Burada, çeşitli böbrek hastalığı fare modellerinde viral olmayan bir vektörün kuyruk damarı enjeksiyonu ve polietilenimin nanopartikülleri yoluyla böbreğe yapay olarak sentezlenmiş dışsal miRNA taklitleri veriyoruz. Bu, böbrekte hedef miRNA'nın önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna yol açtı ve birkaç fare modelinde böbrek hastalığının ilerlemesini engelledi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Çeşitli Böbrek Hastalığı Fare Modellerinde Polietilenimin Nanopartikülleri Kullanılarak Ekzojen Yapay Olarak Sentezlenmiş MiRNA Mimiklerinin Böbreğe Verilmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
mikroRNA'lar (miRNA'lar), proteinlere çevrilmeyen küçük kodlamayan RNA'lar (21-25 baz), çeşitli böbrek hastalıklarında dengelerini bozarak ve translasyonlarını inhibe ederek birçok hedef mesajcı RNA'yı (mRNA) inhibe eder. Bu nedenle, miRNA ekspresyonunun eksojen yapay olarak sentezlenmiş miRNA taklitleri ile değiştirilmesi, birçok böbrek hastalığının gelişimini inhibe etmek için potansiyel olarak yararlı bir tedavi seçeneğidir. Bununla birlikte, serum RNAaz, sistematik olarak uygulanan eksojen miRNA taklitlerini in vivo olarak derhal bozduğundan, miRNA'nın böbreğe verilmesi bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, eksojen miRNA taklitlerini RNAaz tarafından bozulmaya karşı koruyabilen ve bunları böbreğe önemli ölçüde iletebilen vektörler gereklidir. Birçok çalışma, böbreğe eksojen miRNA taklitleri veya inhibitörleri vermek için viral vektörler kullanmıştır. Bununla birlikte, viral vektörler interferon yanıtına ve / veya genetik instabiliteye neden olabilir. Bu nedenle, viral vektörlerin gelişimi, eksojen miRNA taklitlerinin veya inhibitörlerinin klinik kullanımı için de bir engeldir. Viral vektörlerle ilgili bu endişelerin üstesinden gelmek için, polietilenimin nanopartiküllerinin (PEI-NP'ler) kuyruk damarı enjeksiyonunu kullanarak böbreğe miRNA taklitleri vermek için viral olmayan bir vektör yöntemi geliştirdik, bu da böbrek hastalığının birkaç fare modelinde hedef miRNA'ların önemli ölçüde aşırı ekspresyonuna yol açtı.
Giriş
miRNA'lar, proteinlere çevrilmeyen küçük kodlamayan RNA'lar (21-25 baz), birçok hedef mesajcı RNA'yı (mRNA'lar) istikrarsızlaştırarak ve çeşitli böbrek hastalıklarında translasyonlarını inhibe ederek inhibe eder 1,2. Bu nedenle, ekzojen yapay olarak sentezlenmiş miRNA taklitleri veya inhibitörleri kullanan gen tedavisi, birçok böbrek hastalığının gelişimini inhibe etmek için potansiyel yeni bir seçenektir 3,4,5.
Gen terapisi için miRNA taklitleri veya inhibitörlerinin vaadine rağmen, hedef ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deney protokolleri, Jichi Tıp Üniversitesi hayvan etik komitesi tarafından onaylanmış ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Kılavuzu'ndaki Deney Hayvanlarının Kullanımı ve Bakımı kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Burada, böbreğe miRNA taklit iletimini, UUO fareleri kullanılarak aşırı ekspresyonuna neden olduğunu gösterdik. Bu çalışma Jichi Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır [Onay No. 19-12 renal fibroz için, 17-024 akut böbrek enfeksiyonu (AKI) için ve 19-11 diyabetik nefropati için].
1. PEI-NPs-miRNA-mimik kompleksinin hazırlanması
NOT: Bur....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Aşağıda tarif edilen renal fibrozis, diyabetik nefropati ve AKI için hedef miRNA'lar, gen terapisi uygulamaları için mikrodizi, qRT-PCR ve / veya veritabanı araştırmasına dayanarak seçildi. Daha fazla ayrıntı için, önceki yayınlarabakın 13,14,15.
Renal fibrozis farelerinde PEI-NP'ler kullanılarak miRNA-146a-5p-mimik verilmesi ve etkileri13
F.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makalede sunulan protokolü kullanarak, PEI-NP'ler, hedef miRNA'ların aşırı ekspresyonunu indüklemek için böbreğe miRNA taklitleri verebilir ve bu da renal fibroz, diyabetik böbrek hastalığı ve AKI dahil olmak üzere çeşitli böbrek hastalıklarının in vivo fare modellerinde tedavi etkilerine neden olabilir.
PEI-NP kompleksini ve miRNA taklidini hazırlama yöntemi çok basittir. PEI-NP'lerin pozitif yüklü yüzeyi, 13,14,15,16,17 karıştırıldığında miRNA taklidini
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI (Hibe No. 21K08233) tarafından desteklenmiştir. Bu yazının taslaklarını düzenlediği için Edanza'ya (https://jp.edanz.com/ac) teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Çekirdeğe boyama için 4',6-diamidino-2-fenilindol | Thermo Fisher Scientific | D-1306 | |
| Tampon RPE | Qiagen | 79216 | Yıkama tamponu 2 |
| Tampon RWT | Qiagen | 1067933 | Yıkama tamponu 1 |
| Kontrol-miRNA-taklit (yapay olarak sentezlenmiş miRNA) | Thermo Fisher Scientific | Atanmadı | 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3' (anlamlı) 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (anlam karşıtı) |
| Cy3 etiketli çift sarmallı oligonükleotidler | Takara Bio Inc. | ||
| Floresein etiketli Lotus tetragonolobus lektin | Vektör Laboratuvarları A.Ş | . FL-1321 | |
| İn vivo-jetPEI | Polyplus | 101000021 | |
| MicroAmp qRT-PCR için optik 96 kuyulu reaksiyon plakası | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96 kuyulu reaksiyon plakası |
| MicroAmp Optik Yapışkan Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | 96 oyuklu reaksiyon plakası |
| miRNA-146a-5p taklidi için yapışkan film (yapay olarak sentezlenmiş miRNA) | Thermo Fisher Scientific | atanmamış | ; (anlamlı) 5'-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3′ (anlam karşıtı) |
| miRNA-146a-5p primer | Qiagen | MS00001638 | Qiagen qRT-PCR kitlerini değiştirdiği için mevcut değil (Mayıs 2021'den itibaren miScript miRNA PCR sisteminden miRCURY LNA miRNA PCR Sistemine) |
| miRNA-181b-5p taklidi (yapay olarak sentezlenmiş miRNA) | Gen tasarımı | 5'-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGG GUU-3' | atanmadı |
| miRNA-181b-5p primer | Qiagen | MS00006083 | Qiagen qRT-PCR kitlerini değiştirdiği için mevcut değil (Mayıs 2021'den itibaren miScript miRNA PCR sisteminden miRCURY LNA miRNA PCR Sistemine) |
| miRNA-5100-mimik (yapay olarak sentezlenmiş miRNA) | Gen tasarımı | 5'-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3&prime | atanmadı |
| miRNA-5100-primer | Qiagen | MS00042952 | Qiagen qRT-PCR kitlerini değiştirdiği için mevcut değil (Mayıs 2021'den itibaren miScript miRNA PCR sisteminden miRCURY LNA miRNA PCR Sistemine) |
| miRNeasy Mini kiti | Qiagen | 217004 | 2.0 mL'lik bir toplama tüpünde membran bağlantılı spin kolonu |
| miScript II RT kiti | Qiagen | 218161 | Qiagen, qRT-PCR kitlerini değiştirdiği için mevcut değil (Mayıs 2021'den itibaren miScript miRNA PCR sisteminden miRCURY LNA miRNA PCR Sistemine) |
| miScript SYBR Green PCR kiti | Qiagen | 218073 | Qiagen, qRT-PCR kitlerini değiştirdiği için mevcut değil (Mayıs 2021'den itibaren miScript miRNA PCR sisteminden miRCURY LNA miRNA PCR Sistemine)QIA |
| parçalayıcı | Qiagen | 79654 | 2.0 mL'lik bir toplama tüpünde |
| biyopolimer spin kolonlarıQIAzol Lizis Reaktifi | Qiagen | 79306 | Fenol/guanidin bazlı lizis reaktifi |
| QuantStudio 12K Flex Flex Gerçek Zamanlı PCR sistemi | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Gerçek zamanlı PCR cihazı |
| QuantStudio 12K Flex Yazılım sürümü 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Gerçek zamanlı PCR cihaz yazılımı |
| RNaz içermeyen su | Qiagen | 129112 | |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | Qiagen qRT-PCR kitlerini değiştirdiği için mevcut değil (Mayıs 2021'den itibaren miScript miRNA PCR sisteminden miRCURY LNA miRNA PCR Sistemine) |
| Tissue-Tek OCT (Optimal Kesme Sıcaklığı Bileşiği) | Sakura Finetek Japan Co.,Ltd. | Atanmadı |
Kaynaklar
- Mohr, A. M., Mott, J. L. Overview of microRNA biology. Seminars in Liver Disease. 35 (1), 3-11 (2015).
- Bushati, N., Cohen, S. M. microRNA functions. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).
- Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
