Floresan Proteinlerde Prolin Analogları ile Prolinin Kalıntıya Özgü Değişimi: Omurganın "Moleküler Cerrahisi" Katlanma ve Stabiliteyi Nasıl Etkiler?

Özet

Klasik bölgeye yönelik mutagenezin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, spesifik modifikasyonlara sahip prolin analogları birkaç floresan proteinine dahil edildi. Hidrojenin flor ile veya prolin kalıntılarındaki tekli çift bağlarla ("moleküler cerrahi") değiştirilmesinin, katlanmaları ve ışıkla etkileşimleri de dahil olmak üzere temel protein özelliklerini nasıl etkilediğini gösteriyoruz.

Özet

Proteinlerdeki prolin (Pro) kalıntılarının, kalan 19 kanonik amino asitten herhangi biri tarafından geleneksel bölgeye yönelik mutagenez ile değiştirilmesi, genellikle protein katlanmasına ve özellikle yeşil floresan proteinlerde ve ilgili varyantlarda kromofor olgunlaşmasına zararlıdır. Makul bir alternatif, proteinin çevirisini manipüle etmektir, böylece tüm Pro kalıntıları kalıntılarla değiştirilir - özellikle seçici basınç birleştirme (SPI) olarak bilinen bir yöntem olan analoglarla. Dahili kimyasal modifikasyonlar, ölçülebilir değişiklikleri ince bir şekilde incelemek veya hatta farklı protein özelliklerini rasyonel olarak manipüle etmek için bir tür "moleküler cerrahi" olarak kullanılabilir. Burada, çalışma, SPI yönteminin, yeşil floresan proteininin (GFP) spektral varyantlarının tipik β varil yapısının organizasyonundaki rolünü incelemek için yararlılığını göstermektedir: dizilerinde 10-15 prolin: gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP), NowGFP ve KillerOrange. Pro kalıntıları, bireysel β teller arasındaki bağlantı bölümlerinde bulunur ve namlu iskelesinin kapanış kapaklarını oluşturur, böylece kromoforun sudan yalıtılmasından, yani floresan özelliklerinden sorumludur. (4R)-floroprolin (R-Flp), (4 S)-floroprolin (S-Flp), 4,4-difloroprolin (Dfp) ve 3,4-dehidroprolin (Dhp) ile seçici basınç birleştirme deneyleri, ekspresyon konakçısı olarak prolin-oksotrofik bir E. coli suşu kullanılarak gerçekleştirildi. S-Flp ve Dhp'li floresan proteinlerin aktif olduğunu (yani floresan), diğer iki analogun (Dfp ve R-Flp) işlevsiz, yanlış katlanmış proteinler ürettiğini bulduk. UV-Vis absorpsiyonu ve floresan emisyon profillerinin incelenmesi, Pro analogları içeren proteinlerde çok az karakteristik değişiklik olduğunu göstermiştir. EGFP varyantlarındaki katlanır kinetik profillerin incelenmesi, S-Flp varlığında hızlandırılmış bir yeniden katlanma işlemi gösterirken, işlem Dhp içeren proteindeki vahşi tipe benzerdi. Bu çalışma, SPI yönteminin, ilgilenilen diğer proteinlerin incelenmesi için benimsenebilecek atomik düzeyde ("moleküler cerrahi") protein kalıntılarının ince modifikasyonlarını üretme kapasitesini göstermektedir. β varil floresan proteinleri sınıfındaki katlanma ve spektroskopik özellikler üzerinde yakın kimyasal analoglarla prolin replasmanlarının sonuçlarını göstermektedir.

Giriş

Klasik bölgeye yönelik mutagenez, DNA seviyesinde kodon manipülasyonu ile mevcut herhangi bir gen kodlanmış protein dizisinin permütasyonuna izin verir. Protein katlanmasını ve stabilitesini incelemek için, benzer amino asitlerin benzer muadilleriyle değiştirilmesi genellikle arzu edilir. Bununla birlikte, geleneksel protein mutagenezi, standart genetik kod repertuarında bulunan Ser / Ala / Cys, Thr / Val, Glu / Gln, Asp / Asn, Tyr / Phe gibi kanonik amino asitler arasında yapısal olarak benzer replasmanlarla sınırlıdır. Öte yandan, Trp, Met, His veya Pro gibi proteinlerde genellikle temel yapısal ve fonksiyonel roller oynayan diğer kanonik amino asitler için böyle bir olasılık yoktur¹. Bu etkileşimleri, proteinlerin son derece spesifik iç mimarisi ve katlanma süreçleri bağlamında incelemek için ideal bir yaklaşım, yıkıcı olmayan isosterik modifikasyonlar üretmektir. Gerçekten de, kanonik olmayan amino asitler (ncAA'lar) olarak da bilinen bu kanonik amino asitlerin izosterik amino asit analogları proteinlere yerleştirildiğinde, tek atomlar veya "atomik mutasyonlar" olarak bilinen H / F, CH₂ / S / Se / Te gibi atom grupları düzeyinde bile ince değişikliklere izin ^verirler2. Böyle bir "moleküler cerrahi", özellikleri yalnızca tek atomların veya atom gruplarının değişiminden kaynaklanan, uygun durumlarda analiz edilebilen ve tespit edilen değişikliklerin rasyonelleştirilebileceği değiştirilmiş proteinler üretir. Bu şekilde, protein katlanmasını ve yapısını incelemek için protein sentezinin kapsamı, klasik DNA mutagenezinin çok ötesine genişletilmiştir. Bölgeye yönelik mutagenez tarafından üretilen proteinlerin genellikle "mutantlar" olarak adlandırıldığını, oysa ikame edilmiş kanonik amino asitlere sahip proteinlerin "varyantlar" ³, "alloproteinler"⁴ veya "protein türdeşleri"⁵ olarak adlandırıldığını unutmayın.

İlk olarak deniz organizması Aequorea victoria'da tanımlanan yeşil floresan proteini (GFP), ultraviyole ila mavi ışığa maruz kaldığında parlak yeşil floresan gösterir ^6,7. Günümüzde GFP, floresan mikroskopi yoluyla hücrelerde gen ekspresyonunun ve protein lokalizasyonunun rutin olarak görselleştirilmesi için oldukça hassas bir etiketleme aracı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. GFP'nin ayrıca çeşitli biyofiziksel 8,9,10 ve biyomedikal^11,12 çalışmalarında ve ayrıca protein mühendisliği ^13,14,15'te yararlı olduğu kanıtlanmıştır. GFP yapısının titiz analizi, çeşitli stabilite ve floresan maxima^16,17 ile karakterize edilen çok sayıda varyantın oluşturulmasını sağlamıştır. Hücre ve moleküler biyolojide kullanılan GFP varyantlarının çoğu, hem çözeltide hem de kristal^18'de bulunan monomerik proteinlerdir. Temel yapısal organizasyonları, filogenetik kökenlerinden bağımsız olarak GFP ailesinin tüm üyeleri için tipiktir ve β namluyu oluşturan 11 β iplikçikten oluşurken, bükülmüş bir α sarmal, namlunun ortasından geçmekte ve kromoforu taşımaktadır (Şekil 1A). Kromoforun otokatalitik olgunlaşması (Şekil 1B), onu çevreleyen yan zincirlerin proteinin merkezi yerinde hassas bir şekilde konumlandırılmasını gerektirir; Bu yan zincirlerin birçoğu diğer GFP varyantlarında yüksek oranda korunmuştur¹⁹. Aequorea victoria gibi denizanasından elde edilen floresan proteinlerin çoğunda, yeşil yayan kromofor, Tyr66'nın bir fenol halkası ve imidazolinonun beş üyeli heterosiklik yapısı da dahil olmak üzere iki aromatik halkadan oluşur (Şekil 1B). Kromofor, protein matrisine düzgün bir şekilde yerleştirildiğinde, tüm proteinin karakteristik floresansından sorumludur. Yapının merkezinde bulunurken, namlu yapısı onu sulu ortam^20'den yalıtır. Kromoforun dökme suya maruz kalması, floresan söndürmeye, yani floresan kaybına neden olur²¹.

Namlu benzeri yapının düzgün bir şekilde katlanması, kromoforu floresan söndürme^22'ye karşı korumak için gereklidir. Prolin (Pro) kalıntıları GFP^23'ün yapısal organizasyonunda özel bir rol oynamaktadır. Bir β zincirini destekleyemedikleri için, protein yapısını bir bütün olarak korumaktan sorumlu bağlantı döngüleri oluştururlar. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, hem Aequorea hem de Anthoathecata'dan türetilmiş GFP'lerde 10-15 prolin kalıntısı bulunur; bazıları diğer floresan β varil protein türlerinde oldukça korunmuştur. Prolinlerin, kendine özgü geometrik özellikleri nedeniyle katlanma özelliklerini kritik olarak etkilemesi beklenir. Örneğin, Aequorea türevi GFP'lerde, on prolin kalıntısından (Şekil 2A), dokuzu trans- oluşturur ve sadece biri cis-peptid bağı oluşturur (Pro89). Pro58 esastır, yani 19 kanonik amino asidin geri kalanıyla değiştirilemez. Bu kalıntı, kromofor olgunlaşması ve genel GFP katlanması²⁴ için çok önemli olduğu bildirilen Trp57 kalıntısının doğru konumlandırılmasından sorumlu olabilir. Üç prolin kalıntısı (Pro54, Pro56, Pro58) ve Trp57 içeren PVPWP fragmanı, GFP yapısındaki "alt kapağın" Şekil 1A'daki temel parçasıdır. PVPWP yapısal motifi, sitokromlar ve ökaryotik voltajla aktive olmuş potasyum kanalları²⁵ gibi çeşitli proteinlerde bulunur. 75 ve 89 pozisyonlarındaki prolin-alanin ikameleri de protein ekspresyonuna ve kromofor olgunlaşmasının katlanmasına ve ortadan kaldırılmasına zararlıdır. Pro75 ve Pro89, kromoforu gömen "üst kapağın" bir parçasıdır (Şekil 1A) ve 11 sarmallı β varil floresan proteinleri²³ boyunca korunur. Bu iki "kapak", kararlı üçüncül yapı kısmen kırılmış olsa bile, kromoforu sulu çözücüden dışlanmış halde tutar²⁶. Böyle spesifik bir moleküler mimari, floroforu çarpışmalı (dinamik) floresan söndürmeden, örneğin su, oksijen veya diğer difüzyon ligandlarından korur.

GFP yapısının moleküler mühendisliğini gerçekleştirmek için, proteinin birincil yapısına amino asit ikameleri getirilmelidir. GFP üzerinde, yüksek stabilite, hızlı ve güvenilir katlanma ve değişken floresan özelliklerine sahip varyantlar sağlayan çok sayıda mutasyon gerçekleştirilmiştir¹⁷. Bununla birlikte, çoğu durumda, prolin kalıntılarının mutasyonu, kalan 19 kanonik amino asitten hiçbirinin prolin kalıntısı^27'nin konformasyonel profilini düzgün bir şekilde geri yükleyememesi nedeniyle riskli bir yaklaşım olarak kabul edilir. Böylece, prolin kalıntılarının, prolin analogları²⁸ olarak adlandırılan diğer prolin bazlı yapılarla değiştirildiği alternatif bir yaklaşım geliştirilmiştir. Eşsiz siklik kimyasal yapısı sayesinde, prolin iki karakteristik konformasyonel geçiş sergiler (Şekil 1C): 1) prolin halka büzüşmesi, öncelikle φ burulma açısını etkileyen omurganın organizasyonunu gerektiren hızlı bir süreç ve 2) peptid bağı cis / trans izomerizasyonu, ω burulma açıları aracılığıyla omurga katlanmasını etkileyen yavaş bir işlem. Yavaş doğası nedeniyle, ikinci geçiş genellikle tüm proteinin katlanma sürecindeki hız sınırlayıcı adımlardan sorumludur. Bazı prolin kalıntıları etrafındaki peptid bağ cis / trans izomerizasyonunun, GFP varyantlarının katlanmasında yavaş adımlar içerdiği daha önce gösterilmiştir. Örneğin, Pro89'daki cis-peptid bağının oluşumu, katlanma sürecindeki yavaş adımı içerir, çünkü transtan cis^29'a bağ geçişine dayanır. Pro89'u bir all-trans peptid döngüsü ile değiştirdikten sonra, yani bir cis-to-trans izomerizasyon olayı³⁰ ortadan kaldırılarak daha hızlı bir yeniden katlanma elde edilebilir. Cis / trans izomerizasyonuna ek olarak, büzüşme geçişleri, omurga organizasyonu ve protein iç^27,31 içindeki paketleme nedeniyle protein katlanmasında da derin değişiklikler yaratabilir.

Kimyasal modifikasyonlar, prolin kalıntılarının içsel konformasyonel geçişlerinin değişmesine neden olur ve böylece proteinin katlanma yeteneğini etkiler. Bazı prolin analogları, katlanma özelliklerinin manipülasyonuna ve incelenmesine izin verdikleri için proteinlerde prolin ikamesi için özellikle çekici adaylardır. Örneğin, (4R)-floroprolin (R-Flp), (4S)-floroprolin (S-Flp), 4,4-difloroprolin (Dfp) ve 3,4-dehidroprolin (Dhp), hem moleküler hacim hem de polarite açısından prolin'den minimum düzeyde farklı olan dört analogdur (Şekil 1D)³². Aynı zamanda, her analog farklı bir halka büzüşmesi sergiler: S-Flp C 4-endo büzüşmeyi stabilize eder, R-Flp C^4-exo büzüşmeyi stabilize eder, Dfp belirgin bir büzüşme tercihi göstermezken, Dhp büzüşmeyi ortadan kaldırır (Şekil 1D)³³. Bu analogları protein yapısında kullanarak, prolin kalıntılarının konformasyonel geçişi ile manipüle edilebilir ve bununla ortaya çıkan GFP varyantlarının özelliklerini etkileyebilir.

Bu çalışmada, belirlenmiş prolin analogları setini (Şekil 1D), seçici basınç birleştirme yöntemini kullanarak GFP varyantlarının yapısına dahil etmek için yola çıktık (SPI, Şekil 3)³⁴. Amino asit kalıntılarının en yakın izoyapısal analogları ile değiştirilmesi, protein tasarımında uygulanan biyoteknolojik bir kavramdır^35,36. Bu nedenle, prolin analoglarının bir model proteindeki etkileri, protein mühendisliğinde araç olarak hizmet etme potansiyellerini göstermektedir³⁷. İstenilen analogları içeren proteinlerin üretimi, prolin (prolin-auxotrophy) üretemeyen modifiye E. coli suşlarında gerçekleştirildi. Böylece, protein biyosentezi sürecinde substratların değiştirilmesini kabul etmeye zorlanabilirler³⁸. Prolinin bu küresel ikamesi, endojen aminoasil-tRNA sentezlerinin doğal substrat esnekliği ile sağlanır³⁹, tRNA'ların esterleşmesini uygun amino asitlerle katalize eden anahtar enzimler⁴⁰. Genel olarak, Şekil 3'te belirtildiği gibi, hücresel büyüme, orta logaritmik büyüme fazına ulaşılana kadar tanımlanmış bir ortamda gerçekleştirilir. Bir sonraki adımda, değiştirilecek amino asit, fermantasyon sırasında ekspresyon sisteminden hücre içi olarak tükenir ve daha sonra istenen analog veya ncAA ile değiştirilir. Hedef protein ekspresyonu daha sonra kalıntıya özgü kanonik olmayan amino asit birleşmesi için indüklenir. Konyak amino asidinin analogu ile ikame edilmesi, proteom çapında bir şekilde gerçekleşir. Bu yan etkinin konakçı suşunun büyümesi üzerinde olumsuz bir etkisi olsa da, hedef protein üretiminin kalitesi çoğunlukla etkilenmez, çünkü rekombinant ekspresyonda, hücresel kaynaklar esas olarak hedef proteinin üretimine yönlendirilir^41,42. Bu nedenle, sıkı bir şekilde düzenlenmiş, indüklenebilir bir ifade sistemi ve güçlü destekleyiciler, yüksek birleştirme verimliliği için çok önemlidir⁴³. Yaklaşımımız, duyu kodonlarına (duyu kodonu yeniden atanması) yanıt olarak ncAA'ların çoklu kalıntıya özgü dahil edilmesine dayanmaktadır, böylece hedef gen içinde, Pro analog yerleştirme için pozisyon sayısı, sahaya yönelik mutajenez⁴⁴ aracılığıyla manipüle edilebilir. Benzer bir yaklaşım, antimikrobiyal özelliklere sahip rekombinant peptitlerin hazırlanmasına ilişkin bir önceki raporumuzda da uygulanmıştı⁴⁵. Bu çalışmada, kanonik amino asit repertuarı ile sentezlenen proteinlerde bulunmayan farklı fizikokimyasal özelliklere sahip olması beklenen proteinleri üretmek için tüm prolin kalıntılarının ilgili analoglarla değiştirilmesini sağlayan SPI yöntemini uyguladık. Ortaya çıkan varyantların katlanma ve floresan profilini karakterize ederek, GFP varyantlarındaki atomik ikamelerin etkilerini sergilemeyi amaçlıyoruz.

Protokol

1. İfade plazmidlerinin yetkin Pro-oksotrofik E. coli hücrelerine sokulması

1. Her bir numune plazmidinin 1 ng'sini, pQE-80L H 6-EGFP, pQE-80L H 6-NowGFP ve pQE-80L H _{6-KillerOrange} ile karıştırın, Pro-auxotrophic E. coli K12- türevi JM83'ün (Addgene #50348 veya ATCC #35607) 50 μL kimyasal olarak yetkin veya elektroemejyen hücreleri ile mevcut protokollere göre ısı şoku yöntemi veya elektroporasyon ile dönüşüm için ^{46, 47}.
   NOT: pQE-80L EGFP-H 6 ifade vektörü, C-terminal 6xHis-etiketli gelişmiş yeşil floresan proteini (EGFP), pQE-80L H 6-NowGFP ve pQE-80L H _{6-KillerOrange} ifade vektörlerini kodlar, sırasıyla N-terminal 6xHis-etiketli NowGFP⁴⁸ veya N-terminal 6xHis-etiketli KillerOrange^49'u kodlar, sırasıyla her biri bir pQE-80L plazmid omurgasında. Tüm hedef genler, lac operatörü tarafından düzenlenen bakteriyel bir T5 promotörünün kontrolü altındadır. Ampisilin direnci bir seçim belirteci olarak ve kolE1 replikasyonun kaynağı olarak kullanıldı. pQE-80L plazmid hakkında daha fazla bilgi için Malzeme Tablosuna bakınız. K-12 ve B suşlarından kaynaklanan alternatif Pro-auxotrophic E. coli de ekspresyon için kullanılabilir ve benzer sonuçlar vermelidir. H 6 etiketli tek başına protonlanmış ([M + H] ⁺) vahşi tip proteinlerin (kromofor olgunlaşmasından sonra) hesaplanan moleküler kütlesi 27.745.33 Da (EGFP- H 6), 27.931.50 Da (H 6-NowGFP) ve 27.606.09 Da (H _{6-KillerOrange}) 'dır. Hedef proteinlerin birincil yapıları Tablo 1'de verilmiştir (Onun etiketinin altı çizili). NowGFP'nin His-tag dizisindeki glutamin (Q), Pletnev ve ^ark.51'den alınan NowGFP cDNA'sının pQE-80L plazmidine alt klonlanmasından sonra DNA dizilimi ile tanımlandı. Protein saflaştırmasını veya floresan proteinin özelliklerini engellemez.
2. 950 μL SOC ortamındaki hücreleri 37 ° C'de 1 saat boyunca geri kazanın.
3. Geri kazanılan hücrelerin 50 μL'sini, glikoz (10 g / L) ve ampisilin (100 μg / mL) içeren Luria Agar (LA) orta plakalarına (Ek Materyale bakınız) yayın.
4. LA orta plakalarını gece boyunca 37 ° C'de veya 24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin.

2. Rekombinant vahşi tip floresan proteinlerinin üretimi (kanonik prolin barındıran) ve prolin analogları (S-Flp, R-Flp, Dfp, Dhp) ile floresan proteinleri üretmek için seçici basınç birleştirme prosedürü (SPI)

1. pQE-80L EGFP- H 6, pQE-80L H 6-NowGFP ve pQE-80L H _{6-KillerOrange'ı} barındıran Pro-auxotrophic E. coli K12 türevi JM83 suşunun gece kültürü
   1. Bir LA orta plakasından tek bir koloni seçmek için steril bir pipet ucu veya aşılama döngüsü kullanın ve steril bir 14 mL polistiren kültür tüpünde 5 mL Lizojen Et Suyu (LB) ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın (bkz. Ek Malzeme; 10 g / L glikoz, 100 μg / mL ampisilin içeren).
      NOT: Aşılama için taze dönüştürülmüş koloniler önerilir. 4 °C'de depolanan LA orta plakalarındaki hücreler (adım 2.2'den itibaren.) birkaç gün içinde kullanılmalıdır.
   2. Hücre kültürünü gece boyunca 37 ° C'de 200-250 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıda büyütün.
2. Rekombinant EGFP- H üretimi₆, H₆-Şimdi GFP ve H₆-Doğal prolin ile KillerOrange ve prolin analogları ile karşılık gelen protein varyantları
   1. 200 mL taze NMM ortamı (7,5 mM (NH 4)2 SO 4, 50 mM K 2 HPO 4 ve 22 mM KH 2 PO 4, 8,5 mM NaCl, 1 mM MgSO 4, 20 mM D-glukoz, 1 μg/mL FeCl 2, 1 μg/mL CaCl ₂, 10 μg/mL tiamin, 10 μg/mL biyotin,0,01 μg/mL eser elementler (CuSO ₄, ZnCl₂, MnCl 2, (NH 4)2 MoO₄), pH ~_7.2) tüm kanonik l-amino asitlerle (50 mg/L); Ek Materyale bakınız) 100 μg / mL ampisilin ile desteklenmiş ve 2-L Erlenmeyer şişesinde 2 mL gece kültürü ile desteklenmiştir.
      NOT: Protein türüne bağlı olarak, protein verimini optimize etmek için MOPS medium⁵², glukoz-mineral tuzları medium⁵³, Davis minimal medium 54, M9 minimal medium⁵⁵ veya GMML⁵⁶ gibi alternatif yetiştirme ortamları test edilebilir.
   2. Hücreleri 37 ° C'de 220 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıda ~ 3 saat 30 dakika boyunca inkübe edin.
   3. ~ 0,7 OD₆₀₀ değerine ulaşılana kadar her 30 dakikada bir spektrofotometrede_{600 nm (OD 600} ) optik yoğunluğu ölçün.
      NOT: Bir spektrofotometrede OD₆₀₀ tayini için, küvetin yol uzunluğu 1 cm olmalıdır. İlgili yetiştirme ortamı, referans ("sıfır") ölçüm için kullanılır. ~ 0.7'lik bir OD₆₀₀ değerine ulaşılana kadar inkübasyon süresi kültür hacmine bağlı olabilir. 3 saat 30 dk yaklaşık bir değerdir. Protokol alt adımları 2.2.1-2.2.3.'ün bir varyasyonunda, alt adım 2.1.2'deki kültür. sınırlı bir prolin konsantrasyonu (örneğin, 50 mg / L yerine 5 mg / L) ile desteklenmiş taze NMMΔPro ortamını ( Ek Materyale bakınız) aşılamak için kullanılır ve hücreler 220 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda 37 ° C'de gece boyunca yetiştirilir. Ertesi gün, OD₆₀₀ tayini, ölçümler arasındaki farklar 0,05'ten az olana kadar her 30 dakikada bir gerçekleştirilir. Maksimum OD₆₀₀ değeri 1 civarında olmalıdır (± 0,3). İlk, sınırlı prolin konsantrasyonu, ifade gerinimine ve yetiştirme ortamına bağlı olarak ayarlanabilir (bkz.
   4. Hücre süspansiyonunu 3.000 x g ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca döndürün.
   5. Süpernatantı yavaşça çöpe atın.
   6. Yıkama adımı: Dikkatli pipetleme ile 50 mL buz gibi soğuk NMMΔAA (herhangi bir amino asit olmadan, Ek Malzemeye bakınız) veya NMMΔPro (prolin olmadan, Ek Malzemeye bakınız) ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın.
      NOT: Bu yıkama adımı için, belirtilen iki tampondan biri kullanılabilir, çünkü sadece inkübasyon ortamındaki artık prolinlerden kurtulmak önemlidir.
   7. Hücreleri, 10 dakika boyunca 3.000 x g'de bir santrifüjde 4 ° C'de çökeltme ile ortamdan ayırın.
   8. Süpernatantı yavaşça çöpe atın.
   9. 200 mL NMMΔPro ortamındaki hücre peletini 100 μg / mL ampisilin ile 2-L Erlenmeyer şişesine takviye edilmiş olarak yeniden askıya almak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet çekin.
      NOT: Elde edilen hücre süspansiyonu, Pro veya prolin analoglarının varlığında protein ekspresyonunu karşılaştırmak için aynı başlangıç kültürlerini elde etmek için eşit hacimli birkaç numuneye ayrılabilir (örneğin, 100 mL Erlenmeyer şişelerinde 4 x 50 mL'ye ayırma).
   10. Pro'nun tamamen tükenmesi için 220 rpm'de yörüngesel çalkalayıcıda 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
       NOT: Bu adım, Pro'yu hücrelerden tamamen tüketmek için kritik öneme sahiptir.
   11. Hücre süspansiyonunda 1 mM nihai konsantrasyonu ayarlamak için 50 mM stok çözeltisinden uygun miktarda L-prolin veya R-Flp, S-Flp, Dfp ve Dhp ekleyin.
       NOT: Genel bir kural olarak, Pro veya prolin türevlerinin taze 50 mM stok çözümleri her zaman kullanımdan önce hazırlanmalıdır. Sadece belirli bir kanonik veya kanonik olmayan amino asidin sulu bir çözelti içinde hidrolizi bir endişe kaynağı değilse, dondurulmuş stoklar da kullanılabilir.
   12. Hedef protein ekspresyonunu indüklemek için 1 M'lik bir stok çözeltisinden 0,5 mM IPTG ekleyin.
   13. Hedef proteini gece boyunca (12 saat) 37 ° C'de 220 rpm'de bir yörüngesel çalkalayıcıda eksprese edin.
   14. Ertesi gün OD_600'ü ölçün.
       NOT: OD₆₀₀ tayini, protein ekspresyonundan sonra hücre miktarını ölçmek için yapılır. Yıkama adımı 2.2.3'ten önce ölçülen değere kıyasla daha düşük bir OD₆₀₀ değeri, sağlanan amino asidin sitotoksisitesini gösterir. Bu durumda, prosedür, sağlanan amino asidin konsantrasyonu en aza indirilerek (0.1 mM'ye kadar) tekrarlanmalıdır.
   15. Bakteri hücrelerini 10 dakika boyunca 5.000 x g ve 4 ° C'de santrifüj yapın ve toplayın ve süpernatantı atık haline getirin.
   16. Yıkama adımı: % 10 gliserol içeren 50 mL bağlayıcı tamponda (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 1 mM DTT) dikkatli pipetleme yaparak hücreleri askıya alın ve hücre süspansiyonunu 50 mL konik polistiren tüpe aktarın.
   17. Bakteri hücrelerini 10 dakika boyunca 5.000 x g ve 4 ° C'de santrifüj yapın ve toplayın ve süpernatantı atık haline getirin.
   18. Hücre peletini daha fazla kullanıma kadar -20 ° C veya -80 ° C'de 50 mL'lik bir konik polistiren tüpünde saklayın (protein saflaştırma, aşağıya bakınız).

3. İmmobilize metal iyonu afinite kromatografisi (IMAC) ile protein örneklerinin saflaştırılması prosedürü

1. Bakteriyel hücre lizisi
   NOT: Hedef proteinin bozulmasını önlemek için hücre lizisinin tüm adımlarını buz üzerinde veya 4 ° C'de gerçekleştirin.
   1. Bakteriyel hücre peletini buz üzerinde veya 4 ° C'de 50 mL'lik konik polistiren tüpte 10-20 dakika boyunca çözün.
   2. 10 mL buz gibi soğuk bağlayıcı tampon ekleyin ( Ek Malzemeye bakınız) ve hücre peletini yeniden askıya almak için hafifçe yukarı ve aşağı pipet uygulayın.
   3. 100 μL 50 mg/mL lizozim, 100 μL 1 mg/mL DNaz I, 100 μL 1 mg/mL RNaz A, 30 μL 1 M MgClCl₂ ekleyin. Hücre süspansiyonunu beş kez dikkatlice ters çevirin ve kapalı tüpü 60 dakika boyunca buz üzerinde veya 4 ° C'de tutun.
      NOT: Lizozim, bakteriyel hücre duvarını bozarak kimyasal hücre lizisini indükler.
   4. Bir ultrason homojenizatörü kullanarak hücre bozulması için numuneyi sonikleştirin (örneğin, buzlu su karışımı üzerinde 50 mL'lik bir polistiren tüpte 3 dakika boyunca 3 kez, nabız 2 s / duraklama 4 s,% 45 genlik).
      NOT: Alternatif olarak, diğer hücre bozma yöntemleri de kullanılabilir, örneğin 14.000 psi'de 20 döngüde yüksek basınçlı homojenizasyon. Gerekirse, minimum cihaz hacmine ulaşmak için bağlayıcı bir tampon (Ek Malzemeye bakınız) kullanarak seyreltin. Ayrıca, protein ekstraksiyon reaktifleri hücre bozulması için kullanılabilir. Örnekler için Malzeme Tablosu'na bakın.
   5. 18.000 x g, 4 °C'de 60 dakika santrifüj.
   6. Alt adım 3.1.9 için sıvı hacmine dikkat edin. ve süpernatantı taze bir 50 mL polistiren tüpe dökün.
   7. 0,45 μm gözenek çapına sahip bir membran filtre kullanarak süpernatantı temizleyin.
   8. SDS-PAGE için bir "lizat" örneği alın (aşağıdaki bölüm 4'e bakınız); bu, alt adım 3.1.6'dan süpernatant olan "çözünür protein fraksiyonuna" karşılık gelir.
   9. Alt adım 3.1.6'da belirlenen eşit miktarda ddH₂O ekleyin. sonraki SDS-PAGE analizi için numunelerin aynı seyreltilmesini sağlamak amacıyla hücre kalıntılarını yeniden askıya almak.
   10. SDS-PAGE için bir "pelet" örneği alın (aşağıdaki bölüm 4'e bakınız); bu, "çözünmeyen protein fraksiyonuna" karşılık gelir, hücre enkazı 3.1.9 alt adımından süspansiyon.
2. İmmobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) saflaştırma
   NOT: Hedef floresan proteinin saflaştırılması 4 °C'de veya oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilebilir. İkinci seçenek için, ılık bir kolona yerleştirildikten sonra soğuk çözeltide sıkışmış havanın buharlaşması nedeniyle hava kabarcığı oluşumunu önlemek için lizat, kolon ve tüm tamponların RT'de dengelenmesini bekleyin.
   1. Numuneyi, üreticinin talimatlarına göre 1 mL önceden paketlenmiş veya kendinden paketlenmiş bir IMAC FPLC (hızlı protein [veya performans] sıvı kromatografisi) sütunu kullanarak saflaştırın; maksimum sütun basıncını 0,3 MPa'ya ve akış hızını 1 mL / dak'ya ayarlayın; kolon dengesi için bağlayıcı tampon (bakınız Ek Malzeme), yıkama adımı için yıkama tamponu (bakınız Ek Malzeme) ve hedef protein elüsyonu için elüsyon tamponu (bakınız Ek Malzeme) kullanın.
      NOT: Alternatif olarak, hedef proteini doğrusal bir imidazol konsantrasyon gradyanı (20-200 mM) çalıştıran elüsyon tamponu ile etkisiz hale getirmek için otomatik bir FPLC sistemi uygulanabilir.
   2. Lüat fraksiyonlarını floresan proteinlerle toplayın ve bir araya getirin (görünür yeşil veya turuncu renge göre seçin).
   3. Toplanan fraksiyonları, üreticinin talimatlarına göre bir diyaliz membranına (moleküler ağırlık kesme (MWCO) 5.000-10.000) aktarın ve diyaliz tamponuna veya MS tamponuna karşı en az üç kez diyaliz yapın (Ek Malzemeye bakınız). Örneğin, 1-mL'lik bir numunenin diyalizini her turda en az 2 saat boyunca 100 mL tampona karşı üç kez gerçekleştirin. Ayrıntılı bir protokol için Budisa et ^al.34'e bakınız.
   4. PBS tamponunda diyalize edilmiş elüsyon fraksiyonunun 1:100 kat seyreltilmesini hazırlayın (bkz.
   5. Seyreltilmiş numunelerin absorbans spektrumunu bir UV-Vis spektrofotometresine kaydedin.
   6. Lambert-Beer yasasına dayanan protein konsantrasyonunu, belirli dalga boyunda ε molar yok olma katsayılarının literatür değerlerini kullanarak aşağıdaki gibi hesaplayın (488 nm ε₄₈₈ = 55.000 ^cm-1· ^M-1, Şimdi GFP 493 nm ε₄₉₃ = 53.600 ^cm-1· ^M-1, KillerOrange at 514 nm ε₅₁₄ = 22.600 ^cm-1· ^M-1):
      (Lambert-Beer yasası)
      c_proteini = protein konsantrasyonu [mg/mL]
      A = belirli dalga boyunda absorbans
      ε = belirli dalga boyunda molar yok olma katsayısı [M-1·^cm-1]
      d = küvet yolu uzunluğu, burada 1 cm
      MW = proteinin moleküler ağırlığı [g/mol]
      Referans ("sıfır") ölçümü için diyaliz tamponu kullanın (Ek Malzemeye bakınız).
   7. SDS-PAGE için bir "eluate" örneği alın (aşağıdaki bölüm 4'e bakınız), Coomassie Brilliant Blue lekeli jeller için numune başına 1-10 μg protein (önceki adıma göre hesaplanmıştır) yükleyin.
      NOT: Protein bandı boyama için Coomassie Brilliant Blue'dan farklı bileşikler kullanılıyorsa, uygulanan boyama yöntemine ve boyanın hassasiyetine bağlı olarak SDS numune miktarlarını ayarlayın.
   8. Protein örneğini dondurun ve diyaliz tamponunda (Ek Malzemeye bakınız) -80 °C'de saklayın.
      NOT: Bu saklama koşulu altında, protein numuneleri en az 6 ay boyunca stabil olmalıdır. Hedef proteinlerin absorpsiyon ve floresan emisyon spektrumlarının kaydedilmesi için alternatif laboratuvar UV-Vis ve floresan spektrofotometreleri kullanılabilir. Floresan emisyon ölçümleri için aşağıdaki uyarma dalga boyları uygulanabilir: 488 nm (EGFP), 493 nm (NowGFP) ve 510 nm (KillerOrange).

4. SDS-PAGE numune hazırlama

1. Bölüm 3'ten "elüat", "lizat" ve "pelet" numuneleri için_{280 nm (A 280nm}) absorbans A'yı belirleyin. Uygun miktarda elüsyon tamponu ekleyerek A_280nm = 2'ye ulaşmak için prob hacmini ayarlayın (son prob hacmi en az 80 μL olmalıdır).
2. Numuneyi pipetleyerek, örneğin numunenin 80 μL'sini 20 μL 5x SDS yükleme tamponu ile pipetleyerek 5x SDS yükleme tamponu (bkz. Ek Malzeme) ile 4:1 (v/v) oranında karıştırın.
3. Proteinleri denatüre etmek için SDS numunelerini 95 ° C'de bir su banyosunda veya ısı bloğunda 5 dakika kaynatın.
4. Numunelerin RT'ye soğumasına izin verin ve jele yüklemeden önce probları bir mikrosantrifüjde 1 dakika boyunca 13.000 x g'de döndürün.
5. Coomassie Brilliant Mavi lekeli SDS-PAGE için 5-10 μL kullanın. SDS-PAGE prosedürünün ayrıntıları için^57'ye bakın.
   NOT: SDS numune miktarlarını, uygulanan boyama yöntemine ve boyanın hassasiyetine bağlı olarak ayarlayın. SDS-PAGE'in sonucu, numunelerin, istenen proteinin beklenen moleküler ağırlığına karşılık gelen bir bantta toplam proteinin% 95'inden fazlasını içerdiğinden emin olmak için dikkatlice kontrol edilmelidir. Bunun için Coomassie boyalı jelin fotoğrafını çekin ve istenen moleküler ağırlığa sahip protein bandının yoğunluğunu, şeritteki (varsa) diğer tüm bantların yoğunluğu ile densitometri ile karşılaştırın. Bant yoğunluklarının densitometrik değerlendirmesi için ImageJ yazılımı⁵⁸ kullanılabilir. İstenilen ncAA'ların ilgili proteine dahil edildiğini deneysel olarak kanıtlamak için, elektrosprey iyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometrisine (LC-ESI-TOF-MS) bağlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile bozulmamış protein kütle analizi, tarif edilen⁵⁹ gibi yapılmalıdır (örnek ekipman için protokol bölüm 5 ve Malzeme Tablosuna bakınız).

5. Protein varyantlarının floresan emisyonu

1. İşlemden önce, numune saflığının %>95 olduğundan emin olmak için SDS-PAGE deneyinin sonucunu kontrol edin (adım 4.5'ten sonraki NOTA bakın.)
2. Her saflaştırılmış protein varyantının numunelerini 0.3 μM'lik bir konsantrasyona ayarlayın, hesaplanan absorbans değerini uygun dalga boyunda referans olarak alın (alt adım 3.2.5.). Yaklaşık nihai numune hacminin 200 μL olduğundan emin olun.
3. Seyreltilmiş numunelerin RT'de 1 saat boyunca dengelenmesine izin verin.
4. Numuneleri 1 cm'lik bir kuvars küvete aktarın ve aşağıdaki uyarma dalga boylarını uygulayan bir floresan spektrometresi kullanarak numunelerin floresan emisyon spektrumunu ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız): 488 nm (EGFP için), 493 nm (Şimdilik GFP için), 510 nm (KillerOrange için).

6. EGFP varyantlarının denatürasyonu ve yeniden katlanması

1. İşlemden önce, numune saflığının %>95 olduğundan emin olmak için SDS-PAGE deneyinin sonucunu kontrol edin (adım 4.5'ten sonraki NOTA bakın.)
2. Her saflaştırılmış protein varyantı için 300 μM konsantrasyonda 2 μL nihai hacimde iki numune hazırlayın (3.2.4-3.2.6 alt adımlarındaki protein konsantrasyonu belirlemeye bakınız).
3. Denatürasyonu indüklemek için her saflaştırılmış protein varyantının 2 μL'sine (8 M üre ve 5 mM DTT içeren 1x PBS elde etmek için) 8,89 M üre ve 5,56 mM DTT içeren 18 μL 1,11x PBS tamponu (Ek Malzemeye bakınız) ekleyin.
   NOT: Adım 6.4-6.6 için, her numuneyi ayrı ayrı işleyin.
4. Numuneleri 95 °C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
5. Renatürasyonu indüklemek için 5 mM DTT içeren 1980 μL 1x PBS ( Ek Malzemeye bakınız) ekleyerek 20 μL numuneleri 100 kat seyreltin, 0,3 μM nihai protein konsantrasyonu elde edin ve numunelerin 200 μL'sini hemen 1 cm'lik bir kuvars küvete aktarın.
   NOT: Burada hızlı çalışmak çok önemlidir, çünkü renatürasyon hemen başlar.
6. Kuvars küvetini uygun bir floresan spektrometresine yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 30 dakika boyunca her 3 saniyede bir floresan spektrumu elde ederek numunelerde protein yeniden katlanmasını izleyin. Her protein varyantı için, ilk örnek için 295 nm floresan uyarımı ve ikincisi için 488 nm floresan uyarma kullanın.
7. Yeniden katlanan numuneleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere aktarın, kapağı kapatın ve EGFP varyantlarının tamamen yeniden katlanmasını sağlamak için numuneleri karanlıkta RT'de 24 saat saklayın.
8. Floresan geri kazanımının zamansal bitiş noktasını yakalamak için daha önce olduğu gibi aynı uyarma dalga boyunu kullanarak yeniden katlanmış protein örneklerinin floresan emisyonunu adım 6.6'ya göre ölçün.

Sonuçlar

Çalışmanın başında, ana GFP mimarisini paylaşan üç farklı floresan protein varyantı seçtik. Seçilen ilk protein, Phe64Leu / Ser65Thr mutasyonları içeren denizanası Aequorea victoria'dan orijinal GFP'den türetilen tasarlanmış bir varyant olan EGFP idi. İkinci seçilen protein NowGFP^51,60 idi. Aynı zamanda, önceki floresan proteinleri aracılığıyla birkaç adımda mutajenez tarafından türetilen A. victoria GFP'nin bir varyantıdır. ŞimdiGFP, selefi floresan proteini "Cerulean" ile karşılaştırıldığında 18 mutasyon ^içerir61. Buna karşılık, "Cerulean" proteini, daha önce yönlendirilmiş laboratuvar evrimi tarafından seçilen ve triptofan bazlı bir kromofor içeren bir protein olan gelişmiş camgöbeği floresan proteininin (ECFP) ^62,63'ünün bir türevidir. Hem EGFP hem de NowGFP, hücre biyolojisi ve biyofizik çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır ve yapılarında on korunmuş prolin kalıntısı içerir. Ek olarak, NowGFP, bu protein varyantının kapsamlı mutasyon öyküsü nedeniyle ortaya çıkan 230 pozisyonunda on birinci bir prolin kalıntısına sahiptir. Seçilen üçüncü protein, KillerOrange floresan proteini^64,65 idi. Hidrozoan cinsi Anthoathecata'dan kromoprotein anm2CP'nin bir türevidir. Protein dizisi 15 prolin kalıntısı içerir ve kromofor bir tirozin kalıntısı yerine bir triptofana dayanır. Seçilen üç protein için de yüksek çözünürlüklü X-ışını yapıları bildirilmiştir (Şekil 2)51,65,66.

İlk adımda, prolin analogları (Şekil 1D), seçici basınç katılımı ile üç model proteinin (EGFP, NowGFP ve KillerOrange) tüm prolin pozisyonlarına dahil edilmiştir (SPI, prosedürün bir şeması Şekil 3'te verilmiştir). Enstrümantal olarak, prolin-auxotrophic E. coli K12 suşu JM83⁶⁷, proteinlerin prolin ve analogların varlığında ekspresyonu için kullanıldı (Şekil 1D), sırasıyla vahşi tip ve modifiye proteinler verdi. Doğal proteini eksprese eden hücrelerden gelen peletler ve S-Flp ve Dhp taşıyan varyantlar, bozulmamış kromofor nedeniyle tipik parlak renge sahipken, R-Flp ve Dfp içeren varyantlar renksiz kaldı, bu da inklüzyon cisimlerinde katlanmamış proteinin yanlış katlandığını ve biriktiğini gösterdi (Şekil 4A). İfade edilen örneklerin SDS-PAGE analizi, çözünmeyen R-Flp içeren proteinlerin varlığını doğruladı (Şekil 4B-D), bu da daha fazla araştırmayı engelledi. Bu, mevcut çalışmanın kapsamı dışında olmasına rağmen, protein çözünürlüğü ve yanlış katlanma sorunlarının in vitro yeniden katlama prosedürleri⁶⁸ ile bir dereceye kadar hafifletilebileceği belirtilmelidir. Buna karşılık, doğal proteinlerin yanı sıra S-Flp ve Dhp taşıyan varyantlar esas olarak çözünür fraksiyonlarda bulunmuştur (Şekil 4B-D). Vahşi tipin yanı sıra S-Flp ve Dhp içeren varyantlar, floresan çalışmalarında daha da izole edilebilir ve karakterize edilebilir. Çözünür proteinler, immobilize metal iyonu afinite kromatografisi (IMAC) ile saflaştırıldı ve EGFP için 20-30 mg / L kültür hacmi, NowGFP için 60-80 mg ve vahşi tip ve modifiye proteinler için verimleri çok benzer olan KillerOrange elde edildi. Sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS)-kuplajlı analiz, bu şekilde elde edilen izolatların beklenen kimliğini ve saflığını doğruladı (Şekil 5). Kütle spektrumlarında, S-Flp ile yapılan her prolin değişimi, dizideki her prolin kalıntısı başına +18 Da kayma üretirken, prolin-Dhp değişimi için kayma, kalıntı başına -2 Da idi.

Bir sonraki adımda, kanonik olmayan prolin analoglarının ana floresan proteinlerinin spektroskopik özellikleri üzerindeki potansiyel etkilerini analiz etmek için ışık emilimi ve emisyon spektrumları kaydedildi (Şekil 6). UV-Vis absorpsiyon spektrumları, aromatik kalıntılar, tirozin ve triptofan için tipik bir bant karakteristiği yaklaşık 280 nm gösterirken, kromofor emilimi EGFP için 488 nm ve NowGFP için 493 nm'de bulunmuştur (Şekil 6A, B). KillerOrange'da, kromofor absorbans bölgesi, karmaşık kromoforun iki olası konfigürasyon ve yük durumuna karşılık gelen iki banttan (Şekil 6C) oluşuyordu. 510 nm civarındaki bant, floresanın yüksek kuantum verimi^49,65 ile gerçekleştiği durum olarak bilinir. Prolin replasman varyantlarında, aşağıdakiler gözlenmiştir: Dhp'nin dahil edilmesi, EGFP ve NowGFP'nin absorbans spektrumlarını değiştirmezken, S-Flp gelişmiş bir UV emilimi üretti. İkincisi, triptofan kalıntısı mikro ortamlarında, özellikle PVPWP motifinde üç S-Flp arasına sıkıştırılmış Trp57'de indüklenen farklılıklarla açıklanabilir (Şekil 6A, B)⁶⁹. Bununla birlikte, daha yüksek bir UV emilimi için daha önemsiz bir açıklama, yanlış katlanmış proteinin artan bir fraksiyonundan kaynaklanabilir. Proteinin konsantrasyonu, absorbans özelliklerinin nicelleştirilmesi ile değerlendirildiğinden, uygun olmayan şekilde olgun bir kromofora sahip bir proteinin varlığı absorbansı artırabilirken, bu fraksiyon genel konsantrasyonda sayılmaz (Şekil 6A, B). Bu hipotezi destekleyerek, S-Flp içeren EGFP'nin, ana proteindeki daha yüksek bir değere (1.57) kıyasla, kombine triptofan ve tirozin absorbansına (ε(CRO)/ε(_Tyr+Trp) = 0.96) karşı belirgin şekilde azalmış bir kromofor oranı sergilediğini gözlemledik (Tablo 2₎⁷⁰. S-Flp içeren EGFP'de floresan olmayan bir fraksiyonun varlığı, protein özelliklerinin daha ileri analizinde önemli bir katkıda bulunan faktör olacaktır. S-Flp içeren KillerOrange varyantında, kromofor bandında kırmızıya kayma ile birlikte gelişmiş bir absorbans gözlendi. Bu gerçek, kromofor oluşumunun büyük bir floresan kuantum verimine sahip bir konfigürasyonu desteklediğini göstermiştir (Şekil 6C).

Daha sonra, karşılık gelen maksimum absorbans dalga boylarında uyarma üzerine kaydedilen proteinlerin floresan spektrumlarını analiz ettik. Sonuçlar, spektrumların, prolin ve replasmanları, S-Flp ve Dhp'yi taşıyan incelenen floresan protein varyantları için temelde aynı kaldığını göstermektedir. Bu sonuç, analogların hiçbir durumda kromoforun kimyasal ortamını değiştirmediği anlamına gelir (Şekil 6G-I). Bu gerçeğe rağmen, KillerOrange'ın floresan spektrumlarında, 295 nm'de uyarma üzerine, dolayısıyla triptofan uyarımı üzerine kaydedilen belirgin farklılıklar görülmüştür. Bu deney, triptofan yan zincirleri ile olgun kromofor arasında meydana gelen floresan rezonans enerji transferini (FRET) veya doğrudan eksitonik eşleşmeyi izler, çünkü her ikisi de 25 Å'dan fazla olmayan kısa bir mesafede bulunur. EGFP ve NowGFP varyantları için, emisyon spektrumları 295 nm uyarma kullanılarak ölçüldüğünde, neredeyse hiç triptofan emisyonunun yanı sıra güçlü bir kromofor emisyonu gözlenmiştir (Şekil 6D, E). Bununla birlikte, S-Flp içeren varyantlar biraz daha büyük triptofana özgü bir emisyon sergiledi. Bu gözlem, triptofanları içeren, ancak olgun kromoforu içermeyen katlanmamış apoproteinin sayılmamış bir katkısıyla bağlantılı olabilir. KillerOrange'da triptofana özgü emisyon önemli ölçüde artmıştır, bu da beklenen uyarma enerjisi transferi veya eksitonik bağlantı mekanizması yoluyla floresan söndürme eksikliğini göstermektedir. Prolin ve S-Flp içeren protein varyantları, yüksek kuantum veriminin tercih edilen kırmızıya kaymış floresan özelliğinin yanı sıra karşılaştırılabilir triptofan emisyonu sergiledi. Buna karşılık, Dhp'yi içeren varyant, muhtemelen küçük yapısal etkilerden dolayı kromofor floresan yoğunluğunda ciddi bir azalma göstermiştir (Şekil 6F).

Daha sonra, proteinlerin katlanma özelliklerini bir açılma / renatürasyon deneyi yaparak karşılaştırdık. Floresan emisyon spektrumları, katlanmış durumda (protokol bölüm 5), kimyasal denatürasyondan sonra ve daha sonra, 24 saatlik bir süre boyunca izlenen yeniden katlanma sürecinde (protokol bölüm 6) kaydedildi. Spektrumlar, hem ilgili dalga boylarında, hem 295 nm hem de kromoforların absorbans spektrumlarının maksimumunda uyarma üzerine kaydedilirken, ortaya çıkan floresan her protein için maksimum değere normalleştirilmiş olarak sunuldu (Şekil 7). Protokolün sonunda, EGFP varyantlarının yeniden katlanabileceğini gözlemledik, NowGFP ve KillerOrange varyantları - bir kez denatüre edildikten sonra - açılmamış kaldı (veriler gösterilmedi). Böylece, orijinal floresan proteinlerinin yeniden katlanma kapasiteleri önemli ölçüde değişmiştir. Not olarak, KillerOrange, hidrozoan kromoprotein varyantı KillerRed ^65,71'den başlayarak bir fotosensitizör olarak geliştirilmiştir ve yeniden katlanması^, sağlam β namlulu yapıya rağmen tipik olarak geride kalmaktadır. Deneylerimizde, vahşi tip EGFP kromofor floresansının sadece kısmen geri kazanıldığını, ancak triptofana özgü floresanın renatürasyondan sonra daha büyük olduğunu bulduk. Esasen Dhp içeren varyantta da benzer davranış gözlenmiştir (Şekil 7C,F). S-Flp içeren EGFP'de, uyarma 295 nm triptofana özgü dalga boyunda yapıldığında benzer bir sonuç gözlenmiştir (Şekil 7B). Çarpıcı bir şekilde, floresan, kromofor 488 nm'de uyarıldığında çok daha yüksek bir alana ulaştı (Şekil 7E). Görünüşe göre S-Flp, diğer iki varyanta kıyasla çok daha iyi bir yeniden katlanma verimine neden oluyor. Bununla birlikte, bilinmeyen moleküler etkileşimler nedeniyle 295 nm uyarma kullanıldığında bu yararlı etki görülmemiştir.

Daha sonra, yeniden katlanma hızı, hem triptofanın hem de kromoforun ayrı ayrı floresansı kaydedilerek izlenirken, işlemin bitiş noktası renatürasyonun başlamasından 24 saat sonra belirlendi. Sadece EGFP varyantları, güvenilir bir şekilde değerlendirilebilecek nispeten hızlı bir yeniden katlanan kinetik gösterirken, denatüre NowGFP ve KillerOrange varyantlarının hiçbiri, daha fazla nicel ölçümlere olanak tanıyan bir değere geri kazanamadı. EGFP'de, triptofan emisyonu geri kazanımı, kromofor emisyonunun geri kazanımına (1.500 saniyede tamamlanan) kıyasla iki kat daha hızlıydı (750 saniyede tamamlandı), bu da altta yatan süreçlerin karmaşıklığını gösteriyor (Şekil 8). Her iki uyarma dalga boyunda, yeniden katlanma hızı, literatür verileri²⁵ ile uyumlu olarak S-Flp'nin varlığı ile yükseltildi. Aynı zamanda, Dhp içeren varyant, vahşi tipe benzer bir yeniden katlanma profili gösterdi.

Şekil 1: Bu çalışmada kullanılan yeşil floresan protein (GFP) yapısal iskelesi, kromofor yapımı, prolin konformasyonel geçişleri ve sentetik analogları kullanılmıştır. (A) GFP'nin yapısı, her iki ucunda β sarmal kapaklarla kapatılmış, neredeyse mükemmel bir namlu (yani, 4.2 nm x 2.4 nm boyutlarında bir "teneke kutu") oluşturan α iplikçiklerden oluşur. 27 kDa GFP proteini, on bir β iplikçik, iki kısa α-helis ve ortadaki kromofordan oluşan üçüncül bir yapı gösterir. Bitişik prolinlerin konformasyonel durumları kromofor oluşumu ile bağlantılıdır. (B ) Kromoforun otokatalitik olgunlaşması (yoğuşması) Ser65, Tyr66 ve Gly67 kalıntılarında meydana gelir ve birkaç adımda ilerler: İlk olarak, Thr65'in karboksil karbonunu Gly67'nin amid azotuna yaklaştırmak için polipeptit omurgasındaki burulma ayarlamaları. Daha sonra, heterosiklik bir imidazolin-5-bir halka sisteminin oluşumu, glisin amid azotu ve ardından dehidrasyon tarafından bu karbon atomuna nükleofilik saldırı üzerine meydana gelir. Son olarak, tirozin alfa-beta karbon bağının moleküler oksijen ile oksidasyonu, sonunda tirozin fenil halkası ve para-oksijen ikamesi de dahil olmak üzere imidazolin halka sisteminin konjuge sisteminin genişlemesine yol açtığında sistem görünür floresan kazanır. β namlusunun merkezinde ortaya çıkan para-hidroksibenziliden imidazolinon kromoforu, dökme çözücüden tamamen ayrılır. (C ) 1) Prolin halkasının (büzüşmeler) ve 2) önceki amid bağının iskelet yapısı formülleri ve geometrileri, prolin kalıntısının ana konformasyonel geçişlerini temsil eder. (D) Bu çalışmada kullanılan prolin analogları, belirlenmiş prolin halka büzüşmeleri. Şekil ChemDraw ve Discovery Studio Visualizer kullanılarak oluşturulmuştur. GFP yapısı PDB yapı girişi 2Q6P'dendir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bu çalışmada kullanılan floresan proteinleri. Paneller, üç farklı floresan protein varyantının tipik β varil yapılarının şerit temsilini göstermektedir: EGFP, NowGFP ve KillerOrange, her varyantın floresan emisyonunun rengini temsil eden şerit rengiyle. Prolin kalıntıları (tek harfli kod) çubuklar olarak vurgulanır ve uygun konumlara açıklama eklenir. Kromoforlar, ilk amino asit bileşimi ile kalın olarak gösterilir. Tüm yapı gösterimleri, aşağıdaki PDB yapı girişlerine dayanarak PyMol ile üretilmiştir: EGFP için 2Q6P, NowGFP için 4RYS, KillerOrange için 4ZFS. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Kanonik olmayan prolin analoglarının kalıntıya özgü olarak dahil edilmesi için SPI yönteminin akış şeması sunumu. Bir ekspresyon plazmidi üzerindeki ilgi genini taşıyan bir prolin-auxotrophic Escherichia coli (E. coli) konakçı suşu, hücre kültürünün orta logaritmik büyüme aşamasında olduğu ~ 0.7'lik bir OD_600'e ulaşılana kadar 20 kanonik amino asidin tümü ile tanımlanmış bir minimal ortamda yetiştirilir. Hücreler toplanır ve 19 kanonik amino asit ve bir prolin analogu içeren taze minimal ortama aktarılır. Bir indükleyicinin eklenmesinden sonra, protein ekspresyonu gece boyunca gerçekleştirilir. Son olarak, hedef protein hücre lizisi ile izole edilir ve daha fazla analizden önce saflaştırılır. Protokolün bir varyasyonunda, hücreler 19 kanonik amino asit ile tanımlanmış bir minimal ortamda yetiştirilir ve prolin sınırlı miktarda eklenir (örneğin, diğer amino asitlerin konsantrasyonunun beşte biri). Bu ölçüde, hücreler logaritmik büyüme aşamasından çıkmadan önce ortamdaki proline egzoz yaparlar ve daha sonra analog eklenir ve ilgili protein üretimi indüklenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: EGFP, NowGFP ve KillerOrange varyantlarının ifade analizi. (A) 1 mL ekspresyon kültüründen hücre peletleri, OD_{600 = 2'ye} normalleştirilmiştir. (B ) EGFP, ( C ) NowGFP ve (D) KillerOrange varyantlarının SDS-PAGE analizi. Her floresan protein türevinin çözünür (S) ve çözünmeyen fraksiyonları (I)% 15 akrilamid jeline ve ayrıca çözünür proteinlerin IMAC'sinden salınan fraksiyonlara (E) yüklendi. PageRuler Lekesiz Protein Merdiveni, (M) ile gösterilen şeritlerde bir belirteç (M) olarak kullanılmıştır. Belirli bir proteinin beklenen bölgeleri çerçevelenir. Prolin pozisyonlarında dahil edilen amino asitler Pro, R-Flp, S-Flp ve Dhp'dir (Dhp yerine Dfp içeren floresan protein varyantlarından (A) hücre peletleri gösterilmiştir). Jeller %1 (w/v) Coomassie Brillant Blue ile boyandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Floresan protein varyantlarının kütle spektrometrik analizi. (A) H₆ etiketli EGFP (siyah), S-Flp-EGFP (turuncu) ve Dhp-EGFP'nin (camgöbeği) temsili dekonvolüt ESI-MS spektrumları, sayı olarak sağlanan ana kütle zirvelerinin konumu ile (Da'da). H₆ etiketli proteinlerin hesaplanan moleküler kütleleri [M + H] ⁺ şunlardır: EGFP için 27.745.33 Da (gözlenen 27.746,15 Da); S-flp-EGFP için 27.925,33 Da (gözlenen 27.925,73 Da); Dhp-EGFP için 27.725,33 Da (gözlenen 27.726,01 Da). (B) H₆ etiketli NowGFP (siyah), S-Flp-NowGFP (turuncu) ve Dhp-NowGFP'nin (camgöbeği) temsili dekonvolüne ESI-MS spektrumları, sayı olarak sağlanan ana kütle zirvelerinin konumu ile (Da'da). H₆ etiketli proteinlerin hesaplanan kütleleri şunlardır: Şimdilik GFP 27.931.50 Da (gözlemlenen 27.946.46 Da; ~ 16 Da'nın farkı muhtemelen proteindeki bir metiyoninin oksidasyonundan kaynaklanmaktadır); S-flp-nowGFP için 28.129,50 Da (gözlenen 28,130.08 Da); Dhp-NowGFP için 27.909,50 Da (27.910,22 Da gözlendi). (C) H₆ etiketli KillerOrange (siyah), S-Flp-KillerOrange (turuncu) ve Dhp-KillerOrange'ın (camgöbeği) temsili dekonvolüne ESI-MS spektrumları, sayı olarak sağlanan ana kütle zirvelerinin konumu ile (Da'da). H₆ etiketli proteinlerin hesaplanan kütleleri şunlardır: KillerOrange için 27.606.09 Da (gözlemlenen 27.605.91 Da); S-flp-KillerOrange için 27.876,09 Da (gözlemlenen 27.876,08 Da); Dhp-KillerOrange için 27,576.09 Da (gözlemlenen 27,575.93 Da). Yaklaşık 1 Da'lık gözlemlenen ve hesaplanan moleküler kütleler arasındaki sapmalar, ESI-MS ekipmanının hata aralığındadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Floresan protein varyantlarının ışık absorpsiyonu ve floresan emisyon spektrumları. Normalleştirilmiş UV-Vis absorpsiyon spektrumları, EGFP'nin (A), NowGFP'nin (B) ve KillerOrange'ın (C) varyantları için gösterilmiştir. Spektrumlar maksimum kromofor absorbansına (yaklaşık 500 nm) normalleştirildi. Normalize floresan emisyon spektrumları, EGFP'NIN (D, G), NowGFP'nin (e, h) ve KillerOrange'ın (F, I) varyantlarından gösterilmiştir. (D, E, F) içindeki spektrumlar, ultraviyole ışıkla (295 nm) uyarma üzerine, (G, H, I) 488 nm, 493 nm ve 510 nm ışıktaki spektrumlar için uyarma için kullanıldı ve spektrumlar, kromofor emisyonunun ilgili maksimumuna (yaklaşık 500 nm) normalleştirildi. Her panelde, siyah eğriler doğal prolin ile floresan protein varyantının spektrumlarına karşılık gelir, turuncu eğriler S-Flp ikame edilmiş proteinlerin spektrumlarını gösterir ve mavi eğriler Dhp ikame proteinlerine karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Yeniden katlama deneylerinde EGFP varyantlarının floresan emisyon spektrumları. Doğal durumda ve denatürasyon ve yeniden katlanmadan sonra floresan protein varyantlarının 0.3 μM çözeltilerinin normalleştirilmiş floresan emisyon spektrumları: (A, B, C) içindeki spektrumlar, ultraviyole ışıkla (295 nm) (A) uyarıldıktan sonra EGFP için, (B) S-Flp-EGFP için ve (C) Dhp-EGFP için ölçülmüştür. (D,E,F) spektrumları EFGP için yeşil ışıkla (488 nm) (D), S-Flp-EGFP için (E) ve Dhp-EGFP için (F) uyarıldıktan sonra ölçüldü. Her protein varyantının doğal (siyah eğriler) ve yeniden katlanmış numunelerinin emisyon spektrumları (yeşil, sırasıyla EGFP'ye, turuncu S-Flp-EGFP'ye ve maviden Dhp-EGFP'ye karşılık gelir), uygun doğal durumun maksimum floresansına normalleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: EGFP varyantlarının protein katlanması ve kromofor olgunlaşmasının floresan ile izlenmesi. (A ) Trp floresan bölgesindeki floresan emisyonu (emisyon 330 nm olarak ayarlandı) ultraviyole ışıkla (295 nm) uyarıldığında kaydedildi. (B) Yeşil ışıkla uyarma üzerine kromofor emisyonu bölgesinde floresan genliğinin gelişimi (488 nm). Zamana bağlı floresan izleri, izleme aralığının sonunda ulaşılan floresan genliğine göre birliğe (0) normalleştirildi. Her panelde, siyah eğriler doğal prolin ile floresan protein varyantının spektrumlarına karşılık gelir, turuncu eğriler S-Flp ikame edilmiş proteinlerin spektrumlarını gösterir ve mavi eğriler Dhp ikame proteinlere karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yapmak	Amino asit dizileri (6xHis etiketinin altı çizili):
EGFP-H6	MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP WPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTR AEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVN FKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDH MVLLEFVTAAGITLGMDELYKHHHHHHH
H6-ŞimdiGFP	MRGSHHQHHHGSVSKGEKLFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGEGDATYGK MSLKFICTTGKLPVPWPTLKTTLTWGMQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGY VQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGVDFKEDGNILGHKLEYN AISGNANITADKQKNGIKAYFTIRHDVEDGSVLLADHYQQNTPIGDGPVLLPD NHYLSTQSKQSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIPLGADELYK
H6-KillerOrange	MRGSHHHHHHHGSECGPALFQSDMTFKIFIDGEVNGQKFTIVADGSSKFPH GDFNVHAVCETGKLPMSWKPICHLIQWGEPFFARYPDGISHFAQECFPEG LSIDRTVRFENDGTMTSHHTYELSDTCVVSRITVNCDGFQPDGPIMRDQ LVDILPSETHMFPHGPNAVRQLAFIGFTTADGGLMMGHLDSKMTFNGSR AIEIPGPHFVTIITKQMRDTSDKRDHVCQREVAHSVPRITSAIGSDQD

Tablo 1: Hedef proteinlerin primer yapıları. Onun etiketleri her dizide altı çizilidir.

λ [nm]	ε [M-1·cm-1] (EGFP)	ε [M-1·cm-1] (S-Flp-EGFP)	ε [M-1·cm-1] (Dhp-EGFP)
488 (≡ CRO)	31,657 (± 1,341)	22,950 (± 290)	27,800 (± 542)
280 (≡ Tyr+Trp)	20,116 (± 172)	23,800 (± 715)	17,300 (± 554)
Yok olma katsayısı ε değerleri (M-1 · cm-1 cinsinden), bilinen protein konsantrasyonları kullanılarak uygun EGFP varyantlarının kaydedilmiş UV-Vis absorpsiyon spektrumlarından hesaplanır. 280 nm'de seçilen dalga boyu, aromatik kalıntıların, tirozin ve triptofanın maksimum emilimine karşılık gelir ve 488 nm, kromofor absorbans dalga boyunu temsil eder.

Tablo 2: Seçilen dalga boylarında EGFP varyantlarının yok olma katsayıları (ε). ε yok olma katsayısı değerleri (M-1 · cm-1'de), bilinen protein konsantrasyonları kullanılarak uygun EGFP varyantlarının kaydedilmiş ^UV-Vis absorpsiyon spektrumlarından hesaplanır. 280 nm'lik seçilen dalga boyu, aromatik artıkların, tirozinin ve triptofanın maksimum emilimine karşılık gelirken, 488 nm maksimum kromofor absorbans dalga boyunu temsil eder.

Ek Materyal: Stok çözeltilerin ve tamponların hazırlanması Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Doğada, protein yapıları ve fonksiyonları ile manipülasyonlar tipik olarak, protein dizisindeki belirli pozisyonlarda bir amino asit kimliğinin değişimine yol açan fenomen olan mutasyonlar nedeniyle meydana gelir. Bu doğal mekanizma, mutagenez şeklinde protein mühendisliği için biyoteknolojik bir yöntem olarak yaygın olarak uygulanmaktadır ve sürece dahil olan 20 kanonik amino asidin repertuarına dayanmaktadır. Bununla birlikte, prolin kalıntılarının değişimi sorunludur. Özel omurga grubu mimarisi nedeniyle,^72'nin değiştirilmesi için kalan 19 kalıntı ile neredeyse hiç değiştirilemez. Örneğin, prolin, en yaygın ikincil yapılarla, yani α-sarmal ve β iplikçiklerle zayıf uyumluluğu nedeniyle polipeptit dizilerinde tipik olarak ikincil bir yapı kırıcı olarak bilinir. Bu prolin özelliği, kalıntı ortak repertuardan başka bir amino aside mutasyona uğradığında kolayca kaybolur. Prolinin kimyasal analogları ile değiştirilmesi, ana prolin kalıntısının temel omurga özelliklerini korurken, spesifik konformasyonel geçişlerine önyargı uygularken veya moleküler hacim ve polaritenin modülasyonlarını üretirken alternatif bir yaklaşım sunar. Örneğin, bakteri kültürlerine hidroksi-, floro-, alkil-, dehidroprolinler, değişken halka boyutlarına sahip yapılar ve daha fazlası gibi analog yapılar sağlamak mümkündür, böylece spesifik prolin kalıntı değişiklikleri içeren bir proteinin üretimini kolaylaştırır.

Bu çalışmada açıklanan seçici basınç birleştirme (SPI) yöntemi, hedef proteindeki tüm prolinlerin ilgili kimyasal analoglarla küresel, yani kalıntıya özgü bir şekilde değiştirilmesine izin verir. Yöntemin önemi, SPI'nın yaygın mutagenez tekniklerine erişilemeyen dizi değişiklikleri oluşturmaya izin vermesi gerçeğiyle yansıtılmaktadır. Örneğin, bu çalışmada gösterildiği gibi, tipik olarak bir veya iki atom değiştirmesini / silinmesini / eklenmesini geçemeyen oldukça küçük yapısal değişiklikler içeren bir hedef proteinin üretilmesine izin verir. Bu tür protein modifikasyonları "atomik mutasyonlar" olarak ^{adlandırılır73,74}. GFP gibi bir floresan proteininde, bu moleküler müdahalenin sonucu, katlanma hızı, lokal polariteler, protein paketleme, ilgili yapısal özelliklerin stabilitesinde görülebilir. Absorbans ve floresan özelliklerindeki değişiklikler, protein katlanması ve kalıntı mikro ortamları üzerindeki etkisinden dolayı dolaylı olarak üretilir. SPI tarafından gerçekleştirilen moleküler değişikliklerin hassasiyeti, prolinlerin diğer kanonik kalıntılara mutasyonlarına kıyasla tipik olarak çok daha yüksektir, ikincisi tipik olarak protein katlanması, üretimi ve izolasyonu için zararlıdır.

Bir üretim yöntemi olarak, SPI yaklaşımı, aminoasil-tRNA sentetaz cebinin substrat toleransını, doğal amino asidin kimyasal analoglarına doğru kullanır. Sentetaz, amino asit yapısının doğru tanımlanmasından sorumludur, proteinlere dahil edilme ise çeviri sürecinde aşağı yönde gerçekleşir. Enstrümantal olarak, SPI'daki protein üretimi, izolasyonu ve saflaştırılması, diğer rekombinant protein ekspresyon teknikleri için tipik bir şekilde gerçekleştirilir; Bununla birlikte, protokole aşağıdaki gibi bazı eklemeler ile: Değiştirilmek üzere bağlanan Prolin, fermantasyon işleminin başlangıcında sağlanır, böylece hücreler bozulmamış hücresel makinelerini büyütebilir ve geliştirebilir. Bununla birlikte, hücreleri protein ekspresyonu için en uygun logaritmik fazda tutmak için hücre kültürünün maksimum optik yoğunluğa ulaşmasına izin verilmez. Bu noktada SPI yönteminin iki ana varyasyonu vardır. İlkinde, prolin konsantrasyonu ilk büyüme ortamında (kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam) ayarlanır, böylece prolinin tükenmesi herhangi bir dış müdahale olmadan gerçekleşir. Hücreler, logaritmik büyüme aşamasından çıkmadan önce ortamdaki prolinleri tüketir ve daha sonra analog eklenir ve ilgili protein üretimi indüklenir. Yöntemin ikinci versiyonunda, hücreler logaritmik fazlarının ortasına kadar prolin içeren ortamda yetiştirilir. Bu noktada, hücreler çıkarılmalı ve fiziksel olarak artık prolin içermeyen, sadece analogu içeren başka bir ortama aktarılmalı ve daha sonra ilgilenilen proteinin indüksiyonu yapılmalıdır. Her iki versiyonda da, önceden yetiştirilmiş hücrelere analog ve protein indüksiyon reaktifi sağlanır. Vahşi tip proteinin izolasyonu ve saflaştırılması, varyantlarla aynı şekilde gerçekleştirilir. Prensip olarak, mevcut her Pro-auxotrophic suşu bir ifade konağı olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, en uygun konağı tanımlamak için ifade testleri önerilir. Ayrıca, protein verimini optimize etmek için kimyasal olarak tanımlanmış farklı ortamların testleri kullanılabilir.

SPI için dikkate alınması gereken kimyasal analoglarla ilgili çözünürlük ve konsantrasyon gibi belirli gereksinimler vardır. Amino asitlerin metabolik mevcudiyeti ve alımı, ortamdaki çözünmüş moleküllerin sayısına bağlıdır. Belirli bir bileşiğin çözünürlüğünü arttırmak için, hafif asidik veya alkali koşullar seçilebilir. Yapay moleküller hücre toksisiteleri nedeniyle büyüme engelleyici etkilere neden olabileceğinden, hücre stresini önlemek için konsantrasyon minimuma indirilmelidir⁷⁵.

SPI'nın küçük bir zayıflığı, değiştirilmesi gereken daha fazla sayıda pozisyonla birleşme verimliliğinin azalmasıdır. Prensip olarak, hedef biyomolekül içindeki amino asit frekansının bölgeye yönelik mutagenez ile azaltılması bu sorunu çözebilir. Bununla birlikte, istenen bir proteinin yapısal ve fonksiyonel özellikleri, birincil yapının değiştirilmesinden etkilenebilir.

Daha önce de belirtildiği gibi, SPI kanonik amino asidin kalıntıya özgü olarak değiştirilmesine izin verir. Bu, kanonik olmayan amino asitlerin, protein fonksiyonu veya katlanması için vazgeçilmez olan korunmuş kalıntılar da dahil olmak üzere, hedef protein içindeki kanonik amino asidin her konumuna yerleştirildiği anlamına gelir. Siteye özgü birleştirme için alternatif yöntemler, bu sorunun üstesinden gelmek için tek olasılıktır³. Son birkaç on yılda, önceden tanımlanmış bölgelerde modifiye kalıntılar içeren proteinler üretebilen ortogonal çift yöntemi geliştirilmiştir. Bu yöntemin en yaygın modifikasyonu, stop kodon baskılaması olarak bilinir. Bu yöntem, sentetik amino asitlerin sahaya özgü olarak dahil edilmesine adanmış tasarlanmış bir ortogonal çeviri sistemine dayanmaktadır⁷⁶. Farklı yan zincir modifikasyonlarına sahip 200'den fazla amino asit, bu yaklaşım kullanılarak bugüne kadar proteinlere dahil edilmiştir⁷⁷. Bununla birlikte, bu çeviri sistemleri prolin analoglarının hedef proteinlere yerleştirilmesi için hala uygun değildir. Ayrıca, minör amino asit modifikasyonları durumunda yöntemin performansı düşük kabul edilir, çünkü aminoasil-tRNA sentetazın bazı arka plan karışıklıkları tipik olarak mühendislik çeviri sistemlerinde kalır.

SPI kullanarak, bir dizi β varil floresan protein varyantı ürettik ve prolinin doğal olmayan analoglarıyla değişiminin sonuçlarını inceledik. R-Flp ve Dfp ile prolin replasmanı durumunda, ekspresyon konakçısı tarafından işlevsiz bir protein üretildi. Etki muhtemelen proteinin yanlış katlanmasıyla üretilir. İkincisi, ana protein yapıları²⁷ tarafından tercih edilmeyen R-Flp tarafından teşvik edilen C^4-exo konformasyonundan kaynaklanabilir. Dfp ile, yanlış katlamanın, prolin kalıntısı^27'deki trans-cis peptid bağ izomerizasyonunun azalan hızı ile üretilmesi muhtemeldir. İkincisinin, β varil oluşumunu ve ardından kromofor olgunlaşmasını etkileyen protein katlanmasının kinetik profilindeki sınırlayıcı adımlar arasında olduğu bilinmektedir. Gerçekten de, her iki amino asit, R-Flp ve Dfp için, protein üretimi toplanmış ve çözünmez bir protein ile sonuçlandı. Sonuç olarak, kromofor oluşumu gerçekleşemedi ve floresan tamamen kayboldu. Bununla birlikte, S-Flp ve Dhp ile, uygun protein olgunlaşması gözlendi ve her analog / protein kombinasyonu için floresan protein örnekleri elde edildi. Proteinin absorbans ve floresan özelliklerindeki bazı modülasyonlara rağmen, bunlar büyük ölçüde vahşi tip proteinlerinkine benzer kalmıştır. Amino asit ikamesinin etkisi, yeniden katlanan kinetik çalışmalarında ortaya çıkmıştır. Model çalışmaları, bu kalıntının trans-cis amid dönme hızında bir miktar iyileşme sağlayabileceğini ve C ^4-endo konformasyonunun oluşumuna yol açabileceğini göstermiştir. Her iki faktörün de EGFP'deki bu kalıntının yararlı kinetik etkilerine katkıda bulunması muhtemeldir. Buna karşılık, Dhp, ana proteine maksimum derecede benzer kinetik katlama profilleri üretti. İncelenen floresan proteinlerinde sadece atomik mutasyonlar tarafından üretilen sonuçların çeşitliliği, SPI üretim yönteminin hedef protein özelliklerini değiştirmedeki potansiyelini göstermektedir. Prolinin analoglarla replasmanı ile indüklenen protein değişiklikleri,^78,79,80 enzimlerinin ve ^81,82 iyon kanallarının mühendisliğinde ve ayrıca protein stabilitesinin genel mühendisliğinde daha fazla etkiye sahiptir.

SPI yönteminin temel sınırlaması, prolinin ilgili analoglarla taşınmasında "ya hep ya hiç" modudur. Hangi prolin kalıntılarının analoglarla değiştirilmesi gerektiğini ve hangilerinin değiştirilmeden kalması gerektiğini kesin olarak seçebilmek büyük avantaj sağlayacaktır. Bununla birlikte, şu anda, mikrobiyal bir üretim konağı kullanarak böylesine sofistike bir üretim gerçekleştirebilecek bir teknik yoktur. ^83,84 proteinlerinin kimyasal sentezi ve hücresiz üretim^85,86, pozisyona özgü prolin modifikasyonları üretebilen iki alternatif yöntemdir. Bununla birlikte, operasyonel karmaşıklıkları ve düşük üretim verimleri, onları canlı hücrelerdeki üretime kıyasla daha düşük hale getirir. Şu an itibariyle, SPI, atomik mutasyonlar taşıyan karmaşık proteinlerin üretimi için operasyonel olarak en basit ve sağlam yaklaşım olmaya devam etmektedir. Doğal olmayan amino asit ikamelerini tanıtarak, yöntem, prolin replasmanları tarafından üretilen floresan proteinlerin katlanması ve ışık emilimi / emisyonundaki değişikliklerle örneklendiği gibi, protein özelliklerinin hedeflenen bir şekilde değiştirilmesine izin verir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
LC-MS	Asetonitril	VWR HiPerSolv CHROMANORM ULTRA, 83642	LC-MS sınıfı gerekli
37.5:1 oranında akrilamid ve bisakrilamid sulu stok çözeltisi (ROTIPHORESE Jel 30)	Carl Roth	3029.1
Agar-agar	Carl Roth	5210
Amonyum molibdat ((NH4)2MoO4)	Sigma-Aldrich	277908
Amonyum peroksidisülfat (APS)	Carl Roth	9592.2	≥ %98, pa, ACS sınıfı gerekli
Amonyum sülfat ((NH4)2SO4)	Sigma-Aldrich	A4418
Ampisilin sodyum tuzu	Carl Roth	K029
Biotin	Sigma-Aldrich	B4501
Bromofenol mavisi	Sigma-Aldrich	B0126
Kalsiyum klorür (CaCl< sub>2)	Sigma-Aldrich	C5670
Coomassie Brillant Blue R 250	Carl Roth	3862
Bakır sülfat (CuSO4)	Carl Roth	CP86.1
D-glikoz	Carl Roth	6780
1,2-Bis- (dimetilamino)-etan,  N, N, N', N'-Tetrametiletilendiamin (TEMED)	Carl Roth	2367.3	≥ %99, pa, elektroforez için
1,4-ditiotreitol (DTT)	Carl Roth	6908
Diklorometan (DCM)	Sigma-Aldrich	270997
di-potasyum hidrojen fosfat (K2HPO<>alt4)	Carl Roth	P749.1
di-sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4)	Carl Roth	X987
DNase I	Sigma-Aldrich	D5025
Dowex 50WX8-100 (hidrojen formu)	Acros Organics / Thermo Fisher Scientific (Waltham, ABD)	10731181	katyon değişim reçinesi
Etanol	Carl Roth	9065.1
Formik asit	VWR	HiPerSolv LC-MS için CHROMANORM, 84865	LC-MS sınıfı gerekli
Buzlu asetik asit	Carl Roth	3738.5	100%, pa
Gliserol	Carl Roth	3783
İmidazol	Carl Roth	X998
Hidrojen klroidi (HCl)	Merck	295426
Demir (II) klorür (FeCl2< / sub>)	Sigma-Aldrich	380024
İzopropanol	Carl Roth	AE73.1
İzopropil ve beta;-D < / em>-1- tiyokalaktopiranosit (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758
Lizozim	Sigma-Aldrich	L6876
Magnezyum klorür (MgCl2)	Carl Roth	KK36.1
Magnezyum sülfat (MgSO4)	Carl Roth	8283.2
Manganez klorür (MnCl2)	Sigma-Aldrich	63535
β-merkaptoetanol	Carl Roth	4227.3
PageRuler Lekesiz Protein Merdiveni	Thermo Fisher Scientific	26614
Potasyum klorür (KCl)	Carl Roth	6781.3
Potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
RNase A	Carl Roth	7156
Sodyum klorür (NaCl)	Carl Roth	P029
Sodyum dihidrojen fosfat (NaH2< / sub>PO4< / sub>)	Carl Roth	T879
Sodyum dodesil sülfat (NaC12H25SO4)	Carl Roth	0183
Tiamin	Sigma-Aldrich	T4625
Trifloroasetik asit (TFA)	Sigma-Aldrich	T6508
Tris hidroklorür (Tris-HCl)	Sigma-Aldrich	857645
Tris (hidroksimetil) -aminometan (Tris)	Carl Roth	5429
Tripton	Carl Roth	8952
Maya özü	Carl Roth	2363
Çinko klorür (ZnCl2< / sub>)	Sigma-Aldrich	229997
L< / em>-alanin	Sigma-Aldrich	A7627
L< / em>-arginin	Sigma-Aldrich	A5006
L< / em>-asparagin	Sigma-Aldrich	A8381
L< / em>-aspartik asit	Sigma-Aldrich	A0884
L-sistein	Sigma-Aldrich	C7352
L-glutamik asit	Sigma-Aldrich	G2128
L-glutamin	Sigma-Aldrich	G3126
L-glisin	Sigma-Aldrich	G7126
L-histidin	Sigma-Aldrich	H8000
L-izolösin	Sigma-Aldrich	I2752
L-lösin	Sigma-Aldrich	L8000
L-lizin	Sigma-Aldrich	L5501
L-metiyonin	Sigma-Aldrich	M9625
L-fenilalanin	Sigma-Aldrich	P2126
L-prolin	Sigma-Aldrich	P0380
L-serin	Sigma-Aldrich	S4500
L-treonin	Sigma-Aldrich	T8625
L-triptofan	Sigma-Aldrich	T0254
L < / em>-tirozin	Sigma-Aldrich	T3754
L< / em > valin	Sigma-Aldrich	V0500
(4 S < / em >) -floroprolin	Bachem	4033274	Tüm prolin analoglarının prolin içermediğinden emin olun, içeriği kontrol edin. Aksi takdirde, ifade sırasında prolin kontaminasyonlarını tüketmek için bir adım ekleyin.
(4 R< / em >) -floroprolin	Bachem	4033275	Tüm prolin analoglarının prolin içermediğinden emin olun, içeriği kontrol edin. Aksi takdirde, 3,4-dehidroprolin Bachem ekspresyon sırasında prolin kontaminasyonlarını tüketmek için bir adım ekleyin
		4003545	Tüm prolin analoglarının prolin içermediğinden emin olun, içeriği kontrol edin. Aksi takdirde, ifade sırasında prolin kontaminasyonlarını tüketmek için bir adım ekleyin
4,4-difloroprolin	Enamin	EN400-17448	Tüm prolin analoglarının prolin içermediğinden emin olun, içeriği kontrol edin. Aksi takdirde, ekspresyon sırasında prolin kontaminasyonlarını tüketmek için bir adım ekleyin
Konik polistiren (Falcon) tüpleri, 15 mL	Fisher Scientific	14-959-49B
Konik polistiren (Falcon) tüpleri, 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Diyaliz membranı, Moleküler Ağırlık Kesme (MWCO) 5.000	Spectrum Medical Industries	Spectra/Por MWCO 5000 diyaliz membranı, 133198
İmmobilize Metal İyon Afinite Kromatografisi (IMAC) sütunu 1 mL, Ni-NTA	GE Healthcare	HisTrap HP, 1 mL, 17-5247-01
Luer-Lock şırınga, 5 mL	Carl Roth	EP96.1
Luer-Lock şırınga, 20 mL	Carl Roth	T550.1
Luer-Lock şırınga, 50 mL	Carl Roth	T552.1
Mikrosantrifüj tüpleri, 1.5 mL	Eppendorf
Petri kapları (polistiren, steril)	Carl Roth	TA19
pQE-80L plazmid vektörü	Qiagen	artık mevcut değil	N-terminali ile değiştirildi pQE Vektör seti Cat No./ID: 32915
Pro-oksotrofik E. coli strain JM83	Addgene	50348	https://www.addgene.org/50348/
Pro-oksotrofik E. coli suşu JM83	ATCC	35607
Yuvarlak tabanlı polistiren tüpler, 14 mL	Fisher Scientific	Corning Falcon, 14-959-1B
Şırınga filtresi 0.45 ve mikro; poliviniliden diflorür (PVDF) membranlı m	Carl Roth	CCY1.1
Sigma-Aldrich	Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) sütunu	, 3 & m partikül boyutu, 10 cm x 2,1 mm,	konik 0,1 mL cam ekler, vidalı kapaklar ve septa
HPLC otomatik numune alma cihazı şişeleri ile 1,5 mL	Sigma-Aldrich	Supelco 854165
LC-ESI-TOF-MS için Kütle spektrometresi	Agilent	Agilent 6530 Doğru Kütle QTOF
Kütle spektrometresi veri analiz yazılımı	Agilent	MassHunter Kalitatif Analiz yazılımı v. B.06.00
1,5 mL Eppendorf tüpleri için tezgah üstü santrifüj Eppendorf		5427 R
50 mL Falcon tüpleri için soğutma santrifüjü	Eppendorf	5810 R
Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC) sistemi	GE Healthcare	ä KTA saf 25 L
Floresan spektrometresi	Perkin Elmer	LS 55
Bakteriyel hücre bozulması için yüksek basınçlı mikroakışkanlaştırıcı	Mikroakışkanlar	LM serisi " Z” tip hazne
Bakteri yetiştiriciliği için orbital çalkalayıcı	Infors HT	Minitron
Sıvı kromatografisi (LC) için peristaltik pompaGE	Healthcare	P-1
Bakteriyel hücre bozulması için ultrasonik homojenizatör	Omnilab	Bandelin SONOPULS HD 3200,	MS72 sonifier uçlu
UV-Vis spektrofotometresi	Biochrom	ULTROSPEC 2100
UV-Vis/NIR spektrofotometre	Perkin Elmer	LAMBDA 950 UV/Vis/NIR