Xenopus laevis Kurbağa Yavruları'nda Omurilik Transeksiyonu

Omurilik yaralanması (SCI), her yıl dünya çapında yaklaşık 250.000-500.000 kişiyi etkileyen bir ^{hastalıktır1}. Bu yüksek prevalansa ek olarak, SCI duyusal ve motor sinirleri etkiler, yaralanma bölgesinin altında felç oluşturur ve bazı iç organların CNS'nin kontrolünden ayrılması. CNS'nin bir parçası olan omurilik yenilenemez ve rahatsızlığın karmaşıklığı ve ilgili tüm süreçlerin tam olarak anlaşılmaması nedeniyle, fonksiyonel iyileşmeye izin veren etkili tedaviler hala yoktur.

Teleost balıkları, ürol amfibileri ve şiddetli SCI2,3,4'ten sonra omuriliği yenileyebilen anuran amfibilerin larva aşamaları gibi memeli olmayan organizmalar^, başarılı bir rejeneratif olayı yöneten süreçleri incelemek ve memeli rejenerasyonunun başarısızlığını anlamak için mükemmel model organizmalardır. Bu anlayış, SCI için yeni terapötik hedefler ve olası tedaviler geliştirmek için orijinal bilgiler sağlayabileceği için büyük ilgi çekicidir.

Anuran kurbağası, Xenopus laevis, SCI'yi incelemek için mükemmel bir model organizmadır. Metamorfoz sırasında aşamalı olarak kaybolan kurbağa yavrusu aşamalarında mükemmel rejeneratif kapasitelere sahiptir ve rejeneratif ve rejeneratif olmayan aşamalarda deneylere izin ^verir3,5. Xenopus laevis kurbağa yavrularında SCI'yi incelemek için kurulan yaralanma yöntemi, kas, notokord ve omurilik gibi dokular da dahil olmak üzere tüm kuyruğun çıkarıldığı kuyruk amputasyonundan ^oluşur6. Bu yaklaşım, rejeneratif süreçlerin genel mekanizmalarının anlaşılmasında etkili olmuştur4,7,8,9,10.

Kuyruk amputasyonu, insan SCI'sinden sonra olanlardan farklı olan omuriliğe ek olarak çoklu dokuları içerdiğinden, SCI çalışması için daha alakalı bir yaralanma paradigmasına ihtiyaç vardır. Geçmişte yaralanma paradigmalarının5,12,13,14 kapsamlı tanımlarını oluşturmak için kullanılan çalışmalara11 ve SCI12,13,14,15,16,17,18 çalışması için farklı yöntemlere güvendik. . Omurilik transeksiyonundan sonra, omuriliğin kaudal kısmı RNA ve protein ekspresyonu ve yüksek verimli analizler için izole edilebilir14,19,20,21. Ek olarak, ilaçların ve küçük moleküllerin intrasemik enjeksiyonlarının yanı sıra omurilik transeksiyonundan önce veya sonra cDNA, RNA veya morfolinoların elektroporasyonu, bu moleküllerin SCI'nin önlenmesinde veya tedavisinde veya SCI ve omurilik rejenerasyonundan sonra meydana gelen spesifik olayların etkilerinin ^{incelenmesine izin verir13,14} . Ayrıca, yaralanma evrimi ve rejeneratif süreçler, biyokimyasal, moleküler, histolojik ve fonksiyonel yaklaşımlar kullanılarak yaralanma sonrası farklı zamanlamalarda incelenebilir12,13,14,17,19,20,21,22,23.

Son olarak, yukarıda belirtilen tüm teknikler rejeneratif olmayan aşamalarda kullanılabilir ve Xenopus laevis'i SCI'yi incelemek için model bir organizma olarak kullanmanın en önemli avantajlarından birini, aynı türdeki rejeneratif ve rejeneratif olmayan mekanizmaların karşılaştırmalı çalışmalarını13,19,20,21,22 vurgulamaktadır. Bu yazıda Xenopus laevis kurbağa yavrusu omurilik transeksiyonu için rejeneratif Nieuwkoop ve Faber (NF) evre 50 kurbağa yavrularının evrelemesi ve seçimi ile başlayan bir protokol sunulmaktadır. Bunu, sahte ve transekte hayvanlar üretmek için omurilik cerrahisi prosedürlerinin tanımı, ameliyat sonrası bakım ve son olarak serbest kurbağa yavrusu yüzme mesafesinin ölçülmesiyle fonksiyonel iyileşmenin analizi izler.

Bu protokol, omurilik transeksiyonunu başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için yeterli bilgi sağlar. Not olarak, bu tekniklerin başka bir yerde yayınlanmış mükemmel ayrıntılı protokolleri ^vardır14, bu da burada sunulanı tamamlayabilir. Tüm hayvan prosedürleri, Pontificia Universidad Católica de Chile, Biyolojik Bilimler Fakültesi'nden Biyoetik ve Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Kurbağaların doğal çiftleşmesi

1. Çiftleşmeden üç ila beş gün önce, deri altından erkek ve dişi kurbağalara 50 ünite insan koryonik gonadotropin (hCG) enjekte edin. Kurbağaları kısıtlamak için "demir pençe" tekniğini kullanın; kurbağalar kaygan olduğundan, gerekirse kurbağayı çevrelemek için bir ağ kullanın. 26 G x 1/2" iğnenin ucunu lateral çizginin arkasına yerleştirin ve dorsal olarak cilt ve kas arasında 1 cm derinliğe itin.
2. Çiftleşmeden önce, erkeğe 300 ünite ve dişi 700 birim hCG enjekte edin.
3. Çiftleşmenin gerçekleşmesi için, erkek ve dişiyi, bahar koşullarına benzemek için çözeltiyi 4 ° C'de 15 dakika boyunca soğuttuktan hemen sonra 2 L 0.1x Barth çözeltisine yerleştirin ve gece boyunca 18 ° C'de bırakın.
4. On altı saat sonra, embriyoları plastik bir Pasteur pipeti yardımıyla, ucu kesilmiş olarak dikkatlice toplayın ve 10 cm çapında Petri kaplarına yerleştirin. Embriyoları damıtılmış suda (pH 7.8; çözeltinin embriyoları kapsadığından emin olun) 25 mL% 2 sistein ile hafif ajitasyonla 5 dakika boyunca inkübe ederek embriyonik jöle kabuğunu çıkarın. 3 kez damıtılmış su ile ve 3 kez 0.1x Barth çözeltisi ile yıkayın (8.9 mM NaCl; 102 μM KCl; 238.1 μM NaHCO3; 1 mM 4-(2- hidroksietil)-1-piperazin etansülfonik asit (HEPES); 81.14 μM MgSO4; 33.88 μM Ca(_NO3)₂; 40.81 μM _CaCl2, pH 7.6).
5. Kahverengimsi bir renge sahip ve blastomerleri simetrik olarak bölen sağlıklı embriyoları seçin. Embriyoları, 10 cm çapında Petri kaplarına, 50 mL 0.1x Barth çözeltisi ile, çanak başına en fazla 100 embriyo yoğunluğunda yerleştirin.

2. Hayvancılık

1. İlk hafta boyunca, embriyoları vitelin kesesinden çıkana kadar 18 ° C'de tutun. Bu süre zarfında, Barth çözeltisini her gün değiştirin ve görünür bir anatomik değişiklik gösteren beyazımsı ölü embriyoları ve kurbağa yavrularını veya herhangi bir yüzme hareketi olmadan kurbağa yavrularını çıkarın.
2. İlk haftadan sonra, kurbağa yavrularını plastik tanklarda litre başına 10 hayvan yoğunluğunda klorsuz suya aktarın. Kurbağa yavrularını 20-21 ° C'de 12 saatlik ışık / 12 saatlik karanlık döngü ile büyütün, suyu havalandırmak için her tankta oksijen taşları bulunur ve hayvan başına 0,5 mg ile günde bir kez beslenir. Suyu haftada bir kez değiştirin ve biriken atık ve ölü hayvanları günlük olarak kontrol ^edin24.

3. Evreleme

1. Döllenmeden üç ila dört hafta sonra, hayvanları bir Petri kabına yerleştirin; Daha sonra, tek tek, ön ayakların ve arka bacakların morfolojisini ve görünümünü kontrol edin. Gerekirse, daha iyi manipülasyon için hayvanları 0.1x Barth çözeltisinde 50 mL% 0.02 trikain mesilat içeren bir Petri kabına yerleştirerek hayvanları anestezi altına alın. En fazla 2 dakika sonra, anesteziden kurtulmak için hayvanları 0.1x Barth çözeltisine yerleştirin.
2. Evre 50 hayvanlarının aşağıdaki anatomik özelliklerini ^arayın25: yeni ortaya çıkan ve küresel olan ön ayaklar (Şekil 1); çıkıntılı ve küresel olan arka bacaklar (Şekil 1).
   NOT: Bu prosedür için 49 ila 51 aşamaları arasındaki hayvanlar kullanılabilir (Şekil 1); aşamalar hakkında daha fazla bilgi için Nieuwkoop ve Faber'in Xenopus laevis25'in Normal Tablosuna bakın.

4. Cerrahi: omurilik transeksiyonu ve sahte ameliyat edilen hayvanlar

1. Aşama 50 kurbağa yavrularını, 2 dakika boyunca 0.1x Barth çözeltisinde 50 mL% 0.02 trikain mesilat içeren bir Petri kabına yerleştirerek anestezi yapın.
2. Bir çorba kaşığı ve forseps yardımıyla, kurbağa yavrusunu, sırt tarafını, bir cam Petri kabının üst yarısında ıslak bir gazlı bez parçası üzerine yerleştirin.
3. Mikrodiseksiyon yay makası kullanarak orta torasik seviyede cilt ve dorsal kasların bir kesisini yapın (Şekil 2A, B).
   1. Kontrol sahte hayvanları için, kesi boyutunun sadece ~ 0,2 mm olduğundan emin olun (Şekil 2C); omuriliğe zarar vermeyin (Şekil 2D,D').
   2. Transekte hayvanlar için, omuriliği tamamen transekte etmek için ~ 0.2 mm'lik ikinci bir kesi yapın (Şekil 2C) (Şekil 2E, E').

5. Ameliyat sonrası bakım

1. Ameliyattan sonra, kurbağa yavrularını, tank başına 10-12 hayvan yoğunluğunda, 1x Penisilin-streptomisin içeren 0.5 L 0.1x Barth çözeltisi içeren bir tanka aktarın. Transekte edilmiş hayvanları ayrı tanklarda tutun ve kontrol edin.
   NOT: Kurbağa yavruları anesteziden birkaç dakika içinde iyileşir.
2. Kurbağa yavrularını havalandırma ile 20-21 ° C sıcaklıkta tutun.
3. Barth çözeltisini, deneyin sonuna kadar her gün antibiyotiklerle değiştirin.
4. Hayvanları ameliyattan bir gün sonra, günde bir kez beslemeye başlayın.
5. Ölü hayvanları ortadan kaldırın.

6. Yüzme testi

1. Işığın geçmesine izin veren şeffaf bir polistiren levha ile kaplı, içeriden LED aydınlatmalı bir kutu elde edin.
2. LED kutusunun üzerine bir kamera takın.
3. Kutunun üzerine, 100 mL 0.1x Barth çözeltisi ile doldurulmuş 15 cm çapında bir Petri kabı yerleştirin.
4. Transeksiyondan bir gün sonra, Petri kabına bir kurbağa yavrusu yerleştirin ve 5 dakikalık bir adaptasyon süresi için bırakın.
5. Uyarlamadan sonra, referans verilen yazılımı kullanarak serbest yüzme davranışını video izlemeye başlayın ( Malzeme Tablosuna bakın) 5 dakika boyunca.
6. Video tamamlandıktan sonra, kurbağa yavrusunu tankına geri aktarın.
7. Video izlemeyi transeksiyondan 5, 10, 15 ve 20 gün sonra tekrarlayın (Şekil 3).

7. Biyoetik hususlar

NOT: Sahte cerrahi ve transeksiyon sonrası hayvanların mortalitesi sırasıyla% 13 ve% 30'dur. Ek olarak, istatistiksel analiz için grup başına en az 15-20 hayvan gereklidir. Bu nedenle, 23 sahte ve 26 transekte hayvanla başlayın.

1. Ameliyat öncesi nöronal ve motor aktivitede ve ağrıda azalma sağlamak için hayvanları 2 dakika boyunca% 0.02 trikain mesilat ile anestezi yapın.
2. Ameliyattan sonra, anesteziden kurtulmak için hayvanları kontrol edin. Ek olarak, hayvanları günlük olarak besleyin ve kontrol edin.
3. Yüzme testini bitirdikten sonra, hayvanları aşırı dozda trikain mesilatı (30 mM sodyum bikarbonat çözeltisinde hazırlanan% 1 trikain mesilat) ile kurban edin.

Burada açıklanan protokol, Xenopus laevis'te omurilik rejenerasyonunun incelenmesine izin verir. Spesifik farmakolojik tedavilerin etkileri ve spesifik gen ekspresyonunun omurilik rejenerasyonuna katkısı, yüzme iyileşmesi üzerindeki etkileri ölçülerek değerlendirilebilir. Toplam yüzme mesafesi, belirli bir zaman noktasında veya belirli bir süre boyunca kontrol ve tedavi edilen hayvanları karşılaştırmak için yaralanmadan sonraki günlere göre çizilir. Motor fonksiyonun zaman içinde geri kazanılması, transeksiyondan sonraki 5, 10, 15 ve 20 günlük yüzme mesafesini gösteren Şekil 3'te örneklendirilmiştir. Transeksiyondan sonraki 5 günde, hayvanlar 5 dakikada ortalama 0,7 m yüzdüler ve bu da yüzme kapasitesinin azaldığını gösterdi. Bu kapasite geçen günlerle birlikte artmış, çünkü transeksiyondan sonraki 10 ve 15 gün sonra sırasıyla ortalama 2.1 ve 3.1 m/5 dk gözlenmiş, transeksiyondan sonraki 20 günde ortalama 5.7 m/5 dakika ile yüzme kapasitelerinin tamamen geri kazanımı gözlenmiştir.

Resim 1: Xenopus kurbağa yavrusu evrelemesi. 49-51 aşamalarının temsili görüntüleri, hayvan evreleme referansı için ön ve arka bacakları gösterir. Ölçek çubukları = 2 mm. Kutulu bölgenin büyütmeleri her görüntünün sağ alt köşesinde gösterilir. Ölçek çubukları = 1 mm. 49. aşamada, ön ayaklar gözlenmezken, arka bacaklarda sadece küresel bir şekil göstererek ortaya çıkar. Aşama 50, yeni ortaya çıkan, küresel bir şekil gösteren ön ayakları ve küresel bir şekille çıkıntı yapan arka bacakları sunar. Aşama 51'de, ön ayaklar çıkıntılı bir küresel şekil sunar ve arka bacaklarda çıkıntılı uzun bir şekil bulunur. Kesikli anahatlar ön ve arka bacakları gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Omurilik transeksiyonu . (A) Ameliyatı gerçekleştirmek için hayvanın dorsal tarafı yukarı doğru konumlandırıldığını gösteren temsili görüntü. Ölçek çubuğu = 2 mm. (B) A'nın büyütülmesi, yaralanmanın yerini ve derecesini gösterir. Kırmızı haç, omuriliğin torasik seviyesindeki yaralanma bölgesinin tam yerini gösterir ve kesikli çizgi yaralanmanın derecesini gösterir. Ölçek çubuğu = 1 mm. (C) Omuriliğin torasik seviyesinin yanal görünümünü gösteren temsili görüntü. Sahte insizyonun uzatılması ve transeksiyonu gösterilmiştir. Kesikli çizgiler omuriliğin sınırlarını belirler. Ölçek çubuğu = 1 mm. (D) Sağlam omuriliği olan sahte bir hayvanı gösteren temsili resim. Ölçek çubukları = 1 mm. (E) Omuriliği kesilmiş transekte bir hayvanı gösteren temsili görüntü. Ölçek çubukları = 1 mm. Kutulu bölgenin büyütmeleri her görüntünün sağ alt köşesinde gösterilir (D' ve E'). Ölçek çubukları = 1 mm. Kısaltmalar: S = sahte insizyon; T = transeksiyon. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Zamanla yüzme fonksiyonunun iyileşmesi. Transeksiyondan sonraki 5, 10, 15 ve 20 gün içinde transekte hayvanların kapladığı yüzme mesafesinin temsili nokta grafiği. Yüzme yörüngelerinin örnekleri üstte gösterilmiştir. Veriler, 10 kurbağa yavrusundan ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Kısaltmalar: dpT = transeksiyon sonrası gün; SEM = ortalamanın standart hatası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.