Bu makalede, korneanın anatomisini ve histolojisini ve iyileşme süreçlerini incelemek için geliştirilen yeni bir hayvan modeli açıklanmaktadır. Bu yeni hayvan modeli, insan korneasına birçok benzerliği olan bir korneaya sahip olan Moğol gerbilini kullanıyor.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yara İyileşmesinin Bir Hayvan Modeli Olarak Moğol Gerbilleri
Bu makalede
Özet
Özet
Kornea yara iyileşmesi çalışmaları uzun süredir yürütülmekte ve hastaların göz sağlığının iyileştirilmesine katkıda bulunan tedavilerin geliştirilmesine ve acıların azaltılmasına yardımcı olmuştur. Tarihsel olarak, kornea iyileşmesi fareler ve sıçanlar gibi kemirgenlerde incelenmiştir, ancak bu modeller insan bozukluklarını tamamen taklit etmeyebilir. Bununla birlikte, Moğol gerbilleri (Meriones unguiculatus) gibi diğer kemirgenler hakkındaki bilgiler kornea araştırmalarında yetersizdir.
Burada, fotorefraktif keratektomi sonrası kornea iyileşmesini incelemek için yeni bir hayvan modeli geliştirme tekniğini açıklıyoruz. M. unguiculatus'un korneasıyla ilgili sınırlı literatür nedeniyle, normal korneanın histolojik analizini de tanımladık. Bu araştırma teknikleri, Moğol gerbillerinin korneaları ile insanlar arasındaki genetik, anatomi ve fizyoloji açısından benzerlik nedeniyle göz hastalıklarının incelenmesinde de kullanılabilir.
Giriş
Ön segment cerrahisi için kilit kaygılar olan kornea yarasının iyileşmesinin en önemli yönlerinden bazıları, epitel mimarisinin bütünlüğü, kornea stroma saydamlığının korunması ve son olarak korneanın kırılma özellikleri açısından sonuçtur1.
Kornea göz küresinin önündeki en dış berrak dokudur ve bu nedenle travmaya, enfeksiyonlara ve yanıklara karşı hassastır; Bu yaraların bozulmuş iyileşmesi görme sağlığını tehlikeye atabilir2.
Şu anda, kornea iyileşmesini incelemek için çeşitli hayvan modelleri mevcuttur ve bazıları türlere ve çalışılacak mekanizmanın türüne bağlı olarak diğerlerinden daha iyidir1. Gerbils2'nin retinası üzerinde daha önce yapılan araştırmaların birkaç kaydı vardır. Bununla birlikte, şimdiye kadar, bu kemirgenlerin korneasındaki yara izi süreçleri hakkında yayınlanmış bir literatür yoktur.
Burada, Meriones unguiculatus'u (Moğol gerbili) korneada yara iyileşmesinin bir hayvan modeli olarak sunuyoruz. Fotorefraktif keratektomi sonrası kornea iyileşmesini sağlayacak prosedürler tanımlanmıştır, bu da farklı kornea skarlaşma süreçlerini incelememize, yara iyileşmesini canlı dokunun dinamik fazları açısından anlamamıza ve son olarak uygun gelecekteki tedavileri planlamamıza olanak tanır3. Fototerapötik keratektomi, kornea yaralanmasının derinliği ve çapı gibi parametreleri hassas bir şekilde kontrol etme imkanı olan yüksek oranda tekrarlanabilir bir tekniktir4. Ayrıca, bu teknik, aletlere veya prosedürü gerçekleştiren operatöre özgü değişkenler ekleyebilecek cerrahi aletler veya kimyasal çözeltiler (örneğin, salin çözeltisi, formalin, alkol vb.) içeren prosedürler gerektirmez5.
Bu makalede sunulan deney için benzer boyut ve ağırlıklarda (yaklaşık 90 g) üç adet 6 aylık erkek gerbil kullanılmıştır. İşlemler sadece sağ gözlerde yapıldı. Bir gerbil (gerbil 1 veya kontrol olarak adlandırılır) fototerapötik keratektomiye tabi tutulmadı ve tüm normal oküler yapıları değerlendirmek için enüklee edildi. Fototerapötik keratektomi, excimer lazer tarafından üretilen ultraviyole ışığın korneaya kontrollü olarak verilmesini içerir ve refraktif cerrahi gerçekleştirmek için geliştirilmiştir6. Fareler7 gibi diğer kemirgenlerde kullanılmıştır. Diğer iki gerbil fototerapötik keratektomiye tabi tutuldu. Bunlardan biri 24 saatte (gerbil 2 olarak adlandırılır) ve diğeri ameliyattan sonra 96 saatte (gerbil 3 olarak adlandırılır) enüklee edildi.
