Yöntem makalesi

Kalp Gelişiminde Spesifik Gen Fonksiyonunu Aydınlatmak için Morfolino Antisens Oligonükleotidler ve mRNA'nın Zebra Balığı Embriyolarına Tasarımı ve Mikroenjeksiyonu

DOI:

10.3791/63324

⸱

9 Ağustos 2022

 ,  ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Qatar University, Doha, Qatar, 2Department of Biological and Environmental Sciences, College of Arts and Science, Qatar University, Doha, Qatar, 3Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy, Medical College of Wisconsin, 4Department of Pediatrics, Medical College of Wisconsin

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, temsili bir kardiyak gene karşı translasyonel bloke edici bir morfolino'nun tasarlanmasını, hazırlanmasını ve mikroenjekte edilmesini açıklar; Kalp ve Nöral Krest Türevleri2 (el2) gen fonksiyonunu yıkmak için yeni döllenmiş zebra balığı embriyolarının sarısına eksprese edilir. Aynı zamanda, bu gen ürününü kodlayan mRNA'nın birlikte enjeksiyonu ile bu "morfantların" geçici bir şekilde kurtarıldığını gösterir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Morfolino oligomer bazlı knockdown sistemi, kayıp veya azaltılmış ekspresyon yoluyla çeşitli gen ürünlerinin işlevini tanımlamak için kullanılmıştır. Morfolinolar (MO'lar), enzimatik bozunmaya duyarlı olmadıkları için DNA oligolarına göre biyolojik stabilite açısından avantaja sahiptir. Optimal etkinlik için, MO'lar 1-4 hücre aşaması embriyolarına enjekte edilir. Knockdown'ın zamansal etkinliği değişkendir, ancak MO'ların sonunda seyreltme nedeniyle etkilerini kaybettiğine inanılmaktadır. Morfolino seyreltmesi ve enjeksiyon miktarı, hedef dışı etkilerin oluşumunu en aza indirmek ve hedef üzerinde etkinliği korumak için yakından kontrol edilmelidir. CRISPR / Cas9 gibi ek tamamlayıcı araçlar, mutant çizgiler oluşturmak ve bu çizgilerle morfant fenotipini doğrulamak için ilgilenilen hedef gene karşı gerçekleştirilmelidir. Bu makale, el2 fonksiyonunu yıkmak ve bu "morfantları" karşılık gelen cDNA'yı kodlayan mRNA'nın birlikte enjeksiyonu ile kurtarmak için 1-4 hücre aşamalı zebra balığı embriyolarının yumurta sarısına el2'ye karşı translasyonu bloke eden bir morfolino'nun nasıl tasarlanacağını, hazırlanacağını ve mikroenjekte edileceğini gösterecektir. Daha sonra, morfolino mikroenjeksiyonlarının etkinliği, önce yumurta sarısında (fenol kırmızısı ile birlikte enjekte edilen) morfolino varlığının doğrulanması ve daha sonra fenotipik analiz ile değerlendirilir. Ayrıca, knockdown etkinliğini test etmek için kardiyak fonksiyonel analiz tartışılacaktır. Son olarak, morfolino kaynaklı gen translasyonunun western blotlama yoluyla bloke edilmesinin etkisinin değerlendirilmesi açıklanacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığının kardiyovasküler gelişim ve hastalık çalışmaları için bir model olarak kullanılması, geleneksel in vivo modellere kıyasla gen fonksiyonunun yüksek korunması, optik şeffaflık, hızlı kardiyovasküler gelişim ve daha ucuz maliyet dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunar1. Morfolino oligonükleotidler (MO'lar), zebra balığı modeli için en yaygın kullanılan antisens gen yıkım araçlarıdır. MO'lar sıklıkla bir fenotipi belirlemek veya gen fonksiyonunu araştırmak için kullanılır. Dr. James Summerton başlangıçta, insan gelişimsel kusurları için terapötikler geliştirme girişimi olarak mRNA translasyonunun in vivo inhibisyonu için morfolino dağıtım sistemini geliştirdi 2,3. MO'lar, genleri yıkmak ve bu yıkımın fenotip üzerindeki sonucunu araştırmak için in vitro ve in vivo model organizmalar için kullanılmıştır. Bu, örneğin kalp gibi belirli organların gelişimindeki değişiklikleri gözlemleyerek yapılır. WT zebra balığı embriyolarında kalbe özgü genlerin yıkılması, uygun bir kalp atışının başarısızlığına yol açtıve bu genlerin kalp gelişimi için vazgeçilmez işlevini doğruladı 4,5. Bu fenotipler, spesifik genler için mRNA'ların birlikte enjeksiyonu ile kurtarıldı. Kardiyak troponin T (Tnnt2) içeren bir çalışma, tam uzunlukta tnnt2 mRNA ekspresyonunun morfolino knockdown6'nın neden olduğu sarkomerik fenotipleri kurtarabileceğini gösterdi. Başka bir çalışma, A-bantlarının ve Z-disklerinin bütünlüğünün, cmcl2 morfantları7'de düzenleyici miyozin hafif zincir ortoloğu (cmlc2) mRNA'sının aşırı ekspresyonu ile geri yüklenebileceğini ortaya koydu.

