Yetişkin Anofeller gambiae Sivrisineklerine Etkili Oral RNA İnferferi (RNAi) Uygulaması

Birçok hastalık sivrisinekler tarafından bulaşır, bu da sivrisinek fizyolojisi ve genetiğinin incelenmesini önemli bir girişim haline getirir. RNAi'nin bu organizmalarda kullanımı son 20 yılda öne çıkmış ve birçok sivrisinek geninin 1,2,3,4,5 fonksiyonel karakterizasyonuna izin vermiştir. DsRNA dağıtımı için en yaygın kullanılan teknik, sivrisineklere zarar verebileceği ve önemli zaman ve çaba gerektiren dezavantajları olan mikroenjeksiyon olmuştur. RNAi için oral dağıtım yöntemleri test edilmiştir, ancak esas olarak sivrisineklerin larva aşamasında ^6,7,8,9. Yetişkin sivrisineklerde dsRNA'nın oral yoldan verilmesi tam olarak araştırılmamıştır ve vektör biyolojisi ve vektör kontrolünün incelenmesi için yararlı bir araç olabilir.

Sıtma, enfekte bir dişi sivrisinek enfekte olmamış bir konakçıdan kan unu aldığında ve sıtma parazitleri içeren tükürük enjekte ettiğinde Anopheles sivrisinekleri tarafından bulaşır10. Nihayetinde bir sivrisinek tükürüğünde bulaşması için, parazit sivrisinek bağışıklık sisteminden kaçma, midgut bariyerinin geçişi ve tükürük bezlerinin istilası da dahil olmak üzere birçok engelin üstesinden gelmelidir¹¹. Sivrisinek tükürük bezi (SG) mimarisi parazit invazyonunun anahtarıdır ve bu mimari hem anahtar tükürük bezi eksprese edilen transkripsiyon faktörleri hem de cinsel dimorfizmin belirleyicileri tarafından kontrol edilir. Tükürük bezlerinin hücresel spesifikasyonu ve homeostatik bakımı ve kan beslenmesinde işlev gören tükürük proteinlerinin üretimi ve sekresyonu için çeşitli yüksek oranda korunmuş transkripsiyon faktörleri gereklidir^12,13,14. Çatal başı (Fkh), böcek SG yapısının ve işlevinin önemli bir düzenleyicisi olarak işlev gören kanatlı bir sarmal transkripsiyon faktörüdür (meyve sinekleri ve ipekböceği güvesi üzerindeki çalışmalara dayanarak)15,16,17,18,19,20. Drosophila SG'lerde Fkh, SG sağkalımını ve tükürük üretimini teşvik etmek için SG'ye özgü bir temel sarmal-döngü-sarmal (bHLH) transkripsiyon faktörü olan Adaçayı ile birlikte işlev görür¹⁹. Drosophila'da tükürük üretiminin önemli, pozitif bir eş düzenleyicisi, salgı yolu genlerinin ekspresyonunu düzenleyen iyi çalışılmış bir lösin fermuar transkripsiyon faktörü olan CrebA'dır^21,22,23. Ayrıca, kadın tükürük bezlerinde, sadece kan beslenmesinde değil, aynı zamanda parazitlerin bu dokuyu istila etme kabiliyetinde de önemli bir rol oynayan güçlü bir morfolojik farklılaşma derecesi vardır²⁴.

Tükürük bezi sağkalımını, yapısını, fizyolojisini ve cinsel dimorfizmini belirlemede rol oynayan genlerin çoğu, karmaşık uzaysal zamansal ekspresyon profillerine sahiptir^25,26,27 ve RNAi'yi indüklemek için dsRNA'nın geleneksel dağıtım yöntemleri^, bu veya diğer dokulardaki bu tür genleri hedeflemede her zaman etkili değildir. Bununla birlikte, larva evresinde dsRNA'nın oral yoldan verilmesi Aedes aegypti ve An. gambiae sivrisinekleri, dsx geninin ^9,28 dişiye özgü formunu susturmak için başarıyla kullanılmıştır. Sivrisinek tükürük bezlerinde dsRNA kullanan önceki çalışmalar, büyük miktarlarda dsRNA'ya ihtiyaç duyulmasına rağmen, susturma etkisinin nispeten uzun süreli (en az 13 gün) olduğunu ^bulmuştur29. Burada, dsx, fkh veya CrebA için diziye özgü dsRNA'yı eksprese eden ısıdan öldürülmüş E. coli suşu HT115'in (DE3) yetişkin dişi sivrisineklerde bu genlerin RNAi susturulmasını indükleme yeteneği test edilmiştir. An. gambiae'de dsRNA kaynaklı gen yıkımının oral yoldan uygulanması, mRNA seviyelerinde belirgin azalmalar ve bu genlerin fonksiyon kaybı ile tutarlı fenotiplerle. Bu nedenle, bu yaklaşım muhtemelen çeşitli tükürük bezi genlerinin işlevini yıkmak için çalışacaktır.

1. DsRNA'nın E. coli ekspresyon vektörüne klonlanması

1. dsRNA'nın ekspresyonu için uygun bir vektöre eklenecek hedef gen dizisini seçin. Aşağıdaki yöntemi kullanarak Vectorbase.org ifade değerlerini alın.
   1. Ana sayfa arama kutusunda ilgilendiğiniz bir geni (örneğin, Tablo 1) arayın.
   2. Ortaya çıkan gen sayfasında, 8. Transkriptomik bölümü.
   3. Listelenen ilgili RNA-seq ve mikroarray gen ekspresyon deneylerini arayın.
   4. İlgilenilen değerleri elektronik tablo yazılımına aktarın ve bir veri tablosu oluşturun.
2. Kullanılacak en az bir T7 promotörü ile piyasada satılan bir plazmid seçin. Seçilen plazmidin sadece bir T7 promotörü varsa (çoğu ticari plazmidin yaptığı gibi), ilgilenilen gen için dsDNA'nın amplifikasyonunda kullanılmak üzere ters astara ikinci bir T7 promotörü ekleyin.
   NOT: Hedef genler için dsRNA dizisi, RNAi reaktiflerinin tasarımı için E-RNAi web uygulaması kullanılarak seçilebilir³⁰. Uzun dsRNA (yaklaşık 400 bp) veya kısa saç tokası dsRNA (shRNA), spesifik gen dizilerine dayanarak tasarlanabilir. Bu diziler, klonlamadan önce kimlik doğrulaması için yükseltilmeli ve sıralanmalıdır. Bu çalışmada kullanılan seçilmiş gen bölgeleri, plazmidler ve promotörler Ek Dosya 1'de listelenmiştir.
3. Daha önce ^9,31'de açıklanan basit bir tek adımlı prosedüre göre klonlama yapın. Bu amaçla, PCR ürününü saflaştırın ve doğrusallaştırılmış plazmid DNA'sına bağ yapın. Yetkili E. coli hücrelerinin ısı-şok dönüşümü için ligasyon ürününü kullanın³². Dönüştürülen hücreleri mavi/beyaz tarama yoluyla seçin. T7-primer PCR kullanarak kesici ucun yönünü onaylayın ve M13 astarları kullanarak sırayı onaylayın.
   NOT: Beyaz/mavi taramalar, transformasyon için seçilen plazmid, β-galaktosidazı kodlayan lakZ genini taşıdığında kullanılabilir. Beyaz koloniler lacZ içinde istenen eki içermelidir ve hedef dizi^33'ün varlığını ve yönünü daha da doğrulamak için seçilebilir.
4. Plazmidi ilk dönüşümden arındırın ve daha önce tarif edildiği gibi yetkin E. coli HT115'i (DE3) dönüştürmek için kullanın³⁴. Kesici uçlu plazmidin yetkili E. coli HT115'te (DE3) bulunduğunu doğruladıktan sonra, tek kullanım için gliserol bakteri stokları yapın.
   NOT: Her deneyde kullanılmak üzere uygun bir ilişkili olmayan kontrol dsRNA'sı edinilmeli veya hazırlanmalıdır. Bu durumda, Arabidopsis thaliana'dan ilgisiz gen aintegumenta (karınca) dizisi kullanılır.

2. dsRNA'yı eksprese eden ısıda öldürülen bakterilerin hazırlanması

1. 100 μg / mL ampisilin ve 12.5 μg / mL tetrasiklin içeren 50 mL Luria Broth (LB) içinde plazmidi ifade eden dsRNA'yı içeren E. coli suşu HT115'in (DE3) tek bir bakteri kolonisinden, 12 saat boyunca 37 ° C'de bir platform çalkalayıcıda (180 rpm) bir kültür büyütün.
2. Bakteri kültürünü (1:1000), 100 μg / mL ampisilin ve 12.5 μg / mL tetrasiklin içeren 2x Maya Tripton (2x YT) ortamına seyreltin.
3. 40 μM (son konsantrasyon) izopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ekleyerek dsRNA üretimini indükleyin.
4. Hücreler bir O.D.600 = 0.4'e ulaştığında, yaklaşık 2 saat indüksiyondan sonra, 37 ° C'de 180 rpm'de ajitasyon ile, Taracena ve ark. ⁹ tarafından tanımlandığı gibi ısıda öldürülen bakterilerin konsantre bir süspansiyonunu hazırlayın. Hücreleri santrifüjleme (4000 x g, 4 °C, 10 dakika) ile pelet edin ve hücreleri bir hacim sodyum fosfat tamponunda (PBS) yıkayın.
5. Aynı koşullar altında tekrar döndürün, PBS'de başlangıç hacminin 1 / 100'üne kadar tekrar askıya alın ve 1 saat boyunca 70 ° C'ye yerleştirin.
6. Isı ile öldürülen bakterilerin 400 μL alikotunu yapın ve bu alikotları daha fazla kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın (bir haftadan fazla saklamayın). Isı ile öldürülen bakterilerin bu süspansiyonu, RNAi deneyleri için spesifik dsRNA'yı içerir. Bu prosedürü hem hedef gen dsRNA-bakterileri hem de her deneyde kullanılacak ilişkisiz dsRNA-kontrolü için uygulayın.

3. Sivrisinekleri dsRNA'yı eksprese eden ısıdan öldürülmüş bakterilerle beslemek

1. Bir dsRNA aliquotunu (HT115 (DE3) bakteri süspansiyonu) defrost edin ve% 0.2 metilparaben içeren 1.6 mL% 12 şeker çözeltisi ile karıştırın.
2. Bu çözeltiye küçük bir pamuk topu batırın ve ıslatılmış pamuk topunu 5 günlük sivrisinekler içeren bir kafesin içine yerleştirin. Sivrisineklerin bu çözelti ile beslendiğinden emin olun, hem şekeri hem de dsRNA içeren bakterileri aynı anda toplayın.
3. dsRNA-şeker çözeltisine batırılmış pamuk topunu art arda 8 gün boyunca her gün değiştirin.
4. Sivrisinek kafeslerini sabit koşullar altında, yani 27 °C ve% 80 bağıl nemde, 12 saat ışıkta fotoperiyotta tutun: karanlık fotosiklus, 30 dakikalık şafak ve 30 dakikalık alacakaranlık periyodu ile ayrılmış.

4. Hedef gen ekspresyon seviyelerini test edin

1. Kabı bir dakika boyunca veya sivrisinekler hareket etmeyi bırakana kadar buz üzerine yerleştirerek sivrisinekleri soğuk anestezi altına alın. Sivrisinekler anestezi uygulandıktan sonra, diseksiyon için dişileri izole etmek için onları soğuk bir yüzeye yerleştirin.
2. Sivrisineklere% 70 etanol püskürtün ve PBS ile cam bir yüzeye yerleştirin. Bir çift forseps ile, sivrisinek kafasını sabit bir şekilde sabitleyin ve göğüs kafesini çok yavaş çekin, tükürük bezlerinin PBS'ye salınmasına izin verin.
3. Tükürük bezlerini, 10 kişi diseke edilene kadar buz gibi soğuk PBS'de tutun. Guanidinyum tiyosiyanat-fenol-kloroform yöntemini kullanarak RNA ekstraksiyonu için Havuz On SG'ler. RNA peletini 30 μL RNaz içermeyen suda askıya alın.
4. 260 ve 280 nm'de absorbansı okumak ve seyreltme faktörü ile çarparak her numunenin RNA konsantrasyonunu hesaplamak için önceki adımda SG'den ekstrakte edilen RNA'nın 1 μL aliquot'unu kullanın. ~2.0'lık bir 260/280 oranı, iyi kalitede RNA'yı gösterir.
5. Ticari bir ters transkripsiyon kiti kullanarak tamamlayıcı DNA'yı (cDNA) sentezlemek için 1 μg saflaştırılmış RNA kullanın.
6. Üreticinin tavsiyelerine göre bir RT-PCR reaksiyonu hazırlamak için cDNA'nın 1:10 seyreltilmesini yapın. Her örnek için, hedef gen için bir reaksiyon hazırlayın ve paralel olarak, temizlik (HK) geni ile bir reaksiyon ayarlayın. Yöntemden rastgele varyasyonun etkisini ortadan kaldırmak için her gen reaksiyonunu teknik bir üçlüye ayarlayın.
   NOT: Burada, HK genleri olarak An. gambiae ribozomal S7 geni (GeneBank: L20837.1) ve aktin (VectorBase: AGAP000651) kullanılmıştır.
7. Tüm primerleri, SYBR-green üreticisinin endikasyonlarını takip ederek 300 nM'lik son konsantrasyonda kullanın. Standart PCR koşullarıyla yükseltin: 10 dakika boyunca 95 °C, ardından 95 °C'de 15 sn ve 60 °C'de 60 s'lik 40 döngü.
   NOT: Gen ekspresyonunu ölçmek için delta-delta-Ct yöntemi (ΔΔCt) kullanılır. Delta Ct (ΔCt), hedef genin Ct ile temizlik geninin Ct arasındaki farktır. ΔΔCt, deney grubunun ΔCt'si ile kontrol grubu^35'in ΔCt'si arasındaki farktır.

5. Fenotipik değerlendirme: başarılı kan besleme

1. Kan besleme yeteneğini değerlendirmek için, hedef ile tedavi edilen 15 dişi sivrisinek gruplarını ayarlayın ve dsRNA'yı küçük kafeslerde (12 cm çapında) kontrol edin ve 4 saat boyunca aç bırakın.
2. 37 ° C'ye ayarlanmış bir sirkülasyon suyu banyosu kullanarak, cam sivrisinek besleyiciler (24 mm çapında) ve parafilm membranı, sivrisineklere defibrinlenmiş koyun kanı sunar.
   NOT: Kan, ABD menşeli sağlıklı, donör hayvanlardan aseptik olarak çeken ve antikoagülanlar veya katkı maddeleri olmadan manuel olarak defibrinasyon yapan ticari bir satıcıdan alınabilir.
3. Doğrudan gözlemle, her gruba tamamen dahil olmak için ilk beş dişiden başarılı bir şekilde kan unu elde etmek için yapılan sondalama girişimlerinin sayısını sayın ve kaydedin.
   NOT: Sivrisineklerde, kan arama davranışını etkileyen enerji kaynaklarına müdahale edebilecek önemli metabolik değişikliklerden kaçınmak için, açlık minimumda tutuldu (4 saat). Sonuç olarak, her sivrisinek hevesle kan unu aramaz ve insan kokusuna maruz kalma, odalar ve beslenme yüzeyleri arasındaki sıcaklık değişimi gibi zaman değişkenlerinin etkisini azaltmak için engorged dişilerin sayısını beşle (her grubun toplamının üçte biri) sınırladık.

6. Fenotipik değerlendirme: Tükürük bezi morfolojisi ve ilgili proteinlerin aşağı regülasyonu

1. Taze dokuyu adım 4.2'de açıklandığı gibi 1x Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde izole edin ve 90 saniye boyunca buz gibi soğuk asetonda sabitleyin. Asetonu çıkardıktan sonra 1x PBS'de birkaç kez durulayın. 1x PBS'ye seyreltilmiş antiserum ile 4 ° C'de gece boyunca birincil antikorlarla inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Tükürük proteinleri için kullanılan birincil antikorların tanımlanması için Malzemeler Tablosuna bakınız (Anopheles anti-platelet protein, AAPP; Müsin 2, MUC2), SG transkripsiyon faktörleri (Çatal Kafası, fkh; Adaçayı, adaçayı; Siklik-AMP yanıt elemanı bağlayıcı protein A, CrebA) ve salgı veziküllerinin bir belirteci (Rab11). Bu antikorlar SG formu ve fonksiyonu için okuma olarak kullanılır. Bununla birlikte, immünofloresan için uygun herhangi bir antikor bu protokol için uygun olmalıdır.
2. 1x PBS'de birkaç kez yıkayın. 1x PBS'de seyreltilmiş ikincil antikorlar (floresan) ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. Herhangi bir karşı leke ekleyin [örneğin 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; DNA), buğday tohumu aglutinin (WGA; kitin için), falloidin (F-aktin için) ve / veya Nil Kırmızısı (lipitler için)] 2 saatlik inkübasyonun bitiminden 30 dakika önce.
3. 1x PBS'de üç kez yıkayın. Daha sonra, dokuları% 100 gliserol içine 1 mm kalınlığında bir kapak kayması ile standart bir mikroskop slaydına monte edin ve floresan konfokal mikroskop kullanarak görüntülemeye kadar -20 ° C'de saklayın.
   NOT: Kantitatif veriler elde etmek için, görüntüleme ayarları sabit tutulmalıdır. Burada, dokunun tüm 3D hacmi boyunca yalnızca maksimum yoğunluk projeksiyon görüntüleri dahil edildi ve tüm görüntü niceliği, SG olmayan doku kalıntılarındaki (yağ gövdesi, kütikül veya kafa) DAPI sinyaline dayanan tedaviler arasında (bir deney dahilinde) normalleştirildi. slaytta da bulunur.

Başlamak için, mevcut çalışmayla ilgili tüm genlerin ekspresyon durumunu belirlemek için gelişimsel aşamalar36,37 boyunca potansiyel hedefleri taramak için VectorBase'den mikroarray ekspresyon verileri kullanılmıştır (Tablo 1). Beklendiği gibi, seçtiğimiz tüm hedef genler yetişkin SG'lerde ekspresyon gösterdi. aapp ve adaçayı seviyeleri özellikle yüksekti (Tablo 1). Ayrıca, yetişkin dişi SG'lerde f-Agdsx'in yüksek ekspresyon seviyeleri de dikkat çekiciydi9.

RNAi reaktiflerinin tasarımı için E-RNAi web uygulaması kullanılarak dsRNA olarak kullanılmak üzere her genden spesifik segmentler değerlendirildi 30. Her bir hedef gene özgü diziler içeren ~ 400 bp bölgeleri daha sonra klonlandı (Şekil 1A), uygun bakteri suşlarına dönüştürüldü ve dsRNA üretmek için indüklenen ısıda öldürülen bakterilerin süspansiyonlarını hazırlamak için kullanıldı. Yetişkin sivrisinekler, f-Agdsx, fkh veya karınca (ilgisiz negatif kontrol) için dsRNA'nın bakteriyel süspansiyonlarını içeren sakkarozla ıslatılmış pamuk topları üzerinde 8 gün boyunca beslendi.

Dişi sivrisineklerin RNAi beslemesinin analizi için, ilk önce f-Agdsx veya fkh dsRNA beslemelerinin gen susturmaya neden olup olmadığı belirlendi. fkh-dsRNA

Yazarlar, açıklayacak çıkar çatışmaları olmadığını bildirmektedir.