Method Article

Granül Hücre Öncüsünde Birincil Seyuma Bağımlı Sinyal Yollarını İncelemek için Verimli ve Uygun Maliyetli Elektroporasyon Yöntemi

DOI:

10.3791/63283

⸱

November 30th, 2021

 ,  , 
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, primer serebellar granül hücre öncüllerinin (GCP' ler) genetik manipülasyonu için uygun maliyetli, verimli ve uygulanabilir bir tekrarlanabilir in vitro elektroporasyon protokolü sunuyoruz. Ayrıca, bu protokol ayrıca birincil GCP hücrelerindeki birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yollarının moleküler çalışması için basit bir yöntem göstermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birincil sicim, hücre yüzeyinden sarkıt sinyali veren Kirpi (Hh) ileten hemen hemen her hücrede bulunan kritik bir sinyal organıdır. Granül hücre öncüsünde (GCP), birincil sicim, Hh sinyal yolunu modüle ederek öncü hücre çoğalmasını düzenleyen önemli bir sinyal merkezi görevi görür. Birincil sicime bağımlı Hh sinyal makinelerinin araştırılması, birincil sicime dinamik lokalizasyonlarını görselleştirmek için yol bileşenlerinin in vitro genetik manipülasyonu ile kolaylaştırılmıştır. Bununla birlikte, GCP'lerin birincil kültürlerinde transgenlerin şu anda bilinen elektroporasyon yöntemlerini kullanarak transeksiyonu genellikle maliyetlidir ve genellikle düşük hücre canlılığı ve istenmeyen transeksiyon verimliliği ile sonuçlanır. Bu makale, ~%80-90 arasında yüksek transfeksiyon verimliliği ve optimum hücre canlılığı gösteren verimli, uygun maliyetli ve basit bir elektroporasyon protokolü sürmektedir. Bu, birincil GCP kültürlerinde birincil ekyuma bağımlı Kirpi sinyal yolunun incelenmesi için geçerli olan basit, tekrarlanabilir ve verimli bir genetik modifikasyon yöntemidir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serebellar GCP'ler, yüksek bollukları ve vivo1,2,3,4'teki Hh sinyal yoluna karşı yüksek hassasiyetleri nedeniyle nöronal progenitör hücre tiplerinde Hh sinyal yolunun makinelerini incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. GCP'lerde, birincil eksiyum öncü hücrelerin çoğalmasını düzenleyen önemli bir Hh sinyal transdüksiyon merkezi5 görevi görür6,7,8. Birincil sicim üzerindeki Hh sinyal bileşenlerinin in vitro....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, hayvan taşıma yönergelerine ve Hong Kong Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanan protokole uygun olarak gerçekleştirildi. Hayvan (Deneylerin Kontrolü) Yönetmeliğini (Cap. 340) takip eden hayvan deney lisansları Hong Kong Hükümeti Sağlık Bakanlığı'ndan alınmıştır. Hayvan çalışmaları HKBÜ Araştırma Ofisi ve Laboratuvar Güvenliği Komitesi tarafından onaylanan hayvan güvenliği etiğine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Deneyim öncesi hazırlık

  1. Kültür medyası ve tamponları....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opti-MEM'i ( Bkz. Malzeme Tablosu

figure-results-1
.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birincil GCP kültüründeki transjenlerin elektroporasyon yöntemi ile transeksiyonu tipik olarak düşük hücre canlılığı ve zayıf transeksiyon verimliliği9,10 ile ilişkilidir. Bu makale, yüksek verimlilik ve canlılık gösteren uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir elektroporasyon protokolü salamıştır. Ek olarak, birincil GCP hücrelerinde birincil sicime bağımlı Hh sinyal yolunu incelemek için basit bir yöntem de gösteriyoruz.

Diğer yaygın .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma HKBU Tohum Fonu ve Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) tarafından C.H.H. Hor'a desteklendi.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GCP Kültürü< / güçlü >
B27 takviyesiLife Technologies LTD17504044
Hücre süzgeci, 70 & mCorning352350
DNase I, sığır pankreasındanRoche11284932001
Earle' s Dengeli Tuz ÇözeltisiGibco, Life Technologies14155063
FBS, nitelikliThermo ScientificSH30028.02
GlutamMAXTM-I, 100xGibco, Life Technologies35050061L-glutamin ikamesi
L-sisteinSigma AldrichC7352
MatrigelBD Biosciences354277Bodrum membran matrisi
NeurobazalGibco, Life Technologies21103049
Papain, süspansiyonWorthington Biochemical CorporationLS003126
Poli-D-lizin HidrobromürSigma AldrichP6407
SAGCayman Chemical11914-1Düzleştirilmiş agonist
IF boyama< / güçlü>
Sığır SerumuAlbümin Sigma AldrichA7906
ParaformaldehitSigma AldrichP6148
Triton X-100Sigma AldrichX100
Birincil antikor karışımı
Anti-GFP-keçi abRockland600-101-215Seyreltme Faktörü: 1: 1000
Anti-Arl13b fare monoklonal abNeuroMab75-287Seyreltme Faktörü: 1: 1000
Anti-Pax6 tavşan poliklonal abCovancePRB-278PSeyreltme Faktörü: 1: 1000
İkincil antikor karışımı< / güçlü >
Alexa Fluor 488 eşek anti-keçi IgGInvitrogenA-11055Seyreltme Faktörü: 1: 1000
Alexa Fluor 555 eşek anti-fare IgGInvitrogenA-31570Seyreltme Faktörü: 1: 1000
Alexa Fluor 647 eşek anti-tavşan IgGInvitrogenA-31573Seyreltme Faktörü: 1: 1000
DAPIThermo Scientific62247Seyreltme Faktörü: 1: 1000
Elektroporasyon< / güçlü >
CU 500 küvet odasıNepageneCU500
EPA Elektroporasyon küveti (2 mm boşluk)NepageneEC-002
Opti-MEMLife Technologies LTD31985070transfeksiyon için azaltılmış serum ortamı
pEGFP-mSmoAddgene25395
Süper Elektroporatör NEPA21 TİP II İn Vitro ve İn Vivo ElektroporasyonNepageneNEPA21elektroporatör

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Primary CiliumElectroporation MethodGranule Cell PrecursorHedgehog SignalingGenetic ModificationIn Vitro TransfectionCell ViabilityCilium Marker Arl13bSmoothened EGFP LocalizationPax6 Expression

Related Articles