. Lazer gücünün önceki seanslara göre değişip değişmediğini değerlendirmek için artan güce sahip bir rampa kullanın.
    3. Lezyonlar sırasında larva hareketi: Larvalar anesteziye farklı tepki verir; böylece lazer lezyonu işlem sırasında kuyruğun hareketlerini tetikleyerek başarılı bir transeksiyonun önlenebilmesini sağlar. Bu olduğunda, çevredeki dokulara zarar vermekten kaçınırken tamamlamak için lazer lezyonu adımlarının ekstra bir yinelemesini yapın.
    4. Kötü odaklanma: Bu gerçekleştiğinde, en iyi sonuçları almak için merkezi kanalın ortasına odaklanın.
    5. ROI çizimi, pozisyonu ve boyutu: ROI'nin konumu ve boyutu, başarılı transeksiyonlar için kritik öneme sahiptir. ROI, omurilikten daha büyük olmalı ve omuriliğin merkezine odaklanmalıdır. Bunu çözmek için, ROI'yi omuriliğin ventral tarafından çekmeye başlayın ve başarılı bir transeksiyon elde etmek için dorsal tarafa doğru yukarı çıkın. Bu muhtemelen ablasyon prosedürü sırasında lazer atışlarının sırası tarafından tetiklenen kuyruk hareketlerinden kaynaklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Omurilik transeksiyonunun doğrulanması
Protokolün tam omurilik transeksiyonuna izin verip vermediğini değerlendirmek için yapısal ve fonksiyonel araştırmalar yapıldı.

İlk olarak, lezyon bölgesindeki floresan kaybının lazer aydınlatmadan floresan fotobeyazlatma değil, nöronal doku hasarından kaynaklandığını doğrulamak için, asetillenmiş tübüline karşı bir antikor kullanarak immün boyama (bakınız Materyal Tablosu ve Ek Dosya 1) yapıldı. Lezyo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Zebra balıklarında rejenerasyon sırasında oyunda olan süreçlerin daha derin bir şekilde anlaşılmasına acil bir ihtiyaç vardır. Bu hayvan modeli, biyomedikal araştırmalara, özellikle omurilik yaralanmalarına birçok fayda sağlar1. Çalışmaların çoğu, iyi eğitimli bir operatör gerektiren ve çoklu doku hasarına neden olan manuel lezyonları içermektedir. Burada lezyon özellikleri üzerinde kontrol sağlayan ve çevre dokulara verilen hasarı azaltan bir lazer lezyon protokolü sunulmaktadır. Ayrıca, bu tekni...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma BBSRC (BB/S0001778/1) tarafından desteklenmiştir. CR, Princess Royal TENOVUS İskoçya Tıbbi Araştırma Burs Programı tarafından finanse edilmektedir. David Greenald'a (CRH, Edinburgh Üniversitesi) ve Katy Reid'e (CDBS, Edinburgh Üniversitesi) transgenik balıkların nazik hediyesi için teşekkür ederiz ( Ek Dosyaya Bakınız). Daniel Soong'a (CRH, Edinburgh Üniversitesi) 3i eğirme diski konfokaline nazik erişim için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Software
Mikroskop yazılımı Zen Blue 2.0Carl Zeiss
ImageJ/FIJIAçık Kaynak
Visual Studio CodeMicrosoft
Mikroskop ve aksesuarları
ApoTome mikroskobuCarl Zeiss
C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) daldırma lensiCarl Zeiss
çift AxioCam 506 m CCD kameralarCarl Zeiss
Lazer taramalı konfokal mikroskop LSM880Carl Zeiss
Eğirme diski modülü CSU-X1Yokogawa
Dik mikroskopAxio Examiner D1Carl Zeiss
UV lazerMicropoint
VAST BioImagerUnion Biometrica
Labware
90 mm Petri kabıThermo-Fisher101R20
96 oyuklu plakaCorning3841
Chemicals
Click-It EdU Görüntüleme KitiInvitrogenC10637
aminobenzoik asit-etil metil-ester (MS222)Sigma-AldrichA5040
feniltiyoüre (PTU)Sigma-AldrichP7629
Antikorlar
Eşek anti-tavuk Alexa Fluor 488Jackson703-545-155
Eşek anti-fare Cy3Jackson715-165-150
Fare anti-GFPAbcamAB13970
Fare anti-tubulin asetillenmiş antikorSigmaT6793
Transgenik zebra balığı hatları
Tg(beta-aktin:utrofin-mCherry)N/ADavid Greenhald tarafından kurulan, Edinburgh Üniversitesi
Tg(mnx1:gfp)N/Aİlk olarak [Flanagan-Steet et al. 2005]
Tg(Xla.Tubb:DsRed)N/Aİlk olarak [Peri ve Nusslein-Volhard 2008]
Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP)N/AKaty Reid tarafından kuruldu, Edinburgh Üniversitesi
Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)N/ADavid Greenhald tarafından kuruldu, Edinburgh Üniversitesi

Kaynaklar

  1. Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
  2. Ohnmacht, J., et al. Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish. Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).
  3. Anguita-Salinas, C., et al. Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish. Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).
  4. Chapela, D., et al. A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals. Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).
  5. Schlüßler, R., et al. Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging. Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).
  6. Cavone, L., et al. A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord. Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).
  7. Keatinge, M., et al. CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury. PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).
  8. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research. , Available from: https://nc3rs.org.uk (2021).
  9. Hui, S. P., et al. Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish. PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).
  10. Vasudevan, D., et al. Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury. Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).
  11. Becker, T., Becker, C. G. Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish. Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).
  12. Wehner, D., et al. Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish. Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).
  13. Briona, L. K., Dorsky, R. I. Spinal cord transection in the larval Zebrafish. Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).
  14. Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).
  15. Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits. Science. 305 (5681), 254-258 (2004).
  16. Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).
  17. Nichols, E. L., Smith, C. J. Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion. Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).
  18. Ellström, I. D., et al. Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses. Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).
  19. Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).
  20. Early, J. J., et al. An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination. eLife. , 1-31 (2018).
  21. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. AndOr Micropoint Manual. , Available from: https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual (2021).
  23. Knafo, S., et al. Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion. eLife. 6, 25260(2017).
  24. Tsarouchas, T. M., et al. Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1β and Tnf-α by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration. Nature Communications. 9, (2018).
  25. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  26. Howell, D. Statistical methods for psychology. , Duxbury. 324-325 (2002).
  27. Tukey, J. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  28. Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).
  29. Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
  30. Menelaou, E., McLean, D. L. Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish. Nature Communications. 10, 1-12 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme


Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 4/07/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.

The title was updated from:

Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

to:

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Etiketler

Lazerle nd klenmi YaralanmaKontroll LezyonMerkezi Sinir SistemiKalsiyum G r nt lememm nohistokimyaElektrofizyolojiFloresan G r nt lemeMakrofaj G

İlgili makaleler