MO'lar, pre-mRNA eklemesini hedefleyerek veya translasyonu bloke ederek gen ekspresyonunu yıkmak için yaygın olarak kullanılır. Ek engelleyici MO'lar, ek yerlerini inhibe ederek pre-mRNA'yı bağlar ve inhibe eder. Translasyonel blokaj, MO, ribozom montajını engellemek için tamamlayıcı mRNA'nın 5'-çevrilmemiş bölgesine bağlandığında meydana gelir. MO'lar, in vivo modeller için gen ekspresyonunu yıkmak için en yaygın kullanılan gene özgü yöntemdir; aynı zamanda hücre kültürlerinde kullanılan en verimli mRNA bloke edici ajanlardır. Morfolino'nun kendisi tipik olarak kısa zincirli (yaklaşık 25) morfolino alt birim bazlarından oluşur. Her MO alt birimi, bir nükleik asit bazı, bir morfolin halkası ve iyonik olmayan bir fosforodiamid içerir. İki tip MO için farklı etki mekanizmaları, knockdown'ın etkinliğini doğrulamak için farklı testler gerektirir. Translasyon bloke edici MO'lar için, bir western blot analizi en güvenilir etkinlik testidir, çünkü ATG translasyon başlangıç bölgesinin tıkanması nedeniyle ilgilenilen protein üretilmemelidir. MO'lar hedef mRNA'larını doğrudan bozmazlar; bunun yerine, belirli bölgelere bağlanırlar ve doğal olarak bozulana kadar ifadeyi engellerler. Bununla birlikte, ek yeri bloke eden MO'lar, ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve jel elektroforezi ile test edilebilen ek yeri modifikasyonunu indükleyerek pre-mRNA'yı değiştirir.

MO tarama sürecinin üç önemli kısmı standartlaştırılmalıdır: (i) MO doz eğrisi fenotipik tanıma için ayarlanmalıdır. Doz eğrisi ayrıca, hedef dışı 'gürültüye' karşı fenotipik 'sinyali' optimize etme yeteneğini geliştirmek için test edilen her MO için öldürücü doz 50'yi (LD50: enjekte edilen embriyoların %50'sinin öldüğü doz) gösterir3. (ii) Uyarlanan fenotipleme isimlendirmesi iyi belgelenmelidir; Kesin ve kolay anlaşılır bir fenotipik tanımlama, embriyoları doğrudan incelemeyenler arasında bilgi paylaşımını kolaylaştırmak için mevcut literatüre ve araştırmacı deneyimine dayalı kapsamlı açıklamalar sağlamak için kritik öneme sahiptir. (iii) İyi tanımlanmış bir dile sahip olmak, Morpholino Database8'den merkezi olarak veri toplamayı kolaylaştırır.

Kardiyak genler için MO yıkım çalışmalarında, MO yıkım deneylerinin kardiyovasküler sistem fonksiyonu üzerindeki etkisini belirlemek için hayvanların kalp aktivitesi ve kan akış dinamikleri izlenmelidir. Bu tür analizler, kardiyovasküler sistemin yüksek çözünürlükte gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini gerektirir. Zebra balığı derisi, gelişimin ilk haftasında şeffaftır ve mikroskopi ile kalbin ve kan dolaşımının görselleştirilmesini sağlar. Kalp fonksiyonunun değerlendirilmesi için en çok hesaplanan fizyolojik parametreler kalp hızı ve kalp debisinin yanı sıra fraksiyonel kısalma, fraksiyonel alan değişimi ve ejeksiyon fraksiyonudur. Kan akış hızları, hareketli eritrositlerin izlenmesiyle ölçülebilir ve bu ölçümler, endotel hücreleri üzerinde çok önemli bir mekanobiyolojik faktör olan kayma gerilmesi seviyelerini belirlemek için kullanılır. Böyle bir değerlendirme, yüksek hızlı bir kamera ile donatılmış ters çevrilmiş veya bir stereomikroskop aracılığıyla atan kalp ve akan kan için hızlandırılmış videoların kaydedilmesini gerektirir.

Bu makale, gen fonksiyonunu yıkmak için taze döllenmiş zebra balığı embriyolarının yumurta sarısına ilgilenilen bir gene karşı translasyonel bloke edici bir morfolino'nun nasıl tasarlanacağını, hazırlanacağını ve mikroenjekte edileceğini göstermektedir. Ayrıca, bu geni kodlayan mRNA'nın birlikte enjeksiyonu ile bu "morfantların" kurtarılmasını da gösterecektir. Daha sonra morfolino mikroenjeksiyonlarının etkinliğini fenotipik karakterizasyonların yanı sıra kardiyak yapısal ve fonksiyonel analizler yoluyla analiz edeceğiz. Bu yaklaşım, geniş çapta çalışılmış bir kardiyak gen olan el2 üzerinde gösterilecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler, QU'daki IACUC yönetmeliği kapsamında kabul edilen insancıl hayvan bakımı standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi; hayvanlar, Katar Üniversitesi Biyomedikal Araştırma Merkezi'ne (QU-BRC) bağlı zebra balığı tesisinde tutuldu. Bu deneysel çalışmalarda kullanılan tüm hayvanlar döllenme sonrası 3 günün (dpf) altındaydı.

NOT: Her deney grubu için, istatistiksel titizlik için en az 30 embriyo kullanılması tavsiye edilir. Deney grupları aşağıdaki gibidir:

Kontrol grubu: Bu grup, herhangi bir enjeksiyon yapılmadan yumurta suyunda kültürlenen embriyoları içerir. Buradaki sonuçlar kontrol temelini oluşturacaktır.

Negatif Kontrol grubu: Bu grup, çırpılmış MO'lar enjekte edilen yumurta suyunda kültürlenen embriyoları içerir.

Enjekte edilen grup: Bu grup, fenotipi kurtarmak için tek başına el2 MO ve el2 mRNA ile el2 MO enjekte edilen embriyoları içerir. Buradaki sonuçlar, gözlenen fenotiplerin enjekte edilen MO'lar nedeniyle ortaya çıktığını doğrulayacaktır. Deney gruplarının karşılaştırılması , el2'nin inhibe edilmesi ve kurtarılmasının kalp fonksiyonu üzerindeki etkisinin tam olarak değerlendirilmesini sağlayacaktır.

1. El için morfolino tasarımları2.

NOT: MO dizileriliteratür 9,10,11'den uyarlanabilir. Alternatif olarak, bu oligolar Gene-tools tarafından çevrimiçi olarak tasarlanabilir. Gene-tools, web siteleri12 üzerinden erişilebilen ücretsiz ve hızlı bir çevrimiçi tasarım hizmeti sunar. Özel bir MO, dizi bilgisi veya erişim numaraları gibi ilgilenilen genler hakkında bilgi sağlayarak kolayca tasarlanabilir. Aşağıdaki özel adımlar, zebra balığında el2'ye karşı MO'ların nasıl tasarlanacağını özetlemektedir:

