Yöntem makalesi

Transkriptom Düzeyinde İnsan Primer Mezenterik Arteriyel Endotel Hücrelerinin İzolasyonu ve Profillenmesi

DOI:

10.3791/63307

⸱

14 Mart 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Diabetes Complications and Metabolism, City of Hope, 2Department of Bioengineering, University of California San Diego, 3Irell and Manella Graduate School of Biological Sciences, City of Hope

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, endotel hücrelerinin insan mezenterik arterinden izolasyonunu, kültürünü ve profillemesini tanımlar. Ek olarak, insan arterini mekansal transkriptomik için hazırlamak için bir yöntem sağlanmıştır. İzole hücreler üzerinde proteomik, transkriptomik ve fonksiyonel testler yapılabilir. Bu protokol, herhangi bir orta veya büyük boyutlu arter için yeniden kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endotel hücreleri (ECs), çevresel ipuçlarına dinamik tepkileri sayesinde vasküler ve tüm vücut fonksiyonları için çok önemlidir. ECs'nin transkriptom ve epigenomunu aydınlatmak, gelişim, sağlık ve hastalıktaki rollerini anlamak için çok önemlidir, ancak izole birincil hücrelerin kullanılabilirliğinde sınırlıdır. Son teknolojiler, EC transkriptom ve epigenomun yüksek verimli profillemesini mümkün kılarak daha önce bilinmeyen EC hücre alt popülasyonlarının ve gelişimsel yörüngelerin tanımlanmasına yol açmıştır. EC kültürleri, EC fonksiyonunun ve disfonksiyonunun araştırılmasında yararlı bir araç olsa da, kültür koşulları ve çoklu pasajlar, morfoloji, epigenetik durum ve gen ekspresyon programı dahil olmak üzere doğal EC'nin özelliklerini değiştiren dış değişkenleri ortaya çıkarabilir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, bu makale insan primer EC'lerini doğal durumlarını yakalamayı amaçlayan donör mezenterik arterlerden izole etmenin bir yöntemini göstermektedir. İntimal tabakadaki EC'ler, belirli enzimlerin kullanımı ile mekanik ve biyokimyasal olarak ayrışır. Elde edilen hücreler doğrudan toplu RNA veya tek hücreli RNA dizilimi için kullanılabilir veya kültür için kaplanabilir. Ek olarak, mekansal transkriptomikler için, özellikle ticari olarak temin edilebilen bir platform için insan arteriyel dokusunun hazırlanması için bir iş akışı tanımlanmıştır, ancak bu yöntem diğer mekansal transkriptom profilleme teknikleri için de uygundur. Bu metodoloji, endotel hücre biyolojisinin önemli bir yönü olan EC transkripsiyonel ve epigenetik düzenlemesi hakkında fikir edinmek için sağlık veya hastalık durumlarındaki çeşitli donörlerden toplanan farklı damarlara uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan damarlarının lümenini kaplayan endotel hücreleri (ECs), vasküler ton ve doku perfüzyonunun önemli düzenleyicileridir. EC'ler, hücre dışı ortama tepki verme ve kan akışının dinamikleri ve bileşimindeki değişikliklere uyum sağlama yeteneklerinde dikkat çekicidir. Bu dinamik yanıtlar, uzaysal-zamansal çözünürlüğe sahip transkripsiyonel ve post-transkripsiyonel modülasyonlar da dahil olmak üzere hücre içi sinyal olaylarının bir ağı aracılığıyla aracılık eder. Bu yanıtların düzensizliği, kardiyovasküler hastalık, diyabet ve kanser dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok patolojide rol oynar 1,2.

Çalışmaların büyük bir kısmı, EC transkriptomunu sorgulamak için hücre hatlarından veya hayvan modellerinden yararlanmaktadır. İlki, göreceli kullanım kolaylığı ve ucuzluk göz önüne alındığında kullanışlı bir araçtır. Bununla birlikte, seri kültürleme, ECs'ye fibroblastik özellikler ve polarizasyon eksikliği gibi fenotipik değişiklikler getirebilir ve bunları in vivo durumlarından ayırabilir3. Birincil hücreler, örneğin insan göbek damarı EC (HUVEC), 1980'lerden beri popüler bir seçim olmuştur, ancak yetişkinlerde bulunmayan gelişimsel bir vasküler yataktan türetilmiştir, bu nedenle olgun ECs'yi tam olarak temsil etme olasılığı düşüktür. Hayvanlar, özellikle fare modelleri, EC'lerin fizyolojik veya patofizyolojik ortamını daha iyi temsil eder ve genetik bozulmanın bir sonucu olarak transkriptomların sorgulanmasına izin verir. Murine ECs, enzim bazlı prosedürler kullanılarak aort, akciğerler ve yağ dokuları dahil olmak üzere çeşitli dokulardan izole edilebilir 4,5,6,7. Bununla birlikte, izole edilmiş hücreler6'ya dönüştürülmedikçe çoklu pasajlar için kullanılamaz ve genellikle sayılarla sınırlıdır, bu da birden fazla hayvandan havuzlanmayı gerektirir 5,8,9.

