Tutarlı Raman Saçılma Görüntüleme Kullanarak Ciltteki Farmasötik Bileşiklerin Görselleştirilmesi ve Ölçülmesi

Özet

Cilt içindeki farmasötik bileşikleri görselleştirmek ve ölçmek için tutarlı bir Raman saçılma görüntüleme metodolojisi açıklanmaktadır. Bu yazıda deri dokusu hazırlığı (insan ve fare) ve topikal formülasyon uygulaması, uzaysal zamansal konsantrasyon profillerini ölçmek için görüntü elde etme ve topikal ilaç dağıtımını değerlendirmek için ön farmakokinetik analiz açıklanmaktadır.

Özet

Topikal formülasyon uygulamasından sonra kutanöz farmakokinetiği (cPK), düzenleyici ve ilaç geliştirme bilim adamlarının topikal biyoyararlanımı (BA) mekanik olarak anlamaları için özel bir ilgi alanı olmuştur. Bant sıyırma, dermal mikrodiyaliz veya dermal açık akışlı mikroperfüzyon gibi yarı invaziv tekniklerin tümü makro ölçekli cPK'yi ölçer. Bu teknikler geniş cPK bilgisi sağlamış olsa da, topluluk aktif farmasötik bileşen (API) penetrasyonu ve hücresel düzeyde geçirgenlik konusunda mekanik bir anlayıştan yoksundur.

Mikro ölçekli cPK'yi ele almak için invaziv olmayan bir yaklaşım, dışsal etiketlere veya kimyasal modifikasyona gerek kalmadan içsel moleküler titreşimleri seçici olarak hedefleyen tutarlı Raman saçılma görüntülemesidir (CRI). CRI, API'lerin veya aktif olmayan bileşenlerin hassas ve seçici bir şekilde ölçülmesini sağlayan iki ana yönteme sahiptir - tutarlı anti-Stokes Raman saçılması (CARS) ve uyarılmış Raman saçılması (SRS). CARS tipik olarak yapısal cilt bilgilerini türetmek veya kimyasal kontrastı görselleştirmek için kullanılır. Buna karşılık, moleküler konsantrasyonla doğrusal olan SRS sinyali, cilt tabakalaşmalarındaki API'leri veya aktif olmayan bileşenleri ölçmek için kullanılır.

CRI ile cPK için fare dokusu yaygın olarak kullanılmasına rağmen, topikal BA ve biyoeşdeğerlik (BE), düzenleyici onaydan önce insan dokusunda değerlendirilmelidir. Bu yazıda topikal BA ve BE'nin değerlendirilmesinde kantitatif farmakokinetik KRİ çalışmalarında kullanılacak ex vivo deri hazırlama ve görüntüleme metodolojisi sunulmaktadır. Bu metodoloji, zaman içinde insan ve fare derisinde güvenilir ve tekrarlanabilir API ölçümü sağlar. Lipid bakımından zengin ve lipid bakımından fakir bölmelerdeki konsantrasyonlar ve zaman içindeki toplam API konsantrasyonu ölçülür; bunlar mikro ve makro ölçekli BA ve potansiyel olarak BE tahminleri için kullanılır.

Giriş

Topikal ilaç ürünü uygulamasından sonra cPK'yi değerlendirmek için kullanılan metodolojiler, klasik in vitro permeasyon testi (IVPT) çalışmaları 1,2,3,4,5 ve bant sıyırma 6,7,8'den açık akışlı mikroperfüzyon veya dermal mikrodiyaliz ^9,10,11 gibi ek metodolojilere genişlemiştir^{. 12,1....}

Protokol

Çıplak fare kulak dokusunun kullanımı Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanırken, insan derisi dokusunun kullanımı Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır. IACUC protokollerine göre, taze ötenazi fareleri, çıplak fare kolonileri olan işbirlikçilerden elde edildi. İnsan dokusu, onaylanmış bir protokol aracılığıyla Massachusetts Genel Hastanesi'ndeki elektif abdominoplasti prosedürlerinden temin edildi. Ek olarak, karın derisi dışındaki spesifik doku tipleri, IRB onaylı bir protokol aracılığıyla bir vücut bağış otoritesi aracılığıyla edinildi.

Sonuçlar

Deneyin tamamlanmasından sonra doku eksenel (<10 μm) veya lateral yönde anlamlı bir şekilde hareket etmemişse görüntüleme başarılı kabul edilir (Şekil 4). Bu, ilgilenilen API için SRS ölçümünün, nicelemenin katmana özgü olduğu başlangıç derinliğini temsil etmediğinin hemen bir göstergesidir. Bu, ilgilenilen her XY pozisyonu için z-yığınlarının görüntülenmesiyle hafifletilir ve takas zamansal çözünürlüktür. Bu çalışmalarda donmuş cilt kullanılıyorsa, API'nin penetrasyonu ve geçirgenliği ta.......

Tartışma

Topikal BA / BE'nin değerlendirilmesi, tek bir yöntemin in vivo cPK'yi tam olarak karakterize edemeyeceği için çok yönlü bir yaklaşım gerektiren bir araştırma alanıdır. Bu protokol, tutarlı Raman görüntülemesine dayanan topikal bir ilaç ürününün BA / BE'sinin değerlendirilmesi için bir metodoloji sunmaktadır. Göz ardı edilebilecek ilk noktalardan biri, özellikle kantitatif iletim SRS görüntüleme için cilt örneklerinin ne kadar ince olması gerektiğidir. Cilt çok kalınsa (yani, ışık kolayca geçemiyorsa), .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Doku Hazırlama
Otoklavlanabilir Biyolojik Tehlike Torbaları	FisherBrand	22-044562	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: biyolojik tehlike çantaları https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-polyethylene-biohazard-autoclave-bags-without-sterilization-indicator-8/22044562?searchHijack=true&searchTerm= 22044562& searchType=HIZLI& matchedCatNo=22044562
Hücre Kültürü Tamponları: Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuz Çözeltisi 1x	Corning	MT21030CV	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: PBS https://www.fishersci.com/shop/products/corning-cellgro-cell-culture-buffers-dulbecco-s-phosphate-buffered-salt-solution-1x-8/MT21030CV?searchHijack=true&searchTerm= 21-030-cv& searchType= HIZLI& matchedCatNo=21-030-cv
Tek Kullanımlık Neşterler	Exel International	14-840-00	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: neşter https://www.fishersci.com/shop/products/exel-international-disposable-scalpels-3/1484000?keyword=true
Yüksek Hassasiyet 45&derece; Açılı Geniş Uçlu Cımbız/Forseps	Fisherbrand	12-000-132	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: forseps https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-45-angle-broad-point-tweezers-forceps/12000132#?keyword=
Kimwipes Hassas Görev Silecekleri, 1 Katlı	Kimberly-Clark Professional Kimtech Science	06-666	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: görev sileceği https://www.fishersci.com/shop/products/kimberly-clark-kimtech-science-kimwipes-delicate-task-wipers-7/06666
Parafilm M Laboratuvar Sarma Filmi	Bemis	13-374-12	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: parafilm https://www.fishersci.com/shop/products/curwood-parafilm-m-laboratory-wrapping-film-4/1337412
Petri Kabı (35 mm x 10 mm)	Fisherbrand	FB0875711YZ	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: küçük petri kabı https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-specialty-6/FB0875711YZ?keyword=true
Petri Kabı (60 mm x 15 mm)	Fisherbrand	FB0875713A	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: büyük petri kabı https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/FB0875713A?keyword=true
Cerrahi Makas	Roboz	NC9411473	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: makas https://www.fishersci.com/shop/products/scissors-327/NC9411473?searchHijack=true&searchTerm= RS-5915SC& searchType=HIZLI& matchedCatNo=RS-5915SC
güçlü>Lazer/mikroskop
650/60 nm BrightLine tek bantlı bant geçiren filtre	Semrock		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: CARS filtresi - CH2 titreşimleri (645nm/60nm filtre)
Kontrol kutusu IX2-UCB	Olympus		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: Kontrol Kutusu
D700/30m	Chroma		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: CARS filtresi - döteryumlu bant https://www.chroma.com/products/parts/d700-30m
DeepSee Insight	Spectra-Physics		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: Lazer https://www.spectra-physics.com/f/insight-x3-tunable-laser
Dijital El Tipi Optik Güç ve Enerji Ölçer Konsolu	ThorLabs	PM100D	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: güç ölçer https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Fluoview Yazılımı	Olympus		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: Mikroskop Kontrol yazılımı
Buzlu Mikroskop Slaytları	FisherBrand		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: mikroskop slaytları https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/22265446
FV1000	Olympus		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: Mikroskop
Kuluçka Odası	Tokai Hit	GM-800	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: kuluçka odası
Entegre Küre Fotodiyot Güç Sensörü	ThorLabs	S142C	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: fotodiyot https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=3341
Güç kaynağı FV31-PSU	Olympus		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: Güç Kaynağı
Hassasiyeti 4063, 80MHz Çift Kanallı Fonksiyon Jeneratörü	BK Hassasiyeti Metinde		atıfta bulunulduğu gibi: fonksiyon üreteci
ProScan – Hassas Mikroskop Otomasyonu	Önceki Bilimsel Aletler Metinde		atıfta bulunulduğu gibi: sahne kontrolörü https://www.prior.com/microscope-automation/inverted-microscope-systems/proscan-linear-stage-highest-precision-microscope-automation
SecureSeal Görüntüleme Ara Parçaları	Grace Biolabs	654004	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: spacer https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654004/
SRS Algılama Kiti	APE		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: SRS dedektörü
UPLSAPO 20X NA:0.75	Olympus		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: 20X Objective
> https://www.olympus-lifescience.com/en/objectives/uplsapo/Lipid/Drug Imaging
35 mm Çanak, No. 0 Kaplamasız Lamel, 14 mm Cam Çapı	MatTek Corporation	NC9711297	Metinde atıfta bulunulduğu gibi: Cam alt tabak https://www.fishersci.com/shop/products/glass-bottom-mircrowell-dish/nc9711297
Pamuk uçlu aplikatörler	FisherBrand		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: Pamuk uçlu aplikatör
Distriman Pozitif Deplasmanlı Pipet	Gilson		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: Pozitif Yer Değiştirmeli Pipet https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distriman-positive-displacement-repetitive-pipette/F164001G#?keyword=
Distriman Pozitif Yer Değiştirmeli Pipet Uçları	Gilson		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: pipet https://www.fishersci.com/shop/products/gilson-distritip-syringes-6/f164100g?keyword=true
Data Analysis
FIJI	Açık Kaynak		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: FIJI/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/
Jupyter-Lab	açık kaynak		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: JupyterLab https://jupyter.org/
Rstudio	Açık kaynak		Metinde atıfta bulunulduğu gibi: Rstudio https://www.rstudio.com/

<