  1. İlk olarak, NCBI veritabanından ilgilenilen genin ayrıntılarını arayın. El2 için, zebra balığında13.
  2. NCBI14'ten GenBank mRNA transkript kimliğini alın.
  3. NCBI15'ten mRNA dizisini elde edin.
    NOT: Zebra balığı hand2 geni için morfolino (MO) ile modifiye edilmiş antisens oligonükleotidler mevcuttur ve daha önce yayınlanmıştır. EL2 Çalışmada kullanılan MO dizisi 9,10,11: 5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGACAG-3', MO dizileri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
  4. Enjekte edilecek gen araçlarından16 eşleşmeyen veya karıştırılmış bir MO'dan (rastgele baz çifti değişiklikleriyle benzer diziler) negatif bir kontrol elde edin. Bu, spesifik MO enjeksiyonlarında gözlenen fenotip(ler)in özgüllüğünü doğrulamaya yardımcı olacak ve gözlenen etkilerin enjeksiyon prosedürünün bir artefaktından kaynaklanma riskini en aza indirecektir.

2. Morfolino enjeksiyonunun hazırlanması

  1. Stok hazırlama
    1. MO stoklarını ddH2O ile çözün; Dietil pirokarbonat (DEPC) MO'lara zarar verebilir ve embriyolar için toksik olabilir. Bu nedenle, DEPC içermeyen ddH2O kullanın. Sipariş üzerine, MO'lar 300 nM konsantrasyonda bir şişede teslim edilir.
      NOT: Gene Tools 1 mM stok çözeltileri (~ 8 ng / nL) önerirken, özellikle morfolino yüksek bir doz gerektiriyorsa veya diğer MO'larla karıştırılırsa, bu çok düşük olabilir. Bu nedenle, çeşitli konsantrasyonlarda MO stok çözeltileri (2 veya 3 mM) yapmak için idealdir.
    2. Çalışma çözeltisini alt seyrelterek 0.2 mM'lik bir çalışma çözeltisi hazırlayın (yani, 2 mM stok için, 1:10 seyreltme). Danieaux çözeltisi (7 μL), stok morfolino (1 μL) ve fenol kırmızısı (10x stoktan 2 μL) ekleyerek 10 μL çalışma çözeltisi hazırlayın. Fenol kırmızısı, enjekte edilen materyalin embriyoda izlenmesine yardımcı olmak için çözeltiye koyu kırmızı bir renk verir.
    3. Buharlaşmayı önlemek için MO'ları hava geçirmez kaplarda oda sıcaklığında (RT) tutun. Çözelti çökelebileceğinden, MO'ları tezgah üzerinde buz üzerinde tutmayın. RT kullanımı en uygun olanıdır.
      NOT: Gene Tools, MO'lar için iki depolama yönteminden birini önerir: Çalışma solüsyonu -20 °C'de (aylarca ila yıllarca) tutulabilir veya uzun süreli depolama için kapalı bir tüpte RT edilebilir. -20 ° C'de tutulursa, oligonükleotid çözeltisini 65 ° C'de 10 dakika ısıtın ve kullanmadan önce morfolinoyu tamamen çözmek için girdap yapın (RT'de tutulursa ısıtmaya gerek yoktur).
  2. mRNA'nın in vitro transkripsiyonu
    NOT: İn vitro transkripsiyon, zebra balığı EL2'nin morfolinos kullanılarak devrilmesi nedeniyle fenotipi kurtarmak için zebra balığı embriyolarına mikroenjekte edilecek Plazmid HAND2 (NM_021973) İnsan Etiketli ORF Klonundan Hand2'nin mRNA'sını oluşturmak için kullanıldı, çalışmada kullanılan plazmit detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
    1. Plazmit DNA'yı uygun bir kısıtlama enzimi ile doğrusallaştırın ve bir DNA saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) kullanarak saflaştırın. Üreticinin talimatlarına göre enjeksiyon için mRNA oluşturmak üzere in vitro transkripsiyon için bir şablon olarak saflaştırılmış doğrusallaştırılmış DNA'yı kullanın (Malzeme Tablosu).