Transkriptomik düzeyde, özellikle tek hücreli çözünürlükte, gemi mimarisini araştıran yeni teknolojilerin ortaya çıkması, ECs 5,10,11,12,13,14'ün yeni fonksiyonlarını ve özelliklerini ortaya çıkararak yeni bir endotel biyolojisi çağını mümkün kılmıştır. Tabula Muris araştırmacıları tarafından oluşturulan zengin bir kaynak, 20 farklı murin organında ECs dahil olmak üzere 100.000 hücrenin tek hücreli transkriptomik profillerini topladı15, bu da hem ortak EC belirteç genlerini hem de dokular arası ve doku içi farklılıklara sahip benzersiz transkriptomik imzaları ortaya çıkardı 5,13. Bununla birlikte, genom, epigenom ve transkriptomda, özellikle kodlamayan bölgelerde fare ve insan arasında açık farklılıklar vardır16,17,18. Yukarıda belirtilen bu dezavantajlar, sağlık ve hastalık açısından kendi yerel durumlarında EC'lerin sadık bir profilini elde etmek için insan örneklerini kullanarak EC'lerin analizinin önemini vurgulamaktadır.

Çoğu EC izolasyon yöntemi, homojenizasyon, ince kesim ve farklı zamanlarda proteolitik enzimlerle inkübasyondan önce dokunun kıyılması yoluyla fiziksel ayrışmaya dayanır. Enzimler ve koşullar ayrıca tripsinden kollajenaz'a, tek başına veya kombinasyon halinde kullanılan doku tipleri arasında önemli ölçüde değişir 19,20,21. EC'lerin saflığını arttırmak için genellikle antikor bazlı zenginleştirme veya saflaştırma dahil edilir. Tipik olarak, CD144 ve CD31 gibi EC membran belirteçlerine karşı antikorlar manyetik boncuklara konjuge edilir ve hücre süspansiyonu 22,23'e eklenir. Böyle bir strateji, bu protokolde tanıtılan teknikler de dahil olmak üzere, genellikle birden fazla insan ve fare dokusundan EC izolasyonu için uyarlanabilir.

Doğal hallerinde, EC'ler birden fazla hücre tipi ile etkileşime girer ve hücre yakınlığının işlev için çok önemli olduğu vasküler nişlerde bulunabilir. Tek hücreli ve tek nükleer RNA dizilimi (scRNA ve snRNA-seq) çalışmaları, EC heterojenliğini tanımlamadaki son atılımlar için çok önemli olsa da, ayrışma süreci, EC biyolojisini anlamak için de önemli olan doku bağlamını ve hücre-hücre temasını bozar. 2012 yılında geliştirilen ve 202024 yılında Yılın Yöntemi olarak adlandırılan mekansal transkriptom profilleme, beyin 25, tümör26 ve yağ dokusu27 dahil olmak üzere çeşitli dokulardaki mekansal özellikleri korurken, küresel gen ekspresyonunun profilini çıkarmak için kullanılmıştır. Teknolojiler, afinite reaktiflerine veya floresan etiketlerine bağlı belirli RNA dizileri için spesifik özel problar kullanılarak hedeflenebilir, böylece hücre altı çözünürlükte 28,29,30,31'de seçilmiş genler tespit edilebilir. Ayrıca, RNA'yı yakalamak için tipik olarak mekansal olarak barkodlanmış oligonükleotidler kullanarak, hedeflenmemiş 32,33 olabilirler, bunlar birlikte sonraki sek kütüphanesi hazırlığı için cDNA'ya dönüştürülür ve bu nedenle tüm doku gen ekspresyonunu tarafsız bir şekilde çıkarma avantajına sahiptir. Bununla birlikte, uzamsal çözünürlük şu anda ticari olarak temin edilebilen teknolojilerle tek bir hücresel düzeyde elde edilmemektedir. Bu, scRNA-seq verileriyle veri entegrasyonu ile bir dereceye kadar aşılabilir, sonuçta orijinal uzamsal bilgisini korurken karmaşık bir doku bağlamında tek hücreli transkriptomun haritalandırılmasına izin verir34.

Burada, vazodilatasyon, vasküler yeniden modelleme, oksidatif stres ve inflamasyon35,36,37 üzerinde çalışmak için kullanılan periferik bir arter olan insan superior mezenterik arteri kullanılarak EC transkriptomun profilini çıkarmak için bir iş akışı tanımlanmıştır. İki teknik tanımlanmıştır: 1) EC'leri, tek hücreli transkriptom dizilimi veya daha sonra in vitro kültür için uygun mekanik ayrışma ve enzimatik sindirimi birleştiren kan damarlarının intimasından izole etmek ve zenginleştirmek; 2) Mekansal transkriptom profillemesi için arteriyel kesitler hazırlamak (Şekil 1). Bu iki teknik, EC'lerin ve çevresindeki hücrelerin profilini çıkarmak için bağımsız veya tamamlayıcı olarak gerçekleştirilebilir. Ayrıca, bu iş akışı herhangi bir orta veya büyük arterde kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan dokusu çalışmaları, City of Hope'taki Güney Kaliforniya Adacık Hücre Kaynak Merkezi'nden elde edilen tanımlanmamış örnekler üzerinde gerçekleştirildi. Postmortem insan dokularının kullanımı için araştırma onayları bağışçıların akrabalarından alınmış ve bu çalışma için etik onay Umut Şehri Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB No. 01046) tarafından verilmiştir.

1. Fiziksel ayrışma (tahmini süre: 1-2 saat)

  1. 10 cm'lik bir kaba taze bir arter yerleştirin ve steril Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (D-PBS) ile yıkayın.
  2. Steril forseps ve diseksiyon makası ile damar temizlenene kadar yağ ve dış bağ dokularını çıkarın. Geminin uzunluğunu, kabın dışına yerleştirilmiş bir cetvelle ölçün ve kayıtlar için fotoğraf çekin (Şekil 1A).
  3. Uygun sindirim tamponunu 37 °C'ye kadar önceden ısıtın: scRNA-seq için hücre ayrışma enzimini kullanın; Hücre kültürü tahlilleri için 1-6 mg / mL Kollajenaz D, 3 mg / mL bakteri kaynaklı proteaz, 100 mM HEPES, 120 mM NaCl, 50 mM KCl, 5 mM glikoz, 1 mM CaCl2 6,38 (pH 7.0, ayarlama gerektirmez) ile kullanımdan 5 dakika önce ilave edilir.
  4. Mezenterik arteri alın (tipik olarak 6-8 mm çapında) ve damar lümenini dikey olarak açmak için makasla uzunlamasına kesin.
  5. İğneler kullanarak, kabı dört köşedeki siyah balmumu üzerine takın ve intimayı açıkta bırakın (Şekil 1B).
  6. İntima 1 mL önceden ısıtılmış sindirim tamponu ekleyin. Steril bir neşter alın ve kabın lümenini yavaşça iki kez kazıyın.
    NOT: Bu prosedürün amacı, pratik gerektirebilecek intimal tabakayı ayrıştırmaktır. Endotelin çıkarılması için yeterli kuvvetin uygulanması gerekir, ancak daha derin doku katmanlarının da çıkarılması kadar değil, bu da EC temsilini azaltacaktır.
  7. Sindirim tamponunu 5 mL'lik bir tüpe aktarın. Kalan hücreleri toplamak ve 5 mL tüpe eklemek için intima ve pipete 1 mL sindirim tamponunu dikkatlice yukarı ve aşağı ekleyin. Hücreleri 37 °C'de inkübe edin, 5 dakika boyunca 150 rpm'de döndürün.
  8. Enzimatik reaksiyonu söndürmek için hücre süspansiyonuna 2 mL M199 ortamı (veya scRNA-sekq ile devam ediyorsa D-PBS) ekleyin. Nazikçe karıştırın ve 4 °C'de, 600 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  9. Süpernatantı çıkarın ve tüm hücrelerin adım 1.8'de pelette yakalanıp yakalanmadığını gözlemlemek için süpernatantı bir kontrol olarak kültüre ayrı ayrı saklayın. Hücre peletini 1 mL M199 ortamında (veya scRNA-seq ile devam ediyorsa D-PBS) yeniden askıya alın.
  10. 10 μL tripan mavisini 10 μL hücre stoğu ile karıştırarak hücre canlılığını değerlendirin. Hücre morfolojisini gözlemleyin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
    NOT: Bu noktada, hücreler protein veya RNA niceliği için kullanılabilir veya standart protokoller39 izlenerek EC kültür ortamı kullanılarak in vitro olarak kültürlenebilir. Alternatif olarak, bir sonraki bölümde açıklandığı gibi sıralama için hazırlanabilirler.
  11. Kültür için, 6 delikli bir plakanın iki kuyusunu, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 500 μL ataşman reaktifini kuyucuklara pipetleyerek kaplayın. Ataşman reaktifinin çıkarılmasından ve steril D-PBS ile yıkandıktan sonra, tam hücre stoğunu bir kuyuya dağıtın ve süpernatant ikinci kuyuya kontrol olarak tutulur.

2. ScRNA-seq çalışmaları için hazırlık (tahmini süre: 3-4 saat)

  1. Hücre stoğunu 4 °C'de 1.11. adımdan itibaren 5 dakika boyunca 600 x g'ye santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve peleti bir P1000 pipet ve geniş delikli uç ile D-PBS'de 1 mL'lik %0,04 sığır serum albümini (BSA) içinde nazikçe yeniden askıya alın. Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için iyice karıştırın.
  2. Hücre kalıntılarını gidermek için çözeltiyi 40 μm'lik bir süzgeçten geçirin. Enkaz kalırsa, ikinci bir süzgeçten D-PBS'de% 0.04 BSA'lık 4 mL'ye geçin.
  3. 4 °C'de santrifüj, 5 dakika boyunca 600 x g. Süpernatantı çıkarın ve geniş delikli pipet ucuna sahip bir P1000 pipet kullanarak peleti D-PBS'de %0,04 BSA'lık 500 μL'de yeniden askıya alın. Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için iyice karıştırın.
  4. 10 μL hücre stoğunu 10 μL tripan mavisi ile karıştırarak hücre canlılığını değerlendirin. Bir hemositometre kullanarak, morfolojiyi gözlemleyin, kümesiz tek hücreli bir süspansiyon olup olmadığını belirleyin, doku kalıntılarını kontrol edin ve canlı ve ölü hücrelerin sayısını hesaplayın.
  5. Hücreler kümelenirse veya döküntü kalırsa, D-PBS'de% 0.04 BSA ile yıkamayı tekrarlayın veya tekrar 40 μm süzgeçten geçirin.
    NOT: Bu, verimi azaltacak olsa da, optimum dizileme için hücrelerin temiz bir tek hücreli süspansiyonda bulunması önemlidir.
  6. Tek hücreli süspansiyon scRNA-seq için kullanılabilir.

3. Uzamsal transkriptom profilleme (tahmini süre: 3-4 saat)

  1. Metal bir kutuya isopentan (2-metilbütan) ekleyin ve sıvı azot (LN 2) veya kuru buzda soğutun (LN2, sıcaklığı kuru buzdan daha düşük getireceği için tercih edilir). Kabarcıklar oluşturmamaya ve görünenleri çıkarmaya özen göstererek etiketli plastik kriyokalıpların kuyularına optimum kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) dökün. Cryomold'u soğuması için kuru buz üzerinde bırakın.
  2. Geminin 1 cm uzunluğunda en az iki koronal bölümü kesin. Uzun (12") forseps kullanarak, dokuyu donana kadar isopentana batırın. Dokuyu OCT'ye oryantasyonda, merkezde görülebilen lümen ile hızlı bir şekilde batırın. Herhangi bir kabarcığı, özellikle de dokunun yanındakileri çıkarmaya özen gösterin.
  3. Uzun (12") forseps kullanarak, kriyokalıpları kavrayın ve metal teneke kutuda tutun. Kalıpların tabanı sıvı içinde olmalıyken, isopentanın doku üzerinden geçmesine izin vermek için çok derin olmamalıdır. Donmayı gözlemleyin, OCT 1-2 dakika içinde dışarıdan giderek beyazlaşacaktır.
  4. Bu bölümleri -80 °C'de kapalı bir kapta 6 aya kadar saklayın.
    NOT: Numuneleri her zaman kuru buz üzerinde tutun ve birden fazla donma-çözülme döngüsüne izin vermeyin. Bu doku histolojik analiz, RNA / DNA floresan in situ hibridizasyon (FISH) veya şimdi tanımlanacak olan uzamsal transkriptomikler için kullanılabilir.
  5. Kriyostat sıcaklığını hazne için -20 °C'ye ve numune kafası için -10 °C'ye ayarlayın. OCT gömülü kap bölümlerini, bıçakları, fırçaları ve slaytları kriyostatta yaklaşık 30 dakika boyunca -20 ° C'ye dengeleyin. Denge kurarken, makineyi ve bıçak da dahil olmak üzere bölümlere temas edebilecek tüm ekipmanı% 70 etanol ve ardından RNase dekontaminasyon çözeltisi ile temizleyin.
  6. Dairesel kriyostat bloğuna az miktarda OCT dağıtarak ve donmadan önce numuneyi üstüne yerleştirerek numuneyi takın. Bloğu numune kafasının ortasına yerleştirin ve soldaki uzun siyah bir tutamak kullanarak bloğu yerine vidalayın. Gemiyi çevreleyen fazla OCT'yi kesin.
  7. Kesme kalınlığını kriyostatta 10 μm'ye ayarlayarak, yaklaşık 60 bölüm kesin ve bunları önceden soğutulmuş 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Bu bölümler RNA kalitesini değerlendirmek için kullanılacaktır. Kriyostattan çıkarıldıktan sonra, bölümler tamamen çözülene kadar derhal 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi ve vorteks ekleyin.
  8. 200 μL kloroform ekleyin ve çözelti çilekli bir milkshake'e benzeyene kadar karıştırın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 11.200 x g'de santrifüj.
  9. Sulu fazı toplayın (beyaz ve pembe tabakaların üstündeki berrak faz) ve buna 500 μL izopropanol ekleyin. Tüpleri 10 defadan fazla ters çevirerek karıştırın ve en az 20 dakika boyunca -80 ° C'ye yerleştirin.
  10. 4 °C'de 10 dakika boyunca 11.200 x g'de santrifüj. Saflaştırılmış RNA peletini 5 μL RNaz içermeyen suda çözün. RNA Bütünlük Numarasını (RIN) inceleyin.
    NOT: RIN ≥ 7 içeren numuneler tercih edilir, ancak RIN ≥ 6 kabul edilebilir. RNA çözünmesi için doku kesitlerinin sayısı ve çözelti hacmi, doğru RIN değerlendirmesine izin vermek için nihai RNA konsantrasyonunun RIN fonksiyon aralığında olmasını sağlamak için kullanılan sisteme bağlı olarak optimizasyon gerektirebilir.
  11. Ticari olarak temin edilebilen doku optimizasyonu veya gen ekspresyon slaytlarına geçmeden önce düz cam slaytlar kullanarak bölümleri referans çerçeveleri içinde düzgün bir şekilde kesme ve yerleştirme alıştırması yapın. Bu, düz cam bir slayt üzerine 6,5 mm x 6,5 mm kareler çizerek, kriyostatta -20 ° C'ye kadar soğutularak ve bu yakalama alanına bölümler yerleştirilerek elde edilebilir.
  12. 10 μm'lik bölümleri yuvarlanmayı önleyici plaka ile yerinde kesin, çevirin ve bölümü çevreleyen OCT boyunca hafifçe dokunarak dikkatlice düzleştirin.
  13. RNaz içermeyen kriyostat fırçaları kullanarak, doku bölümünü sadece çevreleyen OCT'yi kullanarak kare içine yerleştirin. bölümü slayta eritmek için hemen bir parmağınızı (eldivenlerde) yakalama alanının arka tarafına yerleştirin.
  14. Bölüm yapıştırıldıktan sonra, bölümün donmasına izin vermek için sürgüyü kriyobar üzerine yerleştirin. Doku katlanmasını ve dokunun referans çerçevesinin sınırlandırılmış kenarlarını kaplamasını önlemek için özen gösterilmelidir. Gerekirse, kap bölümünün 6,5 mm x 6,5 mm çerçeveye sığdığından emin olmak için bir bıçak kullanarak dokuyu lümen boyunca yarıya veya çeyreklere bölün.
  15. Doku optimizasyonu veya gen ekspresyon slaytlarına 3.12-3.14'e göre 10 μm doku kesiti kesin. Slaytı kuru buz üzerine yerleştirilmiş bir slayt postalayıcısına aktarın. Yayınlanan uzamsal protokoller33,34'e devam etmeden önce slaytları -80 °C'de 4 haftaya kadar saklayın.

4. Veri analizini sıralama (tahmini süre: yazılıma aşinalığa bağlı olarak 1 haftaya kadar)

NOT: Yalnızca uzamsal transkriptomik analiz için, adım 4.8'e atlayın. scRNA-seq verileri, insan hg38 referans transkriptomu ile hizalanmış standartlaştırılmış boru hattı kullanılarak işlenir. R paketi Seurat (v3.2.2), yayınlanan kılavuz40'ı izleyerek scRNA-seq verilerini analiz etmek için kullanılır.

  1. İyi kurulmuş kalite kontrol metriklerini kullanarak filtreleyin: Çok yüksek sayıda gen içeren nadir hücreler (potansiyel olarak katlar) ve yüksek mitokondriyal yüzdelere sahip hücreler (düşük kaliteli veya ölmekte olan hücreler genellikle mitokondriyal kontaminasyon gösterir) çıkarılır.
  2. Log-normalleştirmeye kıyasla örnek tümleştirmesini geliştirmek için bir yöntem olan "sctransform"u kullanarak verileri normalleştirin. Bu normalleştirilmiş veriler boyutsallık azaltma ve kümeleme için kullanılırken, günlük-normalleştirilmiş ekspresyon seviyeleri, hücre tipi sınıflandırması41 gibi gen ekspresyon seviyelerine dayalı analiz için kullanılır.
  3. Hücre tipi başına belirteç genlerini seçin, örneğin, trombosit endotel hücre adezyon molekülü-1 (PECAM1) ve von Willebrand faktörü (VWF), fibroblastlar için lumican (LUM) ve prokollajen C-Endopeptidaz Arttırıcı (PCOLCE), makrofajlar için B hücresi translokasyon geni 1 (BTG1) ve CD52, monositler için C1QA ve C1QB ve miyozin ağır zincir 11 (MYH11) ve vasküler düz kas hücreleri için transgelin (TAGLN)36.
  4. Her hücre türü42 ile ilişkili ortalama ifade düzeyine sahip tek bir işaretçiye sahip tek bir işaretçiye sahip olmak için her bir işaretçi çifti arasındaki tek hücrelerdeki ortalama ifade düzeyini hesaplayın.
  5. Hücreleri iki kümeye ayırmak için tek hücrelerdeki her bir işaretleyicinin ekspresyon verilerine iki bileşenli bir Gauss Karışım Modeli (GMM) uygulayın, yani işaretleyiciyi yüksek oranda ifade eder ve işaretleyiciyi düşük bir şekilde ifade eder. Bu şekilde, her işaretleyici için, her bir hücre iki bileşenden birine atanır42.
  6. Her kümeye bir hücre tipi atamak için bir Fisher'ın tam testi olan işaretleyici genler kümesi için istatistiksel zenginleştirme kullanın. Bunu yaparak, küme başına her biri bir hücre türüne karşılık gelen bir dizi p-değeri elde edilir. En düşük p değerine sahip hücre türü bu kümeye atanır.
  7. Space Ranger boru hatlarını kullanarak uzamsal transkriptomik verileri işleyin, hg38 insan transkriptomuna toplam hizalanmış okumalar, medyan Benzersiz Moleküler Tanımlayıcı (UMI) sayısı veya nokta başına35 gen dahil olmak üzere mekansal barkodlamayı kaldırma ve kalite kontrol (QC) metriklerinin oluşturulmasıyla sonuçlanır.
    NOT: R paketi Seurat (v3.2.2), yayınlanan kılavuz40'ı izleyerek Space Ranger tarafından işlenen verileri analiz etmek için kullanılır.
  8. Dokunun heterojenliği ve noktalardaki sayımlardaki çok yüksek varyans göz önüne alındığında, log-normalizasyona kıyasla aşağı akış analizini iyileştirdiği gösterilen bir yöntem olan "sctransform" kullanarak verileri normalleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli aşağı akış tahlillerinde kullanılmak üzere mekanik ve enzimatik ayrışma veya kriyoprezervasyonun bir kombinasyonu kullanılarak mezenterik arterden gelen EC'lerin analizi burada gösterilmiştir (Şekil 1). ECs, aşağıdaki adımlar kullanılarak mezenterik arterlerde profillenebilir: A) kollajenaz sindirimi ile birlikte intimadan kültür hücrelerine mekanik ayrışma; B) scRNA-seq için tek hücreli süspansiyon üretimi; veya C) arterin kesitleri, uzamsal transkriptomun profilini çıkarmak için kr...