Bu deneyi gerçekleştirmek için, incelenecek her koşul için rastgele seçilen bir gerbil filme alındı, ancak bu deney daha önce her koşul için toplamda 16 gerbil ile gerçekleştirildi. Düzenleme nedenleriyle, örnek olarak her koşul için rastgele seçilmiş bir gerbil (toplamda üç gerbil) kullanılmasına karar verildi.
Bu araştırmanın temel amacı, mevcut en iyi hayvan modelini araştırmaktır. Bununla birlikte, tüm türlerin insan gözüne benzer göz özelliklerine sahip olmadığını belirtmek önemlidir8. Bu makalede, Meriones unguiculatus'un korneasını incelemek için kullanılan metodoloji ve iyileşme sürecini incelememize izin veren kornea yaralanmasını oluşturmak için yapılan prosedür açıklanmaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm araştırma prosedürleri, Universidad Católica de Córdoba'nın "Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kurumsal Komisyon" tarafından onaylandı ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Araştırma Konseyi Kılavuzu'nu takip etti. Bu prosedürler ayrıca Universidad Católica de Córdoba'nın "Facultad de Ciencias de la Salud" ve "Instituto de la Visión Cerro" yetkilileri tarafından onaylandı.
1. Gerbil kullanımı ve anestezi
NOT: Tüm hayvanlar spesifik patojensiz (SFP) erkek Moğol gerbilleriydi ve İmmünoloji ve Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma ve Geliştirme Merkezi (CIDIE) tesislerinde (Córdoba, Arjantin) tutuldu. Universidad de La Plata'dan (Buenos Aires, Arjantin) elde edildiler.
- Gerbilleri sosyal olarak mısır koçanı yataklarıyla kaplı polisülfon kafeslerde barındırın. Su şişelerinde yiyecek ve filtrelenmiş musluk suyu sağlayın ad libitum. Oda sıcaklığı aralığının 18 °C ila 24 °C olduğundan ve 12:12 saatlik bir açık-karanlık döngüsünün kullanıldığından emin olun.
- Her gerbili ayrı ayrı tartın ve karışıklığı önlemek için her birini tanımlayın. Gerbilin kuyruğunun tabanında silinmez bir mürekkep işaretleyici ile bir işaret yapın. Gerbilin kulağını tutmak için cımbız kullanın ve kemirgenin kulağındaki silinmez işaretleyiciyi kullanarak bir işaret yapın. Bir laboratuvar ve büyük bir biyotermik varsa, her kemirgen için karşılık gelen tanımlamaya sahip benzersiz bir kafes atayın.
- Laminer akış başlığını% 70 etanol çözeltisi ile dezenfekte edin. İğneler, şırıngalar ve raflar dahil olmak üzere tüm cerrahi ve tek kullanımlık aletleri kaputun içindeki çalışma alanına yerleştirin. Davlumbaza da tek kullanımlık bir cerrahi köpük yerleştirin.
- Ölçümü kolaylaştırmak amacıyla kemirgenleri hassas terazide tutmak için küçük, açık plastik bir kap kullanın.
- Bu deney için benzer boyut ve ağırlıklarda (~ 80 g) üç adet 6 aylık erkek Moğol gerbili kullanın. Her seferinde bir kere, her kafesi laminer akış davlumbazının içindeki kemirgen ile yerleştirin. Kafesleri açın, gerbillerin her birini tanımlayın ve terazide tartın.
NOT: Gerbiller zararsız ama hassas hayvanlardır. Gerbilleri tutarken tek kullanımlık eldiven giyin. - Gerbili kuyruğundan sıkıca tutmak için baskın olmayan elinizle tutun. Hayvanı ventral bölge yukarı bakacak şekilde tutmak için baş parmak ve işaret parmağı kulakların arkasında olacak şekilde baskın eli kullanın. Kuyruğu tutmak için serçe parmağınızı kullanın.
- Bir şırıngayı 1 mL ketamin ve ksilazin ile 30 G'lik bir iğne ile doldurun. Anesteziyi baskın eli kullanarak kemirgen içine intraperitoneal olarak uygulayın (50-100 mg/kg ketamin ve 2 mg/kg ksilazin)9 . Etkinin süresi yaklaşık 20-50 dakika olacaktır (varyasyonlar meydana gelebilir).
- Gerbilin tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için, korneada kesi yapmadan önce bir ayak parmağı sıkışması, kuyruk sıkışması ve kornea yansıması vb. İle kontrol edin.
NOT: Tüm prosedürleri sadece sağ gözle gerçekleştirin.
2. Korneanın optik koherens tomografisi (OKT)
- Ekipmanı sekresyonlardan veya hayvan kıllarından korumak için steril cerrahi örtüler yerleştirin.
- Operatörlerden birinin hayvanı tuttuğundan ve başka bir operatörün görüntüleri çektiğinden emin olun. Operatör, gerbili tutarken ellerini ekipmanın üzerine koymalıdır, böylece gerbilin gözü mümkün olduğunca sabit ve incelenmek üzere mümkün olduğunca sabit olur. Gerbili tutan eli çene dayanağı üzerinde dinlendirin..
- OCT'yi denetleyen yazılımı başlatın ve Görüntü Al'a ve ardından İstediğiniz Görüntüyü Kaydet'e basın. Korneanın çoklu sagital ve koronal dilimlerini gerçekleştirin. OCT'nin altındaki gözü görüntüleyin ve kemirgen korneanın ön segmentini görüntülemek için birden fazla dilim yapın.
NOT: Elde edilen görüntü keskin değilse ve göz hafifçe hareket etmişse, yeterli görüntü elde etmek için prosedürü birkaç kez tekrarlayın. - OCT yazılımını kullanarak, merkezi ve çevresel bölgelerin pakimetrik ölçümlerini gerçekleştirin. Yazılımın ana ekranında, Görüntü Al'a basın ve ardından İstediğiniz Görüntüyü Kaydet düğmesine basın.
- Normal veya kontrol gözünde ve fototerapötik keratektomiden hemen sonra diğer kemirgen gözlerinde ölçümler yapın.
3. Excimer lazer fototerapötik keratektomi (PTK)
- Ekipmanı sekresyonlardan veya hayvan kıllarından korumak için excimer lazer cihazına steril cerrahi örtüler yerleştirin.
- Cerrahi işlemden 5 dakika önce tedavi edilmek üzere göze bir damla topikal proparakain hidroklorür (% 0.5) damlatın.
- Gerbili sıkıca tutmak için baskın olmayan eli kullanın. Baskın el ile, hayvanın göz kapaklarını açın, böylece görüntüler düzgün bir şekilde yakalanabilir. Odaklanabilmek ve keskin bir görüntü elde edebilmek için, gerbili tutan kişinin ellerinin ekipmanın kafasına dayandığından emin olun. Hayvanı tutan elleri bir hastanın boynunu yerleştireceği yere yerleştirin.
- Sağ göze PTK ablasyonu yapın. Aşağıdaki parametreleri kullanın: 60 μm ile 62 μm kalınlığında bir ablasyon, 3 mm'lik bir optik bölge, 4 s'lik bir süre ve toplam 1.867 darbe.
NOT: PTK sadece gerbil 2 ve gerbil 3 üzerinde yapılır. Bu adımda, ikinci operatör kornea dokusunu ablate etmek için lazeri hazırlar ve aktive eder. - İşlemden hemen sonra, tedavi edilen gözlerdeki yüzey değişikliklerini kaydetmek ve belgelemek için fotoğraf çekin ve OCT analizi yapın.
- İşlem tamamlandıktan sonra, kemirgenleri kafese geri yerleştirin, hayati belirtileri izleyin (kalp atış hızı: dakikada 360 atım; rektal sıcaklık: 37-38.5 ° C; solunum hızı: dakikada 90 nefes) ve hayvanın anesteziden kurtulmasına izin verin.
4. Kornea PTK sonrası gerbillerin uyanışı
- Buprenorfin (0.1mg / kg ila 0.05mg / kg) ve atipamezol (0.1-1 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonlarla uygulanır.
- Her gerbili kendi ev kafesine yerleştirin ve normal uyanış için hayati belirtileri izleyin (normal vücut ısısı 37-39 ° C'dir).
- Yüzeyi temiz tutmak ve enfeksiyonu önlemek için bir eritromisin merhem uygulayın. Bu yordamı günde iki kez gerçekleştirin.
- PTK'dan sonraki iki ardışık günde analjezi ve göz merhemi için buprenorfin (her 6-12 saatte bir) deri altından (0.01-0.05 mL) uygulayın.
5. Ötenazi yöntemi
- Mümkün olduğunda ev kafesinde ötenazi yapın.
- Sıkıştırılmış karbondioksit (CO2) gazını ev kafesine sokun. Ev kafesindeki mevcut havaya CO2 eklenerek dakikada hazne hacminin% 30-70'inin doldurulma hızı, hedefi karşılayan bir karışım elde etmek için yeterlidir (10 L hacimli bir oda için 3-7 L / dak'lık bir akış hızı kullanın). Kemirgenin ölümünü sağlamak için servikal çıkığı (ikincil bir ötenazi yöntemi olarak) kullanın.
- Gerbil 2 ve gerbil 3 ameliyatından sonra sırasıyla 24 saat ve 96 saatte, kornea iyileşmesini gözlemlemek için göz küresinin (hem normal göz küresi hem de ameliyat geçiren) enükleasyonunu gerçekleştirmek için hayvanı ev kafesinden çıkarın.
- Hayvanı ameliyat masasına yerleştirin ve yaklaşık 1 dakika boyunca kalp atışı olup olmadığını kontrol edin.
6. Göz cerrahisi
- Göz küresine erişmek için üst ve alt göz kapaklarını çıkarın. Göz kapaklarını çıkarmak için cerrahi forseps ve makas kullanın. Çalışma alanının boyutu o kadar küçük ve hassastır ki, göz kapaklarının çıkarılması göz küresinin zarar görmeden enüklee edilmesini sağlar.
- Göz küresini enüklee etmek için, dış kutuda bir kesi yapın ve makası arka yönde yönlendirin. Göz küresini yörüngeden ayırarak bu prosedürü iç kutudan tekrarlayın.
- Göz küresinin arkasındaki optik siniri kesitleyin. Bu tekniği uygularken posterior orbital pleksusun genellikle hafif kanama yarattığı ve bunun da işi zorlaştırdığı açıklığa kavuşturulmalıdır.
- Artık kanı yıkamak için göz küresini steril salin çözeltisi içeren bir mikrosantrifüj tüpüne 30 s ila 1 dakika boyunca sokun.
- Göz küresini, aşağıda açıklandığı gibi sonraki anatomo-patolojik analiz için% 10 formaldehit içeren bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Birden fazla görüntü ve fotoğraf çekin.
7. Anatomo-patolojik analiz
- Tüm gözü 6-24 saat boyunca% 10 tamponlu formaline yerleştirin.
- Bir mikrotom kullanarak dokuyu kesin. Kesilen dokunun 3 mm kalınlığa sahip olduğundan emin olun.
- Dokuyu 30-90 dakika boyunca% 96 alkole batırın ve bu prosedürü iki kez tekrarlayın.
- Dokuyu 30-90 dakika boyunca izopropil alkole yerleştirin ve bu prosedürü iki kez tekrarlayın.
- Dokuyu 1-3 saat boyunca ksilen veya ksilen yerine koyun.
- Dokuyu en az 1 saat boyunca sıvı kerosen içine yerleştirin.
- Dokuyu yerleştirmek ve sıvı parafine gömmek için bir blok kullanın. Katılaşmasına izin verin (soğuk bir yere koyun) ve kesin.
- Mikrotomu üreticinin talimatlarına göre bölümleme için hazırlayın.
- Daha sonra, hematoksilin ve eozin gibi lekeler kullanın.
- Fotoğraf makinesi mikroskopa eklenmiş olarak resimler elde edin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu çalışmada, tüm kornea yapısı histolojik teknikler ve optik koherens tomografi gibi anterior segmentin tamamlayıcı çalışmaları kullanılarak kapsamlı bir şekilde analiz edilmiştir. Ön segment yapılarının optik koherens tomografisi kullanılarak yapılan görüntü analizi, merkezi ve periferik kornea kalınlıkları sırasıyla 160 μm ve 106 μm ± 2 μm olan normal bir epitel ve stroma (Şekil 1) göstermektedir. Diğer yayınlar ayrıca diğer kemirgenlerin korneasının çevre10'a doğr...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kornea yarasının iyileşmesinin fizyolojisi, doku yenilenmesi ile homeostazın sürdürülmesi arasında bir dengedir. Aşırı yara iyileşmesi fibroz ve yara izine yol açabilir ve bu da sonuçta organ fonksiyonlarının kaybına neden olabilir. Kornea cerrahisi prosedürlerinin hızlı evrimi ile birlikte, kornea yara iyileşmesini ve ilgili fizyolojik ve patolojik olayları anlamanın önemi göz ardı edilemez11.
Çok sayıda araştırma çalışması, gerbillerin, esas olarak günlük davranış
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Mühendis Rodrigo de la Fuente'ye paha biçilmez yardımı ve teknik desteği için teşekkür ederiz. Ayrıca anlatım için María Eugenia Corbela'ya ve figürlerin baskısı için Priscilla Hazrún'a teşekkür ederiz. Hugo Luján, İmmünoloji ve Bulaşıcı Hastalıklar Araştırma ve Geliştirme Merkezi'ndeki (CIDIE) tesisleri kullanmamıza izin verdi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anestezi | Tododrogas | ||
| Eppendorf tüpleri | Tododrogas | ||
| Excimer Lazer | Technolas | 2022445 | |
| Floresein | Poen | ||
| Forseps | Ofcor | 3339 | |
| Formaldehit | Tododrogas | ||
| Eldiven | Tododrogas | ||
| Ketamin ve nbsp; | Sigma-Aldrich | ||
| Optik koherens tomografi | Optovue | 659007 | |
| Proparacaine | Poen | ||
| Makaslar | Ofcor | 3336 | |
| Steril perdeler | Soporte hospitalario | ||
| Steril gazlı bezler | Soporte hospitalario | ||
| Şırıngalar ve iğneler | Tododrogas | ||
| Ksilazin | Sigma-Aldrich |
Kaynaklar
- Kuo, I. C. Corneal wound healing. Current Opinion in Ophthalmology. 15 (4), 311-315 (2004).
- Agrawal, V. B., Tsai, R. J. Corneal epithelial wound healing. Indian Journal of Ophthalmology. 51 (1), 5-15 (2003).
- Lu, L., Reinach, P. S., Kao, W. W. Corneal epithelial wound healing. Experimental Biology and Medicine. 226 (7), 653-664 (2001).
- Rathi, V. M., Vyas, S. P., Sangwan, V. S. Phototherapeutic keratectomy. Indian Journal of Ophthalmology. 60 (1), 5-14 (2012).
- Baumeister, M., Bühren, J., Ohrloff, C., Kohnen, T. Corneal re-epithelialization following phototherapeutic keratectomy for recurrent corneal erosion as in vivo model of epithelial wound healing. Ophthalmologica. 223 (6), 414-418 (2009).
- Fagerholm, P. Phototherapeutic keratectomy: 12 years of experience. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 81 (1), 19-32 (2003).
- Mohan, R. R., Stapleton, W. M., Sinha, S., Netto, M. V., Wilson, S. E. A novel method for generating corneal haze in anterior stroma of the mouse eye with the excimer laser. Experimental Eye Research. 86 (2), 235-240 (2008).
- Shah, D., Aakalu, V. K. Murine corneal epithelial wound modeling. Methods in Molecular Biology. 2193, 175-181 (2021).
- Gerbil-Specific Anesthesia Guidance. Animal Resources Center. The University of Texas at Austin. , Available from: research.utexas.edu/wp-content/uploads/sites/7/2020/02/Gerbil_Anesthesia_Guidance_ARC_112519.pdf (2020).
- Zorio, D. A. R., et al. De novo sequencing and initial annotation of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) genome. Genomics. 111 (3), 441-449 (2019).
- Kalha, S., Kuony, A., Michon, F. Corneal epithelial abrasion with ocular burr as a model for cornea wound. Journal of Visualized Experiments. (137), e58071(2018).
- Yang, S., et al. The electroretinogram of Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus.): Comparison to mouse. Neuroscience Letters. 589, 7-12 (2015).
- Baker, A. G., Emerson, V. F. Grating acuity of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus). Behavioural Brain Research. 8 (2), 195-209 (1983).
- Govardovskii, V. I., Röhlich, P., Szél, A., Khokhlova, T. V. Cones in the retina of the Mongolian gerbil, Meriones unguiculatus: An immunocytochemical and electrophysiological study. Vision Research. 32 (1), 19-27 (1992).
- Zanandréa, L. I., Oliveira, G. M., Abreu, A. S., Pereira, F. E. Ocular lesions in gerbils (Meriones unguiculatus) infected with low larval burden of Toxocara canis: Observations using indirect binocular ophthalmoscopy. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 41 (6), 570-574 (2008).
- Cheng, S., et al. Enhancement of de novo sequencing, assembly and annotation of the Mongolian gerbil genome with transcriptome sequencing and assembly from several different tissues. BMC Genomics. 20 (1), 903(2019).
- Henriksson, J. T., McDermott, A. M., Bergmanson, J. P. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 50 (8), 3648-3654 (2009).
- Panagiotopoulos, M., Gan, L., Fagerholm, P. Stroma remodelling during healing of corneal surface irregularities induced by PTK. Acta Ophthalmologica Scandinavica. 85 (4), 387-394 (2007).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