    2. Son olarak, bir fenotip eksikliğinin gerçekten de MO tarafından zebra balığı geninin kaybından kaynaklanıp kaynaklanmadığını test etmek için fenotipin kurtarılmasını gerçekleştirmek üzere ilgilenilen gen için 250 pg insan mRNA'sı enjekte edin.
  3. Enjekte etmeye hazırlanıyor
    1. 2.3.2-2.3.6 adımlarını izleyerek bir mikropipet pulu (Malzeme Tablosu) kullanarak bir iğne çekin.
    2. Filamentli 1 mm'lik kılcal tüpler ve bir mikropipet Çektirme kullanın. Makineyi açın ve kapağı açın
    3. Mod seçim düğmesini NO.2 Isıtıcı konumuna çevirin. NO.2 ısıtıcı kullanarak, ısıyı 68 °C'ye getirmek için düğmeyi ayarlayın
    4. Mod seçim düğmesini Adım 1 konumuna geri çevirin. Dört ağırlık kullanın (2 Tip Hafif / 2 Tip Ağır)
    5. Kılcal damarı tutucuya yerleştirin ve kapağı kapatın. Çekilen iğneyi almak için Başlat düğmesine basın.
      NOT: Bu, uzun bir konikliğe sahip kılcal iğneler oluşturacaktır
    6. Forseps kullanarak iğnelerin ucunu kısa bir süre kesin. Zebra balığı embriyolarına kolay nüfuz etmek için çekilen iğnenin ucunu yaklaşık 30 saniye boyunca kılcal bir beveler kullanarak keskinleştirin, bu da yaklaşık 15-25 μm çapında uçlar elde edilmesini sağlar.
    7. 2.3.8-2.3.13 adımlarını izleyerek enjeksiyon miktarını tahmin etmek için iğneyi kalibre edin.
    8. İğneyi tamamen tıkayabilecek parçacıkları çözmek için iğneye yüklemeden önce mRNA/morfolino çözeltisini kısaca karıştırın.
    9. Mikron uçlu bir pipet ucu kullanarak enjeksiyon iğnesinin arka kısmına ~ 3-4 μL MO çözeltisi ekleyin. Enjeksiyon iğneleri, kılcal geri doldurmayı kolaylaştırmak için küçük bir hendek ile donatılmıştır.
    10. Enjeksiyon iğnesinde kabarcık olmadığını onaylayın. İğneyi mikroenjektöre monte edin.
    11. Enjeksiyon pedalına basarak iğnenin ucunun tıkalı olmadığını ve MO solüsyonunun iğneden dışarı akabileceğini kontrol edin.
    12. Damlacık boyutunu ölçerek enjeksiyon hacmini kalibre edin. İğnenin ucunu bir mikrometre slaytına mineral yağa koyun. Enjeksiyon pedalına basın ve çıkarılan damlacık çapı 0,1 mm, 0,5 nL'ye karşılık gelene kadar enjeksiyon (Çıkarma) basıncını (psi) ve/veya enjeksiyon süresini (ms) ayarlayın.
    13. Enjeksiyon hacminin 0,5-1 nL civarında olduğundan emin olun. Enjeksiyon (Çıkarma) basıncını (psi) veya süreyi (ms) değiştirerek ses seviyesini ayarlayın.
    14. Pikolitre enjektör kurulum protokolü için 2.3.15-2.3.16 adımlarını izleyin
    15. Zebra balığı enjeksiyonları için pikolitre enjektör kullanın. Enjektörün besleme pompasını açın.
    16. Enjektörü aşağıda gösterilen gereksinimlere göre hazırlayın:
      1. P-dengesi: P dengesinin 0 civarında olduğundan emin olun. İğnedeki MO çözeltisini seyrelterek yumurta sarısının iğneye geri akmasını önlemek için biraz negatif olduğundan emin olun. Tersine, geri basınç çok yüksekse, MO, pedala baskı uygulanmadan bile sürekli olarak iğneden dışarı akacak ve bu da enjekte edilen dozda ve gözlenen fenotiplerde değişkenlik ve tutarsızlıklara neden olacaktır.
      2. P-enjeksiyon: 20-25 psi idealdir; Enjeksiyon hacmini ayarlamak için bunu değiştirin. Bu, 10-30 psi arasında değişebilir, ancak istenen hacmi sağlayıp sağlamadığını kontrol etmek için ~ 20 psi ile başlayın.
      3. Enjeksiyon süresi: Enjeksiyon süresini 300 ms'ye düşürdüğünüzden emin olun. Enjeksiyon hacmini ayarlamadan önce, enjