Bu protokol, larva elleçlemesi için otomatik bir mikroakışkan platform ile birleştirilmiş bir lazer lezyon sistemi kullanarak zebra balığı larvalarında dokuya özgü ve yüksek oranda tekrarlanabilir yaralanmaları indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar
Bu makalede
Düzeltme bildirimi
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Özet
Özet
Zebra balığı larvaları, döllenmeden sadece birkaç gün sonra yüksek rejeneratif kapasiteye sahip tamamen işlevsel bir merkezi sinir sistemine (CNS) sahiptir. Bu, bu hayvan modelini omurilik yaralanması ve rejenerasyonunu incelemek için çok yararlı kılar. Bu tür lezyonları indüklemek için standart protokol, gövdenin dorsal kısmını manuel olarak transekte etmektir. Bununla birlikte, bu teknik kapsamlı eğitim gerektirir ve ek dokulara zarar verir. Lazerle indüklenen lezyonlar için bu sınırlamaları aşmak için bir protokol geliştirildi ve eğitimsiz bir operatör için bile birçok hayvan üzerinde ve farklı seanslar arasında omurilik transeksiyonunun yüksek tekrarlanabilirliği ve bütünlüğüne izin verdi. Ayrıca, doku hasarı esas olarak omuriliğin kendisi ile sınırlıdır ve cilt, kas ve CNS gibi farklı dokulara zarar vermenin kafa karıştırıcı etkilerini azaltır. Ayrıca, omuriliğin hemi-lezyonları mümkündür. Lazer hasarından sonra doku bütünlüğünün daha iyi korunması, elektrofizyoloji gibi ek analizler için gerekli olan daha ileri diseksiyonları kolaylaştırır. Bu nedenle, bu yöntem manuel olarak ulaşılamayan yaralanma derecesinin hassas kontrolünü sağlar. Bu, gelecekte bu güçlü modelde yeni deneysel paradigmalara izin verir.
Giriş
Memelilerin aksine, zebra balığı (Danio rerio) yaralanmadan sonra merkezi sinir sistemlerini (CNS) onarabilir1. Zebra balığı larvalarının omurilik rejenerasyonu için bir model olarak kullanılması nispeten yenidir. Onarımın altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için değerli olduğu kanıtlanmıştır2. Bunun nedeni, manipülasyon kolaylığı, kısa deneysel döngü (her hafta yeni larvalar), dokuların optik şeffaflığı ve larvaların in vivo floresan mikroskobu için ideal olan küçük boyutudur.
Omurilik rejenerasyonu durumunda, larva kullanmanın iki ek avantajı, iyile....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan çalışmaları, İngiltere İçişleri Bakanlığı'nın onayıyla ve yönetmeliklerine göre, PP8160052 proje lisansı altında gerçekleştirilmiştir. Proje, Edinburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Deneysel analizler için, her iki cinsiyetten 5 güne kadar olan zebra balığı larvaları aşağıdaki mevcut transgenik çizgilerden kullanılmıştır: Tg (Xla.Tubb: DsRed; mpeg1: GFP), Tg (Xla.Tubb: DsRed), Tg (betaaktin: utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) ve Tg (mnx1: gfp) (transgenik zebra balığı hatlarının üretimi ile ilgili Ek Dosya 1'e bakınız). Otomatik zebra balığı larva işleme platformunu kullanan protokolü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Omurilik transeksiyonunun doğrulanması
Protokolün tam omurilik transeksiyonuna izin verip vermediğini değerlendirmek için yapısal ve fonksiyonel araştırmalar yapıldı.
İlk olarak, lezyon bölgesindeki floresan kaybının lazer aydınlatmadan floresan fotobeyazlatma değil, nöronal doku hasarından kaynaklandığını doğrulamak için, asetillenmiş tübüline karşı bir antikor kullanarak immün boyama (bakınız Materyal Tablosu ve Ek Dosya 1) yapıldı. Lezyo.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Zebra balıklarında rejenerasyon sırasında oyunda olan süreçlerin daha derin bir şekilde anlaşılmasına acil bir ihtiyaç vardır. Bu hayvan modeli, biyomedikal araştırmalara, özellikle omurilik yaralanmalarına birçok fayda sağlar1. Çalışmaların çoğu, iyi eğitimli bir operatör gerektiren ve çoklu doku hasarına neden olan manuel lezyonları içermektedir. Burada lezyon özellikleri üzerinde kontrol sağlayan ve çevre dokulara verilen hasarı azaltan bir lazer lezyon protokolü sunulmaktadır. Ayrıca, bu tekni.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma BBSRC (BB/S0001778/1) tarafından desteklenmiştir. CR, Princess Royal TENOVUS İskoçya Tıbbi Araştırma Burs Programı tarafından finanse edilmektedir. David Greenald'a (CRH, Edinburgh Üniversitesi) ve Katy Reid'e (CDBS, Edinburgh Üniversitesi) transgenik balıkların nazik hediyesi için teşekkür ederiz ( Ek Dosyaya Bakınız). Daniel Soong'a (CRH, Edinburgh Üniversitesi) 3i eğirme diski konfokaline nazik erişim için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Software | |||
| Mikroskop yazılımı Zen Blue 2.0 | Carl Zeiss | ||
| ImageJ/FIJI | Açık Kaynak | ||
| Visual Studio Code | Microsoft | ||
| Mikroskop ve aksesuarları | |||
| ApoTome mikroskobu | Carl Zeiss | ||
| C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) daldırma lensi | Carl Zeiss | ||
| çift AxioCam 506 m CCD kameralar | Carl Zeiss | ||
| Lazer taramalı konfokal mikroskop LSM880 | Carl Zeiss | ||
| Eğirme diski modülü CSU-X1 | Yokogawa | ||
| Dik mikroskopAxio Examiner D1 | Carl Zeiss | ||
| UV lazer | Micropoint | ||
| VAST BioImager | Union Biometrica | ||
| Labware | |||
| 90 mm Petri kabı | Thermo-Fisher | 101R20 | |
| 96 oyuklu plaka | Corning | 3841 | |
| Chemicals | |||
| Click-It EdU Görüntüleme Kiti | Invitrogen | C10637 | |
| aminobenzoik asit-etil metil-ester (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| feniltiyoüre (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Antikorlar | |||
| Eşek anti-tavuk Alexa Fluor 488 | Jackson | 703-545-155 | |
| Eşek anti-fare Cy3 | Jackson | 715-165-150 | |
| Fare anti-GFP | Abcam | AB13970 | |
| Fare anti-tubulin asetillenmiş antikor | Sigma | T6793 | |
| Transgenik zebra balığı hatları | |||
| Tg(beta-aktin:utrofin-mCherry) | N/A | David Greenhald tarafından kurulan, Edinburgh Üniversitesi | |
| Tg(mnx1:gfp) | N/A | İlk olarak [Flanagan-Steet et al. 2005] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed) | N/A | İlk olarak [Peri ve Nusslein-Volhard 2008] | |
| Tg(Xla.Tubb:DsRed; mpeg1:GFP) | N/A | Katy Reid tarafından kuruldu, Edinburgh Üniversitesi | |
| Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) | N/A | David Greenhald tarafından kuruldu, Edinburgh Üniversitesi |
Kaynaklar
- Becker, C. G., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Ohnmacht, J., et al. Spinal motor ne....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Düzeltme
Formal Correction: Erratum:Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
Posted by JoVE Editors on 4/07/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae. The title was updated.
The title was updated from:
Controlled Semi-Automated Lased-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
to:
Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae
