Yöntem makalesi

Afinite Kromatografisi Kullanılarak İnsan Matriksi Metalloproteinaz-3'ün Bakteriyel İfadesi ve Saflaştırılması

DOI:

10.3791/63263

⸱

30 Mart 2022

 ,  , 
1Department of Chemical & Materials Engineering, University of Nevada, Reno

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onun etiketi saflaştırma, diyaliz ve aktivasyon, bakterilerde çözünür, aktif matriks metalloproteinaz-3 katalitik alan protein ekspresyonunun verimini arttırmak için kullanılır. Protein fraksiyonları SDS-PAGE jelleri ile analiz edilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Matriks metalloproteinazlar (MMP'ler), hücre dışı matriks (ECM) bozunması ve yeniden şekillenmesinde merkezi rolleri olan metzinsin proteazlar ailesine ve ayrıca çeşitli büyüme faktörleri ve sitokinlerle etkileşimlere aittir. Spesifik MMP'lerin aşırı ekspresyonu, kanser, nörodejeneratif hastalıklar ve kardiyovasküler hastalık gibi çeşitli hastalıklardan sorumludur. MMP'ler, MMP aşırı ekspresyonu ile ilişkili hastalıkları tedavi edebilen terapötikler geliştirmeyi hedef alan hedefler olarak son zamanlarda ilgi odağı olmuştur.

Çözeltideki MMP mekanizmasını incelemek için, aktif, çözünür MMP'lerin üretimi için daha kolay ve sağlam rekombinant protein ekspresyonu ve saflaştırma yöntemlerine ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, çoğu MMP'nin katalitik alanı, posttranslasyonel makine eksikliği nedeniyle Escherichia coli'de (E. coli) çözünür formda ifade edilemezken, memeli ekspresyon sistemleri genellikle maliyetlidir ve daha düşük verime sahiptir. MMP inklüzyon organları, doğal konformasyondaki MMP'lerin verimini önemli ölçüde azaltan sıkıcı ve zahmetli kapsamlı saflaştırma ve yeniden katlama sürecinden geçmelidir. Bu yazıda, matris metalloproteinaz-3 katalitik etki alanı (MMP-3cd) üretmek için Rosetta2 (DE3) pLysS (bundan böyle R2DP olarak anılacaktır) hücrelerini kullanan ve afinite saflaştırmasında kullanılmak üzere bir N-terminal His-etiketi ve ardından pro-domain (Hisx6-pro-MMP-3cd) içeren bir protokol sunulmaktadır. R2DP hücreleri, bakteriyel ekspresyon sistemlerinde normalde nadir görülen kodonları içeren kloramfenikol dirençli bir plazmid yoluyla ökaryotik proteinlerin ekspresyonunu arttırır. Rekombinant protein ekspresyonu için tercih edilen geleneksel hücre hattı BL21 (DE3) ile karşılaştırıldığında, bu yeni suşu kullanarak saflaştırma, saflaştırılmış Hisx6-pro-MMP-3cd'nin verimini artırdı. Aktivasyon ve tuzdan arındırma üzerine, pro etki alanı N-terminal His-tag ile birlikte bölünür ve sayısız in vitro uygulamada anında kullanım için aktif MMP-3cd sağlar. Bu yöntem pahalı ekipman veya karmaşık füzyon proteinleri gerektirmez ve bakterilerde rekombinant insan MMP'lerinin hızlı üretimini tanımlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çoğu kompleks ökaryotik protein, ekspresyondan sonra ayrıntılı posttranslasyonel modifikasyonlara uğrar ve yüksek oranda yardımcı protein katlanmasını ve ko-faktörlerin işlevsel olmasını gerektirir1. Bir bakteri konağında büyük miktarlarda çözünür insan proteini üretmek, yüksek maliyetler ve daha küçük ölçekli laboratuvar deneyleri için bile sağlam ekspresyon ve saflaştırma yöntemlerinin bulunmaması nedeniyle önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir2,3. MMP'ler, büyük moleküler ağırlığa sahip insan endopeptidazları, genellikle E. coli'de ifade edildiğinde çözünmez inklüzyon cisimleri olarak ifade edilir. Çözünür insan MMP'lerinin ekstraksiyonu genellikle zahmetli, zaman alıcı bir çözünürlük ve yeniden katlama işlemine yol açar4.

MMP'ler hem fizyolojik hem de patojenik süreçlerde kritik rollere sahiptir. İnsan MMP'leri, yapı ve substrat özgüllüğüne göre kategorize edilen ve yüksek oranda korunmuş bir katalitik alana rağmen farklı şekilde eksprese edilen 23 çinko endopeptidaz ailesidir5,6. MMP'ler inaktif zimojenler olarak salgılanır, posttranslasyonel aktivasyon ve endojen inhibitörleri, metalloproteinazların doku inhibitörleri (TIMP'ler) 7,8,9,10 ile düzenlenir. Başlangıçta ECM cirosundaki rolleriyle tanınmasına rağmen, MMP'ler gelişim, morfogenez, doku onarımı ve yeniden şekillendirmede de rol oynamıştır8. MMP'lerin düzensizliği, diğer hastalıkların yanı sıra nörodejeneratif, kardiyovasküler ve fibrotik hastalıklarla birlikte kanserle de özellikle ilişkilendirilmiştir5,7.

Sağlam büyük ölçekli MMP üretim yöntemlerinin geliştirilmesi, biyokimyasal ve hücre bazlı testler yoluyla MMP mekanizmalarının gelecekteki çalışmalarının başarısını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Çeşitli MMP'ler daha önce MMP aktivitesini değiştirmeden Hisx6 etiketli MMP'ler de dahil olmak üzere bakterilerde11 ifade edilmiştir12,13,14,15. Ancak, bu yöntemler çoğaltılması zor olabilecek sıkıcı, uzun adımlar içerir.

Memeli hücreleri, uygun posttranslasyonel modifikasyonları sağlarken birçok farklı insan proteinini eksprese etmek için de kullanılabilir16. Memeli ekspresyon sistemi, uygun post-translasyonel modifikasyonlarla rekombinant insan proteinleri üretmek için ideal bir seçim olmasına rağmen, bu yöntemin başlıca dezavantajları başlangıçtaki düşük verimler, maliyetli büyüme ortamı ve reaktifleri, kararlı ekspresyon hatlarına ulaşmak için uzun zaman çizelgeleri ve mantar veya bakteri gibi diğer türlerle kontaminasyon riskidir2,11 . Ayrıca, memeli hücre hatlarındaki MMP üretimi, TIMP veya fibronektinler gibi ilişkili hücresel proteinlerden safsızlıklar verir11. Memeli hücrelerinde gözlenen yavaş hücre büyümesinin aksine, bakteri ekspresyon sistemi, daha basit ortam ve büyüme gereksinimleri ile birlikte kısa sürede büyük ölçekli protein üretimi sunar. Bununla birlikte, bakteriyel ekspresyon sistemlerinde diğer ilişkili hücresel proteinlerin (yani TIMP'lerin) eksikliği nedeniyle, daha yüksek konsantrasyonlardaki aktif MMP'ler otoproteoliz yoluyla bozunmaya maruz kalır ve bu da zayıf MMP verimine neden olur17.

Bu yazıda, uygun fiyatlılığı, basitliği ve daha yüksek MMP verimi üretmedeki başarısı nedeniyle E. coli'yi ekspresyon konakçısı olarak kullanan rekombinant Hisx6-pro-MMP-3cd'nin bakteriyel ekspresyonu, saflaştırılması ve aktivasyonu için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır2,3,18. E. coli, rekombinant MMP'ler ve diğer karmaşık proteinler için gerekli protein katlama makinesinden ve posttranslasyonel işlemden yoksun olduğundan, birçok E. coli suşu bu sınırlamaların üstesinden gelmek için tasarlanmıştır ve E. coli'yi rekombinant insan MMP-3cd'nin ekspresyonu için daha uygun bir konakçı haline getirmiştir,19,20 . Örneğin, bu çalışmada kullanılan R2DP suşu, E. coli'de nadiren kullanılan kodonları içeren kloramfenikol dirençli bir plazmid sağlayarak ökaryotik ekspresyonu arttırır.

Bu protokolde açıklandığı gibi, R2DP hücrelerinde pET-3a vektöründen (Şekil 1) nispeten saf inklüzyon cisimlerinin aşırı ekspresyonundan sonra, Hisx6-pro-MMP-3 katalitik alan (MMP-3cd) proteinleri ekstrakte edilir ve denatüre edilir4. Hisx6-pro-MMP-3cd3,19, afinite etiketi kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı. Yeniden katlanma ve diyaliz üzerine, pro-MMP-3cd (zymogen) 4-aminofenilmerkürik asetat (APMA) ile aktive edildi ve verimi ve daha fazla saflaştırma ihtiyacını değerlendirmek için SDS-PAGE analizi kullanıldı5,21. Bu protokol, örnek olarak çözünür MMP-3cd'nin ekspresyonunu, saflaştırılmasını ve aktivasyonunu açıklar. Bununla birlikte, diğer MMP'lerin ve insan proteazlarının benzer ekspresyonla ekspresyonu ve aktivasyon mekanizmaları için bir rehber olarak da kullanılabilir (Şekil 2). MMP-3cd dışındaki diğer proteinler için, okuyucunun bu protokolü denemeden önce hedef proteinleri için en uygun tampon bileşimlerini ve yöntemlerini belirlemesi önerilir.

figure-introduction-1
Resim 1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plazmidinin plazmid haritası. pET-3a vektörü bir ampisilin direnç geni içerir. Bir N-terminal Hisx6-etiket dizisi, BamHI ve NdeI kısıtlama bölgeleri arasında T7 promotörünün kontrolü altında pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd yapısını üretmek için pro-MMP-3cd dahil olmak üzere pET-3a tabanlı vektöre klonlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-introduction-2
Şekil 2: Pro-MMP-3cd'nin bakteriyel ekspresyonu, saflaştırılması, yeniden katlanması ve aktivasyonu. 1.1: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd plazmidi BL21 (DE3) veya R2DP Hücrelerine dönüştürüldü. 1.2: Pro-MMP-3cd protein ekspresyonu IPTG kullanılarak indüklendi. 1.3: Kimyasal lizis ve sonikasyon, esas olarak çözünmeyen ve inklüzyon cisimlerinde bulunan Hisx6-pro-MMP-3cd proteinlerini çıkarmak için kullanılır. Üre, proteini inklüzyon cisimciklerinden denatüre etmek ve çözündürmek için kullanıldı. 2.1. Denatüre Hisx6-pro-MMP-3cd proteini, afinite kromatografisi saflaştırması ile saflaştırıldı. 3. Salınan Hisx6-pro-MMP-3cd, ürenin tampondan kademeli olarak çıkarılmasıyla diyaliz sırasında yavaşça yeniden katlandı. 4. Son olarak, yeniden katlanmış MMP-3cd proteini, N-terminal pro-peptid alanı çıkarılarak APMA kullanılarak aktive edildi. APMA daha sonra tuzdan arındırma yoluyla çözeltiden çıkarılır. Sayılar, bu adımları açıklayan protokol bölümlerine karşılık gelir. Kısaltmalar: MMP-3cd = Matriks metalloproteinaz-3 katalitik alan; APMA = 4-aminofenilmerkürik asetat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. MMP ifadesi

  1. pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd'nin klonlanması ve R2DP hücrelerine dönüştürülmesi
    1. pET-3a plazmidini (Malzeme Tablosuna bakınız) Digest Buffer'daki NdeI ve BamHI kısıtlama enzimleri ile sindirin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Toplam 40 μL'lik bir reaksiyon hacminde, 4 μL Sindirim Tamponu, 33 μL 100 ng / μL plazmid ve her bir kısıtlama enziminin 1.5 μL'sini ekleyin ve reaksiyonun 37 ° C'de tamamlanana kadar ~ 2 saat ilerlemesine izin verin.
    2. Bir N-terminal His-etiketi eklemek için MMP-3cd dizisinde bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin. 25 μL PCR Karışımı ( Malzeme Tablosuna bakınız), 2,5 μL 10 μM astarlar (Ek Şekil S1) ve 100 ng/μL kesici uç dizisinin 1,25 μL'sini kullanın. 50 μL'lik bir son reaksiyon hacmine steril su ekleyin.
    3. PCR ürününü ve sindirilmiş vektörü% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde çalıştırın. Jel bantlarını, üreticinin protokolüne göre bir Jel Kurtarma Kiti ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak saflaştırın.
    4. DNA Assembly Mix'i kullanarak güçlendirilmiş PCR ürününü NdeI ve BamHI kısıtlama bölgeleri arasındaki sindirilmiş vektöre klonlayın ( bkz. Toplam 15 μL'lik reaksiyon hacmi için kesici uç ve kesme vektörünün gerekli hacmini belirlemek için çevrimiçi araçları kullanın.
    5. Çözülene kadar buz üzerinde 50 μL'lik bir yüksek dönüşüm verimli hücre alikotunu (Malzeme Tablosuna bakınız) çözün. SOC Büyüme Ortamını (Malzeme Tablosuna bakınız) 37 °C'ye ve LB-ampisilin (LB Amper) plakalarına ( Malzeme Tablosuna bakınız) ısıtın.
    6. 50 μL aliquot'a pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd montaj reaksiyonunun 1-2 μL'sini ekleyin. 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
    7. 30 s boyunca 42 ° C'de inkübe ederek hücreleri ısıl şoka sokun. 2 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
    8. Her dönüştürücü karışıma 950 μL SOC büyüme ortamı ekleyin. 250 rpm ve 37 °C'de 1 saat çalkalayın.
    9. LB Amp plakalar üzerindeki transformantların 100 μL'lik plakası ve 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir.
    10. İzole edilen her koloniye 10 mL LB Amp ortamında aşılayın. Gece boyunca 250 rpm ve 37 °C'de çalkalayın.
    11. Miniprep kiti için üreticinin protokolüne göre plazmid DNA'sını çıkarın ( Malzeme Tablosuna bakınız). T7 ileri ve geri astarları kullanarak yapının sırasını onaylayın (Ek Şekil S1).
      NOT: pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd yapı DNA'sı -20 °C'de saklanabilir. Hazır olduğunda, R2DP hücrelerine dönüştürmeye devam edin.
    12. R2DP hücrelerinin bir adet 20 μL alikotunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 2-5 dakika boyunca buz üzerinde çözün. SOC büyüme ortamından oda sıcaklığına kadar ısıtın ve LB Amp CamR plakaları 37 °C'ye kadar ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    13. 50 μL aliquot'a 1 μL 100 ng/μL dizi onaylı pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd ekleyin. Tüpü karıştırmak ve buza döndürmek için hafifçe karıştırın.
    14. Tüpü 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
    15. Tam olarak 30 s için 42 ° C'de inkübe ederek hücreleri ısıl şoka sokun. Sallamayın.
    16. Hücreleri 2 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
    17. Transforman karışıma 80 μL oda sıcaklığında SOC ortamı ekleyin. 250 rpm ve 37 °C'de 1 saat çalkalayın.
    18. Transformantları LB Amp CamR plakalarına yerleştirin ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  2. Büyüme ve indüksiyon
    1. Bir LB Amp CamR plakasından R2DP pET-3a-Hisx6-pro-MMP-3cd dönüştürücüsünün tek, izole bir kolonisini, 37 ° C'de 10 mL LB Amp CamR ortamında aşılayın. Gece boyunca 250 rpm'de sallayın (~ 16 saat). Her kültürden alikotları saklayın ve istenirse% 40 (v / v) gliserol ( Malzeme Tablosuna bakınız) stokları hazırlayın.
    2. Gece kültürü başına, 500 mL LB Amp CamR ortamı içeren 1 L'lik bir şişeyi, 600 nm'de (OD600) 0.05-0.1'lik bir optik yoğunluğa aşılayın.
      NOT: Bu, hücreleri logaritmik büyümeye döndürmelidir.
    3. OD600'ü birkaç zaman noktasında, tipik olarak 3-4 saat boyunca, 0,4 ila 0,6 arasına düşene kadar ölçün.
    4. İndüksiyondan önce, kültürün bir kısmını 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne alikote edin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve İndüklenmemiş Fraksiyon olarak etiketleyin. Jel analizi için -80 °C'de saklayın. SDS-PAGE jeli çalıştırmıyorsanız, bu adımı atlayın ve adım 1.2.5'e geçin.
    5. 1 M izopropil-ß-D-tiyogalaktopiranosid (IPTG) stoğu kullanarak kültürleri 1 mM'lik bir nihai konsantrasyona indükleyin (bakınız Malzeme Tablosu). 37 °C çalkalayıcıda 3-4 saat daha inkübe etmeye devam edin.
      NOT: İfade sırasında, okuyucu indüksiyon sırasında en uygun OD600'ü ve IPTG konsantrasyonunu belirlemelidir. Saflaştırmadan sonra verim önemli ölçüde düşerse, saflaştırma tamponlarındaki imidazol konsantrasyonunun ayarlanması gerekebilir veya hücre peletinin daha fazla sonikleştirilmesi gerekebilir.
    6. Kültürleri santrifüjlemeden önce, kültürün bir kısmını ikinci bir 1.5 mL mikrofüj tüpüne alın ve İndüklenmiş Fraksiyon olarak etiketleyin. Jel analizi için -80 °C'de saklayın. SDS-PAGE jeli çalıştırmıyorsanız, bu adımı atlayın ve adım 1.2.7'ye geçin.
    7. Hücre kültürünü 250 mL konik şişelerde ( Malzeme Tablosuna bakınız) maksimum hızda ve 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    8. Kültürler tamamen peletlenene kadar adım 1.2.7'yi tekrarlayın.
      NOT: DURAKLAT: Hücre peletleri -80 °C'de dondurulabilir ve daha sonra işlenmek üzere çözülebilir. Aksi takdirde, bu adımı atlayın ve adım 1.3.1'e geçin.
  3. Inklüzyon cisimciklerinin ekstraksiyonu ve çözündürülmesi
    NOT: Taze 10 M üre, tercihen bir günden daha erken olmamak üzere, tamamen eriyene kadar iyice karıştırarak hazırlayın. Üreyi ısıtmayın veya otoklav yapmayın; oda sıcaklığında saklayın.
    1. Peletin (adım 1.2.8'den itibaren) lizis tamponunda yeniden askıya alınması (Malzeme Tablosuna bakınız). Pelet gramı başına 3 mL lizis tamponu ekleyin ve vorteks veya pipetleme ile yeniden askıya alın. Gece boyunca 4 °C'de çalkalayın.
    2. 1 L kültür başına 1.25 mL% 10 (w / v) sodyum deoksikolat ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Oda sıcaklığında 150 rpm'de 30 dakika çalkalayın.
    3. 1 L kültür başına 10 μL DNaz I ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). Oda sıcaklığında 150 rpm'de 30 dakika çalkalayın.
    4. 13.000 × g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüj.
    5. Jel analizi için Lysed MMP'nin bir kısmını bir kenara koyun. -80 °C'de saklayın. Jel analizi yapılmıyorsa, adım 1.3.6'ya geçin.
      NOT: Santrifüjlemeden sonra, pelet telli olabilir ve kompakt bir şekilde paketlenmemiş olabilir, bu da süpernatanın atılmasını riskli hale getirir. Bu durumda, adım 1.3.6'yı atlayın ve adım 1.3.7'ye geçin.
    6. Süpernatantı santrifüjlü numunelerden atın.
      NOT: Protokol bu noktada duraklatılabilir ve hücre peletleri -80 ° C'de dondurulabilir ve daha sonra çözülebilir. Aksi takdirde, bu adımı atlayın ve adım 1.3.7'ye geçin.
    7. Pelet, yukarı ve aşağı pipetleyerek, 100 mL/L Inklüzyon Gövde Tamponu kültüründe ( Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden askıya alın.
    8. Sonikasyon sırasında, aşırı ısınmayı önlemek için örnekleri buz üzerinde tutun. Her numuneyi 15 s'lik 6 döngü, çıkış 5 ve% 50 darbe için sonikleştirin. Çevrimler arasında soğutma için 15 s dinlenme süresi bekleyin.
      NOT: Gerekirse, daha fazla santrifüjleme için numuneleri 50 mL konik tüplere aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız). 13.000 × g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüj.
    9. Jel analizi için Sonicated MMP'nin bir kısmını bir kenara koyun. -80 °C'de saklayın. Jel analizi yapılmıyorsa, adım 1.3.11'e geçin.
    10. Pelet'i kontrol edin. Dizeliyse, 1.3.8-1.3.10 arasındaki adımları yineleyin. Pelet kompaktsa, süpernatantı atın ve adım 1.3.12'ye geçin.
      NOT: Inklüzyon Vücut Tamponunda Sonikasyon, lize hücre kalıntılarından daha fazla protein geri kazanmak için tekrarlanabilir. Bununla birlikte, çok fazla sonikasyon, MMP verimine zarar veren kesmeye neden olabilir. Protokol bu aşamada duraklatılabilir ve hücre peletleri -80 ° C'de dondurulabilir ve daha sonra çözülebilir.
    11. Pipetleme yoluyla her bir peleti 1 L'lik bir kültürden 5 mL Çözünürlük Tamponunda ( Malzeme Tablosuna bakınız) yeniden askıya alın. Proteinlerin çözünmesini sağlamak için buz üzerinde en az 30 dakika inkübe edin.
    12. Jel analizi için Çözünür MMP'nin bir kısmını bir kenara koyun. -80 °C'de saklayın. Jel analizi yapılmıyorsa, adım 1.3.14'e geçin.
    13. Hücreleri 13.000 × g ve 4 ° C'DE 10 dakika boyunca santrifüj edin.
    14. Santrifüjlemeden sonra bir pelet oluşursa/kalırsa, süpernatantı ayrı bir 50 mL konik tüpe dökün. Pelet, yukarı ve aşağı pipetleyerek, başka bir 5 mL Çözünürlük Tamponunda (1 L kültür başına) yeniden askıya alın.
    15. 13.000 × g ve 4 ° C'DE 10 dakika boyunca santrifüj. süpernatanı atmayın.
    16. Santrifüjlemeden sonra pelet oluşana veya sadece gri çökelti kalana kadar 1.3.13 ve 1.3.14 adımlarını tekrarlayın. Süpernatantları bir araya getirin. Ek sonikasyon için peleti -80 ° C'de atın veya saklayın.

2. MMP saflaştırma ve yeniden katlama

  1. Onun etiketi (HT) afinite saflaştırma
    1. Üreticinin protokolüne göre, bir yerçekimi akışı sütununu (Malzeme Tablosuna bakınız) iyi karıştırılmış Ni-NTA reçinesi ile doldurun ( Malzeme Tablosuna bakınız). Reçinenin yerleşmesine ve depolama tamponundan ayrılmasına izin verin, böylece iki katman arasında ayrı bir çizgi oluşur.
      NOT: Hava reçineye nüfuz edeceğinden ve protein verimine zarar vereceğinden reçinenin kurumasına asla izin vermeyin. Kullanımlar arasında, bölüm 2.2'de açıklanan reçine rejenerasyon prosedürünü uygulayın.
    2. Depolama arabelleğinin boşalmasına izin verin. Sütunu iki reçine yataklı HT Denge Arabelleği hacmiyle doldurun.
    3. HT Dengeleme Arabelleğini boşaltın ve atın. Kolon boşalırken, protein ekstraktını 1 dakika boyunca 13.000 × g'de santrifüj edin ve 0.22 μm'lik bir filtre kullanarak filtreyle sterilize edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
    4. Atık konteynerini HT Flowthrough etiketli 50 mL'lik konik bir tüp ile değiştirin. Hazırlanan protein ekstraktını kolona ekleyin.
    5. Bağlamayı en üst düzeye çıkarmak için akışı yeniden uygulayın.
    6. Jel analizi için Flowthrough Fraksiyonunun bir kısmını bir kenara koyun. -80 °C'de saklayın. Jel analizi yapılmıyorsa, adım 2.1.7'ye geçin.
    7. Reçineyi derhal 15 mL HT Yıkama Tamponu ile yıkayın (Malzeme Tablosuna bakınız). Akışı HT Yıkama etiketli 15 mL konik tüplerde toplayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: 280 nm'deki (A280) absorbans değerleri spektrofotometri ile elde edilmiş ve protein konsantrasyonlarını tahmin etmek için moleküler ağırlık ve yok olma katsayısı olan ε ile birlikte kullanılmıştır. Denatüre Hisx6-pro-MMP-3cd için moleküler ağırlık 29.86 kDa'dır ve ε 34.38 M-1 cm-1'dir.
    8. HT Yıkama Arabelleğine karşı boşluk bırakarak A280'i ölçün ve kaydedin. 2.1.7 ve 2.1.8 adımlarını ek yıkama fraksiyonlarıyla tekrarlayın. A280 taban çizgisine yaklaştığında ve safsızlıklar en aza indirildiğinde, adım 2.1.9'a geçin.
    9. Jel analizi için Yıkama Fraksiyonunun bir kısmını bir kenara koyun. Birden fazla yıkama fraksiyonu için tekrarlayın. Fraksiyonları -80 °C'de saklayın. Jel analizi yapılmıyorsa, adım 2.1.10'a geçin.
    10. 5 mL HT Elüsyon Tamponu ekleyerek His etiketli proteinleri derhal etkisiz hale getirin (Malzeme Tablosuna bakınız). HT Elüsyon etiketli mikrofüj tüplerinde 0.5-1 mL fraksiyonları olarak akışı toplayın.
    11. Jel analizi için Elüsyon Fraksiyonunun bir kısmını bir kenara koyun. Birden fazla elüsyon fraksiyonu için tekrarlayın. Fraksiyonları -80 °C'de saklayın. Jel analizi yapılmıyorsa, adım 2.1.12'ye geçin.
    12. A280 >0.3 mg/mL ise, fraksiyonu HT Denge Tamponu ile seyreltin (bkz.
      NOT: Salınan fraksiyon, diyaliz sırasında çökelmeyi önlemek için 0.3 mg / mL veya daha az bir A280'e seyreltilmelidir. Protokol burada duraklatılabilir ve havuzlanmış fraksiyonlar -80 ° C'de dondurulabilir ve daha sonra çözülebilir. Aksi takdirde, bu adımı atlayın ve adım 2.2.1'e geçin.
  2. Reçine rejenerasyonu
    1. Reçineyi on reçine yatağı hacmi HT Rejenerasyon Tamponu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve on reçine yatağı hacmi steril su ile yıkayın.
    2. Reçineyi% 50 bulamaç olarak% 20 (v / v) etanol içinde suda saklayın.

3. Protein yeniden katlanması

NOT: Daha küçük hacimler için, diyaliz kasetleri daha düşük numune kaybı riski altında kullanılabilir. Daha büyük hacimler kullanılıyorsa diyaliz borusu gereklidir ( Malzeme Tablosuna bakınız).

  1. Diyaliz
    NOT: Diyaliz için optimum protein konsantrasyonu ~ 0.3 mg / mL'dir. Diyaliz sırasında önemli yağış meydana gelirse, kademeli diyaliz yöntemi kullanarak her diyaliz arasındaki üre konsantrasyon gradyanını azaltın ve daha fazla ara adım ekleyin (örneğin, 5 M aşamasını atlamak yerine 6 M'den 5 M'ye ve ardından 5 M'den 4 M'ye). Donma-çözülme döngüleri hücresel ve protein yapısına zarar verdiğinden, protokoldeki duraklamaları en aza indirmek hayati önem taşır.
    1. Üreticinin protokolüne göre, Elüsyon Fraksiyonu örneklerinin hacmine göre uygun miktarda diyaliz tüpü kullanın.
    2. Salınımlı MMP fraksiyonlarını diyaliz borusuna 1 L Diyaliz Tamponu 1'e batırın (Malzeme Tablosuna bakınız). Boruyu ve içeriğini manyetik bir karıştırıcı üzerinde 4 ° C'de en az 8 saat boyunca karıştırın.
    3. 1 l diyaliz tamponu 2'ye aktarın ( malzeme tablosuna bakınız). Boruyu ve içeriğini manyetik bir karıştırıcı üzerinde 4 ° C'de en az 8 saat boyunca karıştırın.
    4. 1 l diyaliz tamponu 3'e aktarın ( malzeme tablosuna bakınız). Boruyu ve içeriğini manyetik bir karıştırıcı üzerinde 4 ° C'de en az 8 saat boyunca karıştırın.
    5. Numuneyi yeni 50 mL konik tüplere aktarın ve bunları Diyalize MMP olarak etiketleyin.
    6. Tüpü herhangi bir çökelti için inceleyin. Çökelti oluşmuşsa, numuneyi 13.000 × g ve 4 ° C'de 1 dakika boyunca santrifüj edin.
    7. Süpernatantı yeni 15 mL konik tüplere aktarın ve bunları Yeniden Katlanmış MMP olarak etiketleyin.
    8. Jel analizi için bir kesir ayırın ve Yeniden Katlanmış MMP olarak etiketleyin. -80 °C'de saklayın. Jel analizi yapılmıyorsa, adım 3.1.9'a geçin.
      NOT: Verim düşükse, çökelti HT Denge Tamponunda çözülebilir ve bölüm 3.1'deki adımlar diyaliz borusu ile tekrarlanabilir. Jel analizi yapılmayacaksa veya protokol burada duraklatılacaksa, numuneleri -80 ° C'de dondurun ve daha sonra çözün. Verim istenen aralıktaysa, adım 3.2.1'e geçin.
  2. Yeniden konsantrasyon
    NOT: Yeniden katlanmış ve denatüre edilmiş Hisx6-pro-MMP-3cd için yok olma katsayılarının aynı olması beklenmektedir; Bu nedenle, A280 hesaplamaları etkilenmez.
    1. Numuneyi 0,5 mg/mL'ye kadar yeniden konsantre edin. Numuneyi 15 mL'ye konsantre etmek için 400 mL'lik bir karıştırılmış hücre kullanın (Malzeme Tablosuna bakın). Köpüklenmeyi önlemek için, gerekirse daha fazla konsantre olmak için 50 mL'lik bir yeniden konsantrasyon tüpü kullanın.
      NOT: Bir çökelti oluşursa, HT Denge Tamponunda peletlenebilir ve çözülebilir. Ardından, bölüm 3.1 ve adım 3.2.1'i yineleyin. Aksi takdirde, adım 3.2.2'ye geçin.
    2. Jel analizi için bir kesir ayırın ve Konsantre MMP olarak etiketleyin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler -80 °C'de dondurulabilir ve daha sonra çözülebilir.

4. Etkinleştirme

  1. 4-Aminofenilmerkürik asetat (APMA) aktivasyonu
    NOT: APMA oldukça toksiktir. Etkinleştirmeden önce 20 mM APMA'lık yeni bir stok çözümü yapın ve APMA kullanırken daima bir duman başlığı altında çalışın. APMA atıklarını kabına atın.
    1. 1 mL MMP aliquot (1 mg / mL) başına, 1 mM'lik son APMA konsantrasyonuna ulaşmak için 50 μL 20 mM APMA ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. Bir çökelti oluşursa, 4 ° C'de 10 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj yapın. Süpernatantı Aktif MMP etiketli 1,5 mL'lik bir mikrofüj tüpünde saklayın. Çökeltiyi APMA atıkları için işaretlenmiş bir kaba atın.
    3. Jel analizi için bir kesir ayırın ve Aktif MMP olarak etiketleyin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler -80 °C'de dondurulabilir ve daha sonra çözülebilir. Jel analizi yapılmıyorsa, adım 4.2.1'e geçin. Aktivasyondan sonra, MMP-3cd'nin moleküler ağırlığı ve yok olma katsayısı sırasıyla 19.40 kDa ve 28.42 M-1 cm-1'dir.
  2. Tuzdan arındırma
    1. APMA'yı etkinleştirilen MMP-3cd numunesinden, üreticinin protokolünü izleyerek 2 mL'lik bir tuz giderme sütunuyla çıkarın (Malzeme Tablosuna bakın).
    2. Jel analizi için bir kesir ayırın ve Tuzdan Arındırılmış MMP olarak etiketleyin. -80 °C'de saklayın. Jel analizi yapılmıyorsa, kalan numunelerle birlikte bölüm 4.3'e geçin.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler -80 °C'de dondurulabilir ve daha sonra çözülebilir.
  3. SDS-PAGE jellerinin çalıştırılması
    1. Tüm protein fraksiyonlarını SDS-PAGE jellerinde çalıştırın: İndüklenmemiş Fraksiyon, İndüklenmiş Fraksiyon, Lizlenmiş MMP, Sonicated MMP, Çözünürleştirilmiş MMP, Akış Fraksiyonu, Yıkama Fraksiyonu, Elüsyon Fraksiyonu, Yeniden Katlanmış MMP, Konsantre MMP, Aktif MMP ve Tuzdan Arındırılmış MMP.
  4. MMP-3'ün uzun süreli depolanması
    1. Tuzdan arındırılmış MMP-3cd numunelerine %0,05 (v/v) iyonik olmayan yüzey aktif madde ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları -80 °C'de saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SDS-PAGE'de numuneler çalıştırılırken, protein çözünmez inklüzyon cisimleri şeklinde ifade edildiğinden, lize ve sonikasyonlu fraksiyonlar, protein henüz üre içinde çözünmediğinden, Hisx6-pro-MMP-3cd ekstraktını çok az içermeli veya hiç içermemelidir. Şekil 3 , BL21 (DE3) hücrelerinden ve R2DP hücrelerinden Hisx6-pro-MMP-3cd'nin His-tag saflaştırma elüsyon fraksiyonlarını karşılaştırmaktadır. Elüsyon fraksiyonları, diyalizden önce hem BL21 (DE3) hem de R2DP hücreleri için ayrı ayrı toplandı....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çözünür, insan, rekombinant MMP'lerin büyük ölçekli üretimi zorlu bir görev olmaya devam etmektedir. Memeli hücreleri, fonksiyonel MMP'leri yüksek maliyetlerle ve uzun bekleme süreleriyle ifade edebilirken, E. coli hızla saflaştırılması ve yeniden katlanması gereken yüksek miktarda MMP inklüzyon cismi üretir11,16. R2DP hücreleri, MMP inklüzyon gövdelerinin verimini önemli ölçüde artırarak daha uygun maliyetli ve üretken bir MMP yeniden katlama işlemi sağ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Jacksonville, Florida'daki Mayo Clinic'teki Dr. Evette Radisky ve Alexandra Hockla'ya, Hisx6pro-MMP-3cd genini klonlamak için şablon olarak pET-3a-pro-MMP-3cd plazmidini sağladıkları için ve yorumlarına ve DNA dizilimi için Nevada Üniversitesi, Reno'daki Nevada Genomik Merkezi'nden Dr. Paul Hartley ile birlikte teşekkür etmek istiyorlar. Yazarlar ayrıca Cassandra Hergenrader'e protein ekspresyonunun bir kısmına yardımcı olduğu için teşekkür etmek istiyorlar. M.R.-S. NIH-P20 GM103650-COBRE Bütünleştirici Sinirbilim hibesine ve UNR Ar-Ge mICRO SEED Hibe Ödülü'ne teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 ve mikro; m steril filtreSigma AldrichSLGP033RSSaflaştırmadan önce protein ekstraktından bazı kirleticileri uzaklaştırmak ve Ni-NTA kolonunun tıkanmasını önlemek için kullanılır
1 L Erlenmeyer şişeleriThermo Fisher ScientificS76106Fn/a
1 L cam şişelerThermo Fisher Scientific06-414-1Dn/a
1.5 mL mikrofüj tüpleriThermo Fisher Scientific02-682-002Yok
15 mL konik tüplerThermo Fisher Scientific339650n/a
18 G, 1 inç eğimli iğneAmazonB07S7VBHM2Diyaliz kaseti ile birlikte kullanılır
2 mL tuz giderme kolonuThermo Fisher Scientific89890Aktivasyonu takiben APMA'yı kaldırır
2- (N-Morfolino) etansülfonik asit (MES)Thermo Fisher ScientificAAA1610422yok
250 mL konik şişe yastıklarıThermo Fisher Scientific05-538-53ABüyük hacimli santrifüjleme sırasında konik şişeleri stabilize edin
250 mL konik şişelerThermo Fisher Scientific05-538-53n/a
400 mL karıştırılmış hücreSigma AldrichUFSC40001Santrifüj filtre ünitesinden çok daha büyük bir hacmi yeniden konsantre eder. Rosetta2(DE3)pLysS hücreleri, santrifüj filtre ünitesinin 15 mL sınırını aşabilen yüksek hacimlerde protein üretir
4-aminofenilmerkürik asetat (APMA)Sigma AldrichA9563-5Gparçalayarak MMP-3'ü aktive eder
Thermo Fisher ScientificNC0829167Diyaliz kaseti 50
mL konik tüplerleThermo Fisher Scientific339650Birçok saflaştırma adımında depolama için kullanılır
50 mL yeniden konsantrasyon tüpüSigma AldrichUFC901024DDiyalizden sonra protein örneklerini yeniden konsantre etmek veya kirleticileri uzaklaştırmak için kullanılır
AgarThermo Fisher ScientificBP1423-500Soğutulduktan sonra otoklavlanmış LB ortamını katılaştıran tampon bileşen
AmpisilinThermo Fisher ScientificBP1760-25pET3a vektörü ile birlikte kullanılan antibiyotik; 100 & de kullanılır; LB ortamında g/mL
BamHINEBR3136SpET3a vektörü ile kullanılacak kısıtlama enzimi
Kalsiyum klorür (CaCl2)Thermo Fisher Scientific600-30-23Kalsiyum iyonu MMP yapısını stabilize eder
Hücre yayıcılarThermo Fisher Scientific50-189-7544Dönüşümden
sonra hücreleri bir petri kabına yaymak için kullanılabilirKloramfenikolThermo Fisher Scientific22-055-125GMpET3a vektörü ile kullanılan antibiyotik; 34 & mikro'da kullanılır; LB ortamında g / mL
Diyaliz Tamponu 1n / an / a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl < sub > 2 < / sub >, 1 & mikro; M ZnCl2, 4 m üre.
Diyaliz Tamponu 2n/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 & M ZnCl2, 2 m üre.
Diyaliz Tamponu 3n/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 1 ve mikro; M ZnCl2.
Diyaliz klipsleriThermo Fisher Scientific68011Yılan derisi diyaliz tüpü ile birlikte kullanılır
Diyaliz tüpüThermo Fisher Scientific88243Çok daha büyük numune hacimlerini tutan, ancak numune kaybı riski daha yüksek olan alternatif diyaliz yöntemi
Digest tamponuNEBB7204SpET3a vektörünün sindirilmesinde kullanılan tampon
Tek kullanımlık küvetlerThermo Fisher Scientific21-200-257Büyüme ve ekspresyon sırasında bakteri kültürü OD'sini ölçmek için kullanılır
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificD107125GHerhangi bir disülfid bağını azaltarak protein denatürasyonuna yardımcı olur
DNA montaj karışımıNEBE2621SHisx6-pro-MMP-3cd PCR ürününü ve sindirilmiş pET3a vektörünü bağlamak için kullanılır
DNaz INEBM0303SDaha sonra protein saflaştırmasını etkileyebilecek olumsuz DNA kirleticilerini parçalamak için endonükleaz
EtanolThermo Fisher ScientificA995-4n/a
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)Thermo Fisher ScientificJ15694-AEDenatürasyonda kullanılır. Oksidasyonu ve ardından disülfür bağlarının oluşumunu önler
Jel geri kazanım kitiPromegaA9281Agaroz jellerinden DNA'yı izole eder ve saflaştırır
GliserolThermo Fisher ScientificG33-500-80 ° C'de dondurulan gliserol stokları yapmak için kullanılır; C
Yerçekimi akış sütunuBioRad7321010Rekombinant olarak His etiketli proteinlerin Ni-NTA saflaştırılması için kullanılır
Yüksek dönüşüm verimli hücrelerNEBC2987N-terminal His-tag'ı pET3a-pro-MMP-3cd yapısına klonlamak için daha fazla başarı şansına sahip yüksek dönüşüm verimli hücreler
HT Elüsyon Tamponun/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M üre, 250 mM imidazol. pH'ı 7.4
HT Dengeleme Tamponun/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M üre olarak ayarlayın. pH'ı 7,4
HT rejenerasyon tamponun/an/a20 mM MES, 0,1 M NaCl'ye ayarlayın. PH'ı 5.0
HT Yıkama Tamponun/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 6 M üre, 25 mM imidazole ayarlayın. pH'ı 7.4'e ayarlayın
Hidroklorik asit (HCl)Thermo Fisher ScientificA144C-212pH tamponları için kullanılır
İmidazolThermo Fisher ScientificAAA1022122Histidin yan grubunu taklit eder. Spesifik olarak bağlanmayan proteinleri his etiketli hedef proteinden ayırmak için kullanılır
İnklüzyon Vücut Tamponun/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 5 mM DTT, %2 v/v Triton X 100, 0.5 M Üre. pH'ı 8.0'a ayarlayın
İzopropil-ß-D-tiyokalaktopiranosid (IPTG)Thermo Fisher ScientificFERR0392pET3a'da hedef gen ekspresyonunu indükleyen bir reaktif. 0,5 mL 1 M alikot yapın, süzün, sterilize edin ve -20 ° C'de saklayın; C
LB Amp CamR ortamın/an/a Steril1 L şişeye veya 1 L şişeye dökülmelidir. 1 L için 25 g LB Et Suyu ekleyin. Otoklavlama ile sterilize edin. 50 ° C'nin altına soğuduktan sonra; C, 100 & mikroya ampisilin ekleyin; g / mL ve kloramfenikol 34 & mikro; g/mL
LB Amp CamR plakalarn/an/a Sterilpetri kaplarına dökülmelidir. Petri kabı kapağı tamamen kaplanana kadar dökün. 1 L ortam 40-60 tabak verir. 1 L için: 25 g LB Et suyu, 16 g Agar. Otoklavlama ile sterilize edin. 50 ° C'nin altına soğuduktan sonra; C, 100 & mikroya ampisilin ekleyin; g / mL ve kloramfenikol 34 & mikro; g / mL
LB Et SuyuThermo Fisher ScientificBP1426-2Tripton, maya özü ve sodyum klorür ile önceden karıştırılmış
Lizis Tamponun / an / a 50mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.133 g / mL lizozim,% 0.49 v / v Triton X-100. PH'ı 8.0'a ayarlayın
LizozimMP Biyomedikal195303Protein ekstraksiyonunda kullanılır. Bakteri hücre duvarlarını parçalayan enzim
Miniprep kitiPromegaA1330Başarılı olursa, pET3a vektörü Ni-NTA reçinesi ile kullanılacak transformantlardan pET3a-pro-MMP-3cd yapısını
çıkarır NdeINEBR0111SRestriksiyon enzimi
Thermo Fisher ScientificPI88221Rekombinant his etiketli proteinleri bağlamak için kullanılır. Bu güçlü etkileşim, MMP agregasyonunu önlemek için daha yüksek konsantrasyonlarda imidazol
Noniyonik yüzey aktif maddeThermo Fisher ScientificPI28316Depolama deterjanı ile değiştirilebilir. Katalitik aktiviteyi bozmadan, MMP yüzeyindeki hidrofobik kalıntılar ile su molekülleri arasındaki etkileşimleri en aza indirir.
PCR karışımıNEBM0492S,pET3a-pro-MMP-3cd vektörüne bir N-terminal his-etiketi yerleştirmek için bir PCR reaktifi
pET plazmidAddgenen/apET3a vektörü, ampisilin direnci, bir hedef genin indüklenebilir ekspresyonu ve T7 primerleri ile dizileme sunar
Petri kaplarıVWR25384-342LB agar ortamı
R2DP hücreleriNovagenüzerindeki transformatörleri kaplamak için kullanılır714033Ökaryotik proteinlerin gelişmiş ekspresyonuna sahip BL21 türevleri. E. coli'de nadir bulunan kodonların tRNA'larını içerir
SOC büyüme ortamıNEBB9020SDönüşüm sırasında hızlı büyüme için seçici olmayan büyüme ortamı
Sodyum klorür (NaCl)Thermo Fisher ScientificBP358-1Tamponlarda kullanılır ve protein stabilitesine yardımcı olur
Sodyum deoksikolatThermo Fisher ScientificPI89905Protein ekstraksiyonunda kullanılan deterjan. Lyses hücre duvarları
Çözündürme Tamponun/an/a20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM NaCl, 10 mM DTT, 6 M Üre. PH'ı 8.0
Tris bazınaThermo Fisher ScientificBP152-1Fizyolojik pH aralığında kullanılan ortak tampon.
Hücre lizizi için kullanılanTriton X-100Thermo Fisher ScientificM1122980101
ÜreThermo Fisher ScientificAAJ75826A7Protein ikincil yapısını bozmak için ilk kaotropik ajan
Çinko klorür (ZnCl2< / sub>)Thermo Fisher ScientificAAA162810EMMP yapısını stabilize eder. Çinko iyonu, MMP-3'ün katalitik bölgesinde bulunur
, propeptid 5 mL şırıngayı birlikte kullanılır : ayarlayın sıcaklığa duyarlı Deterjan

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Portolano, N., et al. Recombinant protein expression for structural biology in HEK 293F suspension cells: A novel and accessible approach. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51897(2014).
  2. Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (106), e53568(2015).
  3. Nilvebrant, J., Alm, T., Hober, S. Orthogonal protein purification facilitated by a small bispecific affinity tag. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3370(2012).
  4. Yang, Z., et al. Highly efficient production of soluble proteins from insoluble inclusion bodies by a two-step-denaturing and refolding method. PLoS One. 6 (7), 22981(2011).
  5. Hu, X., Beeton, C. Detection of functional matrix metalloproteinases by zymography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (45), e2445(2010).
  6. Radisky, E. S., Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Radisky, D. C. Therapeutic potential of matrix metalloproteinase inhibition in breast cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 118 (11), 3531-3548 (2017).
  7. Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., Do, L. D., Hritz, B. G. Metalloproteinases and their inhibitors: Potential for the development of new therapeutics. Cells. 9 (5), 1313(2020).
  8. Nagase, H., Visse, R., Murphy, G. Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular Research. 69 (3), 562-573 (2006).
  9. Raeeszadeh-Sarmazdeh, M., et al. Directed evolution of the metalloproteinase inhibitor TIMP-1 reveals that its N- and C-terminal domains cooperate in matrix metalloproteinase recognition. Journal of Biological Chemistry. 294 (24), 9476-9488 (2019).
  10. Batra, J., et al. Matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) interaction with tissue inhibitors of metalloproteinases TIMP-1 and TIMP-2. Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15935-15946 (2012).
  11. Singh, K. K., Jain, R., Ramanan, H., Saini, D. K. Expression and purification of matrix metalloproteinases in Escherichia coli. Matrix Metalloproteases. Galea, C. A. , Humana Press. New York, NY. 3-16 (2017).
  12. Manka, S. W., et al. Structural insights into triple-helical collagen cleavage by matrix metalloproteinase 1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12461-12466 (2012).
  13. Gomis-Ruth, F. X., et al. Mechanism of inhibition of the human matrix metalloproteinase stromelysin-1 by TIMP-1. Nature. 389 (6646), 77-81 (1997).
  14. Shirian, J., et al. Converting a broad matrix metalloproteinase family inhibitor into a specific inhibitor of MMP-9 and MMP-14. FEBS Letters. 592 (7), 1122-1134 (2018).
  15. Li, C., et al. Purification of recombinant histidine-tagged catalytic domain of MMP-13 in one step using affinity column and renaturation of it with histidine tag. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 37 (15), 2118-2130 (2014).
  16. Aydin, H., Azimi, F. C., Cook, J. D., Lee, J. E. A convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4041(2012).
  17. McNiff, M. L., Haynes, E. P., Dixit, N., Gao, F. P., Laurence, J. S. Thioredoxin fusion construct enables high-yield production of soluble, active matrix metalloproteinase-8 (MMP-8) in Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 122, 64-71 (2016).
  18. Maity, R., et al. GST-His purification: A two-step affinity purification protocol yielding full-length purified proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50320(2013).
  19. Stefan, A., Ceccarelli, A., Conte, E., Montón Silva, A., Hochkoeppler, A. The multifaceted benefits of protein co-expression in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52431(2015).
  20. Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa based cell free expression systems for expression of Plasmodium rhoptry proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (100), e52772(2015).
  21. Zeytuni, N., Zarivach, R. Purification of the M. magneticum strain AMB-1 magnetosome associated protein MamAΔ41. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (37), e1844(2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Rekombinant Protein Safla t rmasE coli Ekspresyonunkl zyon Cismi Yeniden KatlanmasHis Etiket Safla t rmasProtein DiyaliziSDS PAGE AnaliziR2DP H creleri

İlgili makaleler