Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Adipositle İlişkili Bozuklukları İncelemek için İnsan iPSC'lerinin Saf Bir Adiposit Popülasyonuna Sağlam Farklılaşması

4.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/63311

⸱

9 Şubat 2022

 ,  , 
1Diabetes Research Center, Qatar Biomedical Research Institute (QBRI), Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation (QF), 2College of Health and Life Sciences, Hamad Bin Khalifa University (HBKU), Qatar Foundation

Bu makalede

Özet

Protokol, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) saf bir adiposit popülasyonunun üretilmesine izin verir. Retinoik asit, iPSC'leri adiposit üretmek için kullanılan mezenkimal kök hücrelere (MSC'ler) ayırmak için kullanılır. Daha sonra, saf adipositler elde etmek için Nil kırmızısı boyamaya dayalı bir sıralama yaklaşımı kullanılır.

Özet

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisindeki son gelişmeler, adipositler de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinin üretilmesine izin vermiştir. Bununla birlikte, mevcut farklılaşma yöntemleri düşük verimliliğe sahiptir ve homojen bir adiposit popülasyonu üretmemektedir. Burada, mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) yüksek verimde üretmek için all-trans retinoik bazlı bir yöntem kullanarak bu sorunu aşıyoruz. Hücre proliferasyonunu, hayatta kalmayı ve yapışmayı yöneten yolları düzenleyerek, farklılaşma stratejimiz, saf bir multipotent MSC popülasyonuna farklılaşan embriyonik cisimlerin (EB'ler) verimli bir şekilde üretilmesini sağlar. Bu yöntemle üretilen yüksek sayıda MSC, adiposit üretmek için ideal bir kaynak sağlar. Bununla birlikte, adiposit farklılaşmasından kaynaklanan örnek heterojenliği bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, FACS kullanarak lipit taşıyan olgun adipositleri saflaştırmak için Nil kırmızısı bazlı bir yöntem kullandık. Bu sıralama stratejisi, adipositle ilişkili metabolik bozuklukları, azaltılmış numune heterojenliği ve gelişmiş hücre işlevselliği ile bir adiposit havuzu kullanarak modellemek için güvenilir bir yol oluşturmamızı sağladı.

Giriş

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), adipositler, osteositler ve kondrositler gibi mezodermal kökenli hücrelerin üretilmesi için etkili bir geçici kaynak görevi görür ve bu hücreler kendi genetik bozukluklarını modellemek için daha fazla kullanılabilir. Bununla birlikte, önceki yaklaşımlar, bu MSC'lerin yetişkin dokulardan elde edilmesine dayanıyordu 1, bu da onları donörlerden yüksek sayılarda elde etme zorluğunu ve onları suboptimal in vitro kültür koşullarında işlevsel olarak canlı tutmanın sınırlandırılmasını getirdi 1,2. Bu engeller, in vitro MSC'ler üretmek için bir protokole sahip olma konusunda büyük bir talep yaratmıştır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), MSC özelliklerini sergileyen değerli bir MSC kaynağı olarak kullanılabilir 3,4,5. iPSC'lerden türetilen MSC'ler çeşitli hastalıklarda terapötik bir seçenek olarak kullanılabilir. Ayrıca, iPSC'lerden türetilen MSC'lerin adiposit üretme yeteneği, onları insan adipogenezi, obezite ve adiposit ile ilişkili bozuklukları incelemek için değerli bir in vitro insan modeli haline getirir.

Adipositlerin mevcut farklılaşma protokolleri iki gruba ayrılabilir, bunlardan biri kimyasal veya protein bazlı kokteyller kullanılarak adipositlerin farklılaştırılmasını içerir ve sonuçta %30-%60 oranında 6,7,8,9 verim sağlarken, diğeri %80-%90 verim vermek üzere adipositlerin gelişimini yöneten anahtar transkripsiyon faktörlerinin sağlam indüksiyonu için genetik manipülasyonu içerir. 11. Bununla birlikte, genetik manipülasyon, adiposit farklılaşmasının doğal sürecini özetlemez ve genellikle adipogenez sırasında gelen ince paradigmaları maskeler, bu da hastalık modelleme amaçları için etkisiz hale getirir12,13. Bu nedenle, Nil kırmızısı kullanarak lipit taşıyan adipositleri floresan olarak etiketleyerek kimyasal olarak türetilmiş olgun adipositleri olgunlaşmamış olanlardan ayırmanın bir yolunu sunuyoruz.

Burada, iPSC'lerden türetilmiş embriyoid cisimlerin (EB'ler) all-trans retinoik asit ile geçici inkübasyonunu içeren bir protokol sunuyoruz ve bu da adipositlerin14 üretilmesinde daha fazla kullanılabilecek çok sayıda hızla çoğalan MSC'ler üretiyor. Ayrıca, kimyasal olarak türetilmiş olgun adipositleri, lipofilik bir boya kullanarak lipit damlacıklarını floresan olarak etiketleyerek heterojen farklılaşma havuzundan ayırmanın bir yolunu sunuyoruz; Nil kırmızısı. Bu, adipositle ilişkili metabolik bozuklukları doğru bir şekilde modellemek için gelişmiş işlevselliğe sahip saf bir olgun adiposit popülasyonunun oluşturulmasına izin verecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışma, ilgili kurumsal araştırma etik komitesi tarafından onaylanmış ve 1964 Helsinki Deklarasyonu'nda ve daha sonraki değişikliklerinde veya karşılaştırılabilir etik standartlarda belirtilen etik standartlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokol, HMC (no. 16260/16) ve QBRI (no. 2016-003) Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma aynı zamanda H1 ve H9 gibi hESC'ler için de optimize edilmiştir. Sağlıklı bireylerden tam bilgilendirilmiş onam alınarak kan örnekleri alındı. iPSC'ler, sağlıklı bireylerin periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) üretilir.

1. iPSC'lerin kültürü ve bakımı

  1. Kaplama matrisini nakavt-DMEM'de 1:80 oranında yeniden yapılandırarak bazal membran matris kaplı plakalar hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
  2. 500 mL kök hücre bazal ortamına 50 mL 10x kök hücre takviyesi ortamı ve 5 mL 100x penisilin-streptomisin (P / S) ekleyerek iPSC'lerin kültür ortamını hazırlayın ve kısa süreli kullanım için 4 ° C'de veya uzun süreli kullanım için -20 ° C'de saklayın.
  3. Plakaları 6 delikli bir plaka için kaplama matrisi-1 mL, 12 delikli bir plaka için 500 μL, 24 delikli bir plaka için 250 μL ile hizalayın ve plakayı 1-2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Bir parça iPSC'nin kültür ortamını çıkarın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında önceden ısıtın.
  5. Bir şişe iPSC'yi (ESC'ler veya iPSC'ler) 37 °C'lik bir su banyosunda çözün ve 2-3 mL kültür ortamı içeren 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
  6. Tüpü oda sıcaklığında (RT-23 °C) 4 dakika boyunca 120 x g'de santrifüjleyin.
  7. Süpernatantı çıkarın ve 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632) ile desteklenmiş 2 mL taze kültür ortamı ekleyin. Hücreleri matris kaplı 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin ve plakayı 37 ° C'ye yerleştirin.
  8. 24 saat sonra, ortamı çıkarın ve taze kültür ortamıyla değiştirin.
  9. Hücreler% 80-90 akıcılığa ulaşana kadar medyayı her gün değiştirin.
  10. Akıcılığa ulaştıktan sonra, aşağıda özetlenen adımları izleyerek hücreleri geçin.
    1. Ortamı çıkarın ve hücreleri Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) ile yıkayın.
    2. iPSC'lerin ayrışma reaktifini ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu)-6 delikli bir plaka kuyusu için 500 μL, 24 delikli bir plaka kuyusu için 250 μL ve 37 ° C'de 1 dakika boyunca inkübe edin.
    3. Ayrışma reaktifini çıkarın ve hücreleri 37 ° C'de 1 dakika kuru inkübe edin.
    4. 6 delikli bir plaka kuyusu için 1 mL ve 24 delikli bir plaka kuyusu için 250 μL kültür ortamı kullanarak hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve 4 dakika boyunca 120 x g'de santrifüj.
    5. Hücreleri kültür ortamında-2 mL, 6 delikli bir plaka kuyucuğu için ve 500 μL, 10 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 24 delikli bir plaka kuyucuğu için yeniden askıya alın ve bunları %40 akıcılıkta taze matris kaplı plakalara plakalayın.

2. iPSC'nin MSC'lere farklılaşması

  1. Düşük glukozlu DMEM + piruvata %15 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 P/S ekleyerek MSC diferansiyasyon ortamını hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
  2. % 80 akıcılığa ulaştıktan sonra, aşağıda özetlenen adımları izleyerek embriyoid cisim (EB) oluşumu için iPSC'leri kullanın.
    1. Hücreleri DPBS ile yıkayın ve 6 delikli bir plaka kuyusu için ayrışma ortamı / EDTA-500 μL, 24 delikli bir plaka kuyusu için 250 μL ile inkübe edin.
    2. 1 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin, ayrışma reaktifini aspire edin ve hücreleri 1 dakika daha 37 ° C'de tutun. MSC farklılaşmasını başlatmak için ~ 10-12 x 106 hücre gereklidir.
    3. Hücreleri kültür ortamını kullanarak 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın. Hücrelerin tekleşmesini önlemek ve EB oluşumuna izin vermek için toplarken çok nazik olduğunuzdan emin olun. Hücreleri 4 dakika boyunca 120 x g'de santrifüj edin.
    4. 10 μM ROCK inhibitörü içeren 3 mL MSC farklılaşma ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın.
    5. 0,5 mL/kuyuyu 24 delikli ultra düşük bir bağlantı plakasında karıştırın ve dağıtın.
      NOT: Ultra düşük bağlantı plakasının kullanılması, hücrenin yüzeydeki bağlantılarından ziyade EB'lere toplanmasını teşvik edecektir.
    6. Plakayı inkübatöre 37 ° C'de yerleştirin.
  3. 24 saat sonra, aşağıda belirtilen adımları izleyerek elde edilen EB'leri yüksek retinoik asit (RA) tedavisi ile indükleyin.
    1. 3 mL MSC farklılaştırma ortamına 10 μM RA ekleyin. EB'leri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 15 dakika boyunca yerleşmelerine izin verin.
    2. Süpernatantı EB'lerden çıkarın ve 10 μM RA ile desteklenmiş MSC farklılaştırma ortamı ekleyin.
    3. Yavaşça askıya alın ve aynı 24 delikli ultra düşük bağlantı plakasına 0,5 mL/kuyu dağıtın.
    4. Plakayı inkübatöre 37 ° C'de yerleştirin. EB'leri sonraki 48 saat boyunca rahatsız etmeyin.
    5. 48 saat sonra, EB'leri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 15 dakika boyunca yerleşmelerini sağlayın.
    6. Süpernatantı EB'lerden çıkarın ve 0,1 μM RA ile desteklenmiş MSC farklılaştırma ortamı ekleyin.
    7. Yavaşça askıya alın ve aynı 24 delikli ultra düşük bağlantı plakasına 0,5 mL/kuyu dağıtın.
    8. Plakayı inkübatöre 37 ° C'de yerleştirin. EB'leri sonraki 48 saat boyunca rahatsız etmeyin.
  4. Aşağıda özetlenen adımları izleyerek hücrelere eklenen RA'yı kaldırın.
    1. Son RA tedavisinden 48 saat sonra, EB'leri toplayın ve 15 dakika boyunca yerleşmelerine izin verin.
    2. Süpernatantı çıkarın ve sitokinler olmadan DMEM düşük glikozlu ortam ekleyin.
    3. Yavaşça yeniden askıya alın ve 24 delikli ultra düşük bir bağlantı plakasına 0,5 mL/kuyu dağıtın. Plakayı inkübatöre 37 ° C'de yerleştirin.
  5. Aşağıda özetlenen adımları izleyerek iPSC'lerden türetilmiş EB'leri plakalayın.
    1. Önceki adımdan 48 saat sonra (adım 2.4), EB'leri 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 15 dakika boyunca yerleşmelerine izin verin.
    2. Süpernatantı çıkarın ve 2 mL'lik taze MSC farklılaştırma ortamında yeniden askıya alın.
    3. Bir bazal membran matris kaplı 6 delikli plakanın iki kuyucuğuna aktarın.
    4. Medyayı 5 gün daha ek olarak her gün değiştirin.
    5. 5 gün sonra, harcanan ortamı çıkarın ve 2.5 ng / mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) içeren taze MSC farklılaşma ortamı ile değiştirin.
  6. Kaplamalı EB'leri% 80-90 akıcılığa ulaştıklarında, aşağıda özetlenen adımları izleyerek geçirin.
    1. Hücreleri DPBS ile yıkayın, 6 delikli bir plaka kuyucuğu için tripsin-EDTA-500 μL ekleyin ve hücreleri 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    2. MSC farklılaşma ortamını kullanarak hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve 4 dakika boyunca 750 x g'de döndürün.
    3. MSC farklılaşma ortamında 2,5 ng/mL bFGF ile yeniden askıya alın ve bazal membran matris kaplı plakalardaki hücreleri 1:3 oranında plakalayın.
    4. Hücreler% 70-80 akıcılığa ulaştığında geçişi tekrarlayın. 2-3 pasajla 3-6 milyon hücre kazanması beklenir.

3. iPSC'lerden türetilen MSC'lerin akış sitometrisi analizi

NOT: MSC farklılaşmasının etkinliği için 2-3 pasajdan geçtikten sonra hücrelere erişilmelidir. Hücreler MSC diferansiyasyon belirteçleri-CD44, CD73, CD90 ve CD105'i %90'dan fazla verimlilikle eksprese ederse ve yüksek düzeyde hematopoetik belirteçler-CD14, CD19, CD34 ve CD45 eksprese etmezlerse farklılaşma başarılı kabul edilecektir. Bu belirteçlerin verimliliğine aşağıdaki adımlar izlenerek erişilebilir.

  1. Yukarıda özetlenen adımları kullanarak hücreleri geçirin (adım 2.6) ve v tabanlı 96 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda 1 x 105 hücre elde edin.
  2. Plakayı 375 x g'de 4 °C'de 4 dakika boyunca santrifüjleyin.
  3. 1 μL konjuge antikor (Ab) ile 100 μL soğuk DPBS'de 1 x 105 hücreyi yeniden askıya alın (bakınız Malzeme Tablosu) ve ışığa maruz kalmayı önleyerek 30-40 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  4. 100 μL soğuk DPBS'de başka bir 1 x 105 hücreyi, konjuge Ab'nin ilgili izotip kontrolü ile 1:100 ) konsantrasyonunda tekrar askıya alın ve ışığa maruz kalmayı önleyerek 30-40 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  5. İnkübasyondan sonra, plakayı 375 x g'de 4 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj edin. Plakayı lavabonun üzerinde sallayarak süpernatantı atın.
  6. Hücreleri 100 μL soğuk DPBS'de yeniden askıya alın.
  7. Hücreleri 375 x g'de 4 °C'de 4 dakika boyunca santrifüj edin. Supernatan'ı atın.
  8. Hücreleri 200 μL soğuk DPBS'de yeniden askıya alın ve karanlık, soğuk 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplayın ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ile analiz edilene kadar buz üzerinde tutun.
  9. FACS analizi için, kalıntıları dışlamak için hücreleri yan saçılmış (SSC-A) ve ileri saçılmış (FSC-A) kullanarak dağıtın. Ayrıca, kapılı hücreleri, canlı hücre popülasyonundan çiftlerden teklileri ayırt etmek için ileri saçılma yüksekliğine (FSC-H) karşı ileri dağınık alana (FSC-A) karşı dağıtın.
    NOT: Hücreler, her belirteç için izotip kontrolünün kaymasına göre kapılıydı ve analiz için her boyanmış numuneden en az 10.000 kapılı olay kullanıldı.

4. MSC'lerin adipositlere farklılaşması

  1. Minimum esansiyel ortam (MEM)-alfaya %10 nakavt serum replasmanı (KOSR), %1 Glutamin, %1 P/S, 4.5 ng/μL glikoz ekleyerek adiposit farklılaşma bazal ortamını hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
  2. MSC'lerin %90'ın üzerinde akıcılığa ulaşmasına izin verin. Bir büyüme durması dönemine girmelerine izin vermek için onları 48 saat daha kültürlemeye devam edin.
  3. Bazal ortama 100 μg / mL 3-İzobütil-1-metilksantin (IBMX), 1 μM deksametazon, 0.2 U / mL insülin, 100 μM indometasin ve 10 μM rosiglitazon ekleyerek tam adiposit farklılaşma ortamı hazırlayın.
  4. MSC farklılaşma ortamını çıkarın ve DPBS kullanarak hücreleri yıkayın.
  5. Tam adiposit farklılaşma ortamı-6 delikli bir plaka kuyusu için 2 mL ve 12 delikli bir plaka kuyusu için 1 mL ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de inkübe edin. Tam farklılaştırma ortamını 14 gün boyunca her gün değiştirin.

5. Adipositlerin farklılaşma etkinliğinin değerlendirilmesi

  1. Farklılaşmanın 14. gününde, adiposit olgunlaşma belirteçleri, FABP4 ve adiponektin için hücreleri boyayarak farklılaşmanın etkinliğini kontrol edin.
  2. Ortamı çıkarın ve hücreleri DPBS ile yıkayın.
  3. Hücreleri% 4 paraformaldehit (PFA) - 200 μL kullanarak 24 delikli bir plakanın kuyucuğuna sabitleyin - ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
  4. PFA'yı atın ve% 0.5 ara (TBST) ile tris tamponlu salin kullanarak yıkayın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcıya yerleştirin. İşlemi iki kez tekrarlayın.
  5. Sabit hücreleri% 0.5 Triton X-100 (PBST) ile fosfat tamponlu salin ile geçirgen hale getirin ve 15-20 dakika boyunca oda sıcaklığında bir çalkalayıcıya yerleştirin.
  6. PBST'yi atın ve bloke edici tamponu (PBST'de% 5 -% 6 sığır serum albümini (BSA)-6 delikli bir plaka kuyusu için -500 μL ve 12 delikli bir plaka kuyusu için 250 μL ekleyin ve 40-60 dakika boyunca çalkalayıcıda oda sıcaklığında inkübe edin.
  7. FABP4'e karşı birincil antikorları, adiponektini% 2 -% 3 BSA'da, 1:500'lük bir konsantrasyonda seyreltin (bakınız Malzeme Tablosu). Bu antikorları yalnızca farklı hayvanlarda yetiştirilirse bir araya getirin ve plakayı gece boyunca 4 ° C'de çalkalayıcıya yerleştirin.
  8. Birincil antikorları çıkarın ve hücreleri TBST ile üç kez yıkayın (her biri 15 dakika) ve oda sıcaklığında bir çalkalayıcıya yerleştirin.
  9. Alexa Fluor ikincil antikorlarını PBST'de hazırlayın (1:500). Sekonder antikor kombinasyonlarındaki hücreleri (birincil antikorun yükseldiği türlere göre) oda sıcaklığında 60 dakika boyunca inkübe edin ve plakayı ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün.
  10. İkincil antikorları atın, TBST ile üç kez yıkayın ve plakayı çalkalayıcıya yerleştirin.
  11. Çekirdekleri lekelemek için, PBS'de seyreltilmiş 24 delikli bir plaka kuyucuğu için 1 μg / mL Hoechst 33342-200 μL ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  12. Hoechst çözeltisini atın ve hücrelere 24 delikli bir plaka kuyusu için PBS-500 μL ekleyin. Ters çevrilmiş floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilinceye kadar plakaları ışıktan kapalı tutun.

6. Nil kırmızısı kullanarak adipositlerin sıralanması

  1. DMSO'ya 1 mg/mL Nil kırmızısı stok çözeltisi ekleyerek Nil kırmızısı çalışma solüsyonunu hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. Kullanmadan hemen önce, Nil kırmızı stoğunu çözün ve 300 nM çalışma çözeltisi konsantrasyonuna ulaşmak için DPBS'de yeniden oluşturun.
  2. Adiposit farklılaşmasının 14. gününde veya sonrasında, ortamı hücrelerden atın ve DPBS kullanarak yıkayın.
  3. Nil kırmızısı çalışma solüsyonunu -6 delikli bir plakanın kuyucuğuna 1 mL- ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  4. Nil kırmızısı çözeltisini çıkarın ve 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna tripsin-EDTA -500 μL ekleyin ve 4 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  5. 15 mL'lik bir konik tüpte% 5 FBS içeren DMEM kullanarak hücreleri toplayın. 4 dakika boyunca 750 x g'de santrifüj.
  6. Süpernatantı çıkarın ve 1 x 106 hücre için DPBS-1 mL'de yeniden askıya alın. 4 dakika boyunca 750 x g'de santrifüj.
  7. Süpernatantı çıkarın ve 1 x 106 hücre için DPBS-1 mL'de yeniden askıya alın. FL1 kanalını kullanarak Nil kırmızı-pozitif hücrelerini izole etmek için bir FACS sıralayıcısı kullanın.
  8. Adiposit farklılaşma ortamındaki sıralanmış hücreleri yeniden kültüre alın veya RNA ve protein izolasyonu için sıralanmış hücreleri toplayın.
  9. Sıralanmış hücrelerden RNA'yı çıkarın ve FABP4, PPARG ve C / EBPA dahil olmak üzere adiposit farklılaşma belirteçlerinin göreceli kantitatif analizini yapın. Nil kırmızı-pozitif hücreleri, sıralanmamış hücrelere kıyasla en az iki katın gen ekspresyonunda önemli bir artış gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mezenkimal farklılaşma sırasında hücrelerin şematik ve morfolojisi: iPSC'lerin MSC'lere farklılaşması, EB oluşumu, MSC farklılaşması ve MSC genişlemesi boyunca uzanan çeşitli gelişim aşamalarını içerir (Şekil 1). Gelişimin bu aşamalarında, hücreler maruz kaldıkları farklı uyarıcı kimyasallar nedeniyle çeşitli morfolojiler kazanırlar. Farklılaşmayı başlattıktan sonra, hücreler süspansiyonla kaplanır ve çapı küçük ila orta büyüklükte iken, tanımlanmış hücre kenarlıkları ile yuvarlak olması bek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, MSC'leri yüksek verim ve verimlilikte sağlama kabiliyeti nedeniyle büyük önem taşımaktadır. MSC'lerin bu kitlesel ölçekli üretimi, iPSC'lerden türetilmiş EB'lerin 10 μM RA14,15 ile geçici inkübasyonu ile mümkün olmuştur. 10 μM RA ile geçici işlem, MSC verimini 11,2 ila 1542 kat artırdı14,15, bu protokol hem iPSC'lerde hem de hPSC'lerde uygulanabilir. Bu doz ve tedavi süresinde RA, iPSC'lerin ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Katar Ulusal Araştırma Fonu'ndan (QNRF) bir hibe ile finanse edilmiştir (Hibe No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi Katar Ulusal Araştırma Fonu'ndan (QNRF) GSRA bursu ile desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AdiponektinAbcamab22554Adiposit olgunlaşma belirteci
anti-CD105BD Pharmingen560839MSC farklılaşma belirteci
anti-CD14BD Pharmingen561712MSC farklılaşma belirteci
anti-CD19BD Pharmingen555415MSC farklılaşma belirteci
anti-CD34BD Pharmingen555824MSC farklılaşma belirteci
anti-CD44abcamab93758MSC farklılaşma belirteci
anti-CD45BD Pharmingen
560975		MSC farklılaşma belirteci
anti-CD73BD Pharmingen550256MSC farklılaşma belirteci
anti-CD90BD Pharmingen555596MSC farklılaşma belirteci
bFGFAr-Ge D233-FPMSC kültür ortamı takviyesi
C/EBPAAbcamab40761Adiposit olgunlaşma belirteci
DeksametazonTorics1126Adiposit farklılaşma ortamı takviyesi
FABP4Abcamab93945Adiposit olgunlaşma belirteci
Fetal sığır serumuThermoFisher10082147MSC kültür ortamı takviyesi
GlutamaxThermoFisher35050-061MSC kültür ortamı takviyesi
IBMXSigma AldrichI5879Adiposit farklılaşma ortamı takviyesi
IndometasinSigma AldrichI7378Adiposit farklılaşma ortamı takviyesi
İnsülinSigma Aldrich91077CAdiposit farklılaşma ortamı takviyesi
Nakavt DMEMThermoFisher12660012Matrigel hazırlamak için bazal ortam
Düşük glikozlu DMEMThermoFisher11885084MSC kültür ortamı
MatrigelCorning354230Kaplama matrisi
MEM-alfaThermoFisher12561056Adiposit farklılaşma ortamı
NileredSigma Aldrich19123Adiposit için sıralama işaretçisi
PenisilinThermoFisher15140122MSC/Adiposit medya takviyesi
Fosfat tamponlu tuzlu suThermoFisher14190144yıkama tamponu
Pierce & trade; 20X TBS TamponThermo Fisher28358yıkama tamponu
PPARGHücre Sinyalizasyon Teknolojisi2443Adiposit olgunlaşma belirteci
ReLeSRKök Hücre Teknolojiler5872Ayrışma reaktifi
Retinoik asitSigma AldrichR2625MSC farklılaşma ortamı takviyesi
Kaya inhibitörüTocris1254/10hPSC kültür ortamı takviyesi
RoziglitazonSigma AldrichR2408Adiposit farklılaşma ortamı takviyesi
StemFlexThermoFisherA334901hPSC kültür ortamı
TritonThermo Fisher28314Geçirgenleştirme reaktifi
TripsinThermoFisher25200072Ayrışma reaktifi
Tween 20Sigma AldrichP7942Yıkama tamponu

Kaynaklar

  1. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12(2011).
  2. Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846(2009).
  3. Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
  4. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
  5. Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161(2005).
  6. Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
  7. Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
  8. van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
  9. Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
  10. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  11. Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
  12. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  13. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  14. Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
  15. Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2020).
  16. Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
  17. Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
  18. Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
  19. di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1(2015).
  20. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
  21. De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6(2018).
  22. Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932(2018).
  23. Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, Pt 3 607-613 (2003).
  24. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
  25. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
  26. Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
  27. Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  28. Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
  29. Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
  30. Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
  31. Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785(2012).
  32. Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536(2018).
  33. Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
  34. Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
  35. Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
  36. Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
  37. Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
  38. Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
  39. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

nsan iPSC DiferansiyasyonuMezenkimal K k H crelerAdiposit DiferansiyasyonuNile Red Ay klamasSaf Adiposit Pop lasyonuEmbriyonik CisimlerFACS Ay klamasAdiposit Olgunla ma MarkerlarLipid eren Adipositler
Adipositle İlişkili Bozuklukları İncelemek için İnsan iPSC'lerinin Saf Bir Adiposit Popülasyonuna Sağlam Farklılaşması
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.