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan iş akışı, tek hücreli ve uzamsal çözünürlükle tek bir insan arteri parçasından EC'lerin profilini çıkarmak için bir dizi tekniği detaylandırmaktadır. Protokolde birkaç kritik adım ve sınırlayıcı faktör vardır. Transkriptom profillemesinin bir anahtarı, dokunun tazeliği ve RNA bütünlüğüdür. RNA bozulmasını en aza indirmek için işlemeden önce dokuları buz üzerinde mümkün olduğunca korumak önemlidir. Tipik olarak, ölüm sonrası dokular ölüm zamanından 8-14 saat sonra işlenir. Bununla birlikte, donörlerden ekstraksiyo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.Z., Genemo, Inc.'in kurucusu ve yönetim kurulu üyesidir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH hibeleri R01HL108735, R01HL145170, R01HL106089 (Z.B.C.'ye) tarafından desteklenmiştir; DP1DK126138 ve DP1HD087990 (S.Z.'ye); bir Ella Fitzgerald Vakfı hibesi ve bir Wanek Aile Projesi (Z.B.C.'ye); ve bir İnsan Hücresi Atlası tohum ağı hibesi (Z.B.C. ve S.Z.'ye). Bu yayında bildirilen araştırmalar, P30CA033572 ödül numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenen Umut Şehri'ndeki Bütünleştirici Genomik Çekirdeğinde gerçekleştirilen çalışmaları içeriyordu. Yazarlar, insan dokularının izolasyonu için Umut Şehri'ndeki adacık nakli ekibinden Dr. İsmail Al-Abdullah ve Dr. Meirigeng Qi'ye, scRNA-seq analizindeki yardımları için Umut Şehri'nden Dr. Dongqiang Yuan'a ve Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi Kardiyovasküler Patoloji Bölümü'nden Dr. Marc Halushka'ya vasküler histoloji konusundaki paha biçilmez görüşleri için teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL mikro santrifüj tüpüUSA Scientific1615-5500
10 cm çanakGenesee Scientific25-202
23G iğnelerBD305145
2-metilbütanThermo FisherAC327270010
40 & mikro; m süzgeçFisher14100150
4200 TapeStation SistemiAgilent TechnologiesG2991BA
5 mL tüpThermo Fisher14282300
6 oyuklu plakaGreiner Bio-One07-000-208
Bağlanma faktörüHücre Uygulamaları123-500Protokolde ek reaktif
Siyah balmumuHerhangi bir ticari siyah balmumu kullanılabilir
Sığır serum albümini ısı şoku ile tedavi edilmişFisherBP1600-100
CaCl2< / sub>FisherBP510
SantrifüjEppendorf
KloroformFisherC607
Kollajenaz DRoche11088866001
KriyostatLeica
Kriyostat fırçaları
D-GlikozFisherD16-1
Dimetil sülfoksitFisherMT25950CQC
Dispase IIRoche4942078001Protokolde bakteri türevi proteaz
Tek Kullanımlık Güvenlik NeşterleriMyco Enstrümantasyon6008TR-10
D-PBSThermo Fisher14080055
EtanolFisherBP2818-4
Fetal sığır serumuFisher10437028
HemositometreFisher267110
HEPESSigma AldrichH3375-100g
Yüksek hassasiyetli D1000 numune tamponuAgilent Technologies5067-5603
Yüksek hassasiyetli D1000 ekran bandıAgilent Technologies5067-5584
İnkübatör37 ° C'de Tutuldu; C% 5 CO2< / sub>
İzopropanolFisherBP26324
KClFisherP217-3
Sıvı nitrojen
Ortamı 199Sigma AldrichM2520-10X
Metal kutu
MikroskobuLeicaHücre morfolojisini
Mikrovasküler endotel kültür ortamıHücre Uygulamaları111-500
NaClFisherS271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital çalkalayıcıEppendorf
Optimal Kesme Sıcaklığı bileşiğiFisher4585
Plastik kriyokalıplarFisher22363553
RNA ekran bandıAgilent Technologies5067-5576
RNA ekran Bant örnek tamponuAgilent Technologies5067-5577
RNase ZAPThermo FisherAM9780
RNaz içermeyen suTakaraRR036BRNaz içermeyen su (2) kit içinde
Steril 12" uzun forsepsFST91100-16
Steril ince forsepsFST11050-10
Steril ince makasFST14061-11
Superfrost PLUS Altın SlaytlarFisher1518848
Trypan BlueCorningMT25900CI
TrypLE Express Enzim (1X) fenol kırmızısıThermo Fisher12605010Hücre ayrışma enzimi protokol
Visium Aksesuar Kiti10X GenomicsPN-1000215
Visium Ağ Geçidi Paketi, 2rxns10X GenomicsPN-1000316
Visium Uzamsal Gen İfadesi Slayt & Reaktif Kiti, 4 rxns10X GenomikPN-1000184
değerlendirmek için TRIzol reaktifi Fisher 15596018

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thorin, E., Shreeve, S. M. Heterogeneity of vascular endothelial cells in normal and disease states. Pharmacology & Therapeutics. 78 (3), 155-166 (1998).
  2. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  3. Hillen, H. F., Melotte, V., van Beijnum, J. R., Griffioen, A. W. Endothelial cell biology. Angiogenesis Assays: A Critical Appraisal of Current Techniques. , John Wiley & Sons. Chichester, West Sussex, UK. 1-38 (2007).
  4. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
  5. Kalucka, J., et al. Single-cell transcriptome atlas of murine endothelial cells. Cell. 180 (4), 764-779 (2020).
  6. Tang, X., et al. Suppression of endothelial AGO1 promotes adipose tissue browning and improves metabolic dysfunction. Circulation. 142 (4), 365-379 (2020).
  7. Ni, C. W., Kumar, S., Ankeny, C. J., Jo, H. Development of immortalized mouse aortic endothelial cell lines. Vascular Cell. 6 (1), 7(2014).
  8. Kalluri, A. S., et al. Single-cell analysis of the normal mouse aorta reveals functionally distinct endothelial cell populations. Circulation. 140 (2), 147-163 (2019).
  9. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nature Medicine. 25, 1280-1289 (2019).
  10. Widyantoro, B., et al. Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition. Circulation. 121 (22), 2407-2418 (2010).
  11. Zeisberg, E. M., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis. Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).
  12. Stuart, T., Satija, R. Integrative single-cell analysis. Nature Reviews Genetics. 20, 257-272 (2019).
  13. Paik, D. T., et al. Single-cell RNA sequencing unveils unique transcriptomic signatures of organ-specific endothelial cells. Circulation. 142 (19), 1848-1862 (2020).
  14. Palikuqi, B., et al. Adaptable haemodynamic endothelial cells for organogenesis and tumorigenesis. Nature. 585 (7825), 426-432 (2020).
  15. The Tabula Muris Consortium. et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  16. Hezroni, H., et al. Principles of long noncoding RNA evolution derived from direct comparison of transcriptomes in 17 species. Cell Reports. 11 (7), 1110-1122 (2015).
  17. Washietl, S., Kellis, M., Garber, M. Evolutionary dynamics and tissue specificity of human long noncoding RNAs in six mammals. Genome Research. 24 (4), 616-628 (2014).
  18. Chen, J., et al. Evolutionary analysis across mammals reveals distinct classes of long non-coding RNAs. Genome Biology. 17 (19), 19(2016).
  19. Drake, B. L., Loke, Y. W. Isolation of endothelial cells from first trimester decidua using immunomagnetic beads. Human Reproduction. 6, 1156-1159 (1991).
  20. McDouall, R. M., Yacoub, M., Rose, M. L. Isolation, culture and characterization of MHC class II-positive microvascular endothelial cells from the human heart. Microvascular Research. 51, 137-152 (1996).
  21. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protocols. 2 (2), 100489(2021).
  22. Springhorn, J. P., Madri, J. A., Squinto, S. P. Human capillary endothelial cells from abdominal wall adipose tissue: isolation using an anti-pecam antibody. In Vitro Cellular Developmental Biology Animal. 31 (6), 473-481 (1995).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C. Immunomagnetic purification of human microvessel endothelial cells using Dynabeads coated with monoclonal antibodies to PECAM-1. European Journal of Cell Biology. 62 (2), 451-454 (1993).
  24. Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nature Methods. 18 (1), 9-14 (2021).
  25. Maynard, K. R., et al. Transcriptome-scale spatial gene expression in the human dorsolateral prefrontal cortex. Nature Neuroscience. 24 (3), 425-436 (2021).
  26. Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
  27. Bäckdahl, J., et al. Spatial mapping reveals human adipocyte subpopulations with distinct sensitivities to insulin. Cell Metabolism. 33 (9), 1869-1882 (2021).
  28. Wang, J., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).
  29. Codeluppi, S., et al. Spatial organization of the somatosensory cortex revealed by osmFISH. Nature Methods. 15, 932-935 (2018).
  30. Eng, C. H. L., et al. Transcriptome-scale super-resolved imaging in tissues by RNA seqFISH. Nature. 568, 235-239 (2019).
  31. Eng, C. H. L., Shah, S., Thomassie, J., Cai, L. Profiling the transcriptome with RNA SPOTs. Nature Methods. 14, 1153-1155 (2017).
  32. Rodriques, S. G., et al. Slide-seq: a scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution. Science. 363 (6434), 1463-1467 (2019).
  33. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  34. Rao, A., et al. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  35. Sachidanandam, K., et al. Differential effects of diet-induced dyslipidemia and hyperglycemia on mesenteric resistance artery structure and function in type 2 diabetes. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 328 (1), 123-130 (2009).
  36. Calandrelli, R., et al. Stress-induced RNA-chromatin interactions promote endothelial dysfunction. Nature Communications. 11 (1), 5211(2020).
  37. Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in Type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), 23337(2011).
  38. Asterholm, I., et al. Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling. Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).
  39. Marin, V., et al. Endothelial cell culture: protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 254 (1-2), 183-190 (2001).
  40. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  41. Hafemeister, C., Satija, R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biology. 20 (1), 296(2019).
  42. Bonnycastle, L. L., et al. Single-cell transcriptomics from human pancreatic islets: sample preparation matters. Biology Methods Protocols. 5 (1), (2020).
  43. Espitia, O., et al. Implication of molecular vascular smooth muscle cell heterogeneity among arterial beds in arterial calcification. PLoS One. 13 (1), 0191976(2018).
  44. Engelbrecht, E., et al. Sphingosine 1-phosphate-regulated transcriptomes in heterogenous arterial and lymphatic endothelium of the aorta. eLife. 9, 52690(2020).
  45. Hu, H., et al. Single-cell transcriptomic atlas of different human cardiac arteries identifies cell types associated with vascular physiology. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1408-1427 (2021).
  46. van Beijnum, J., et al. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  47. Jin, S., et al. Inference and analysis of cell-cell communication using CellChat. Nature Communications. 12 (1), 1088(2021).
  48. Efremova, M., Vento-Tormo, M., Teichmann, S. A., Vento-Tormo, R. CellPhoneDB: inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit ligand-receptor complexes. Nature Protocols. 15 (4), 1484-1506 (2020).
  49. Hu, Y., Peng, T., Gao, L., Tan, K. CytoTalk: de novo construction of signal transduction networks using single-cell RNA-Seq data. Science Advances. 7 (16), (2020).
  50. Sanchez-Ferras, O., et al. A coordinated progression of progenitor cell states initiates urinary tract development. Nature Communications. 12 (1), 2627(2021).
  51. Mantri, M., et al. Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis. Nature Communications. 12 (1), 1771(2021).
  52. Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
  53. Moffit, J. R., et al. High-throughput MERFISH. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 11046-11051 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mesenteric ArteryCell IsolationTranscriptome ProfilingSingle Cell RNASpatial TranscriptomicsCell ViabilityImmunofluorescence StainingRNA ExtractionHematoxylin Eosin Staining

İlgili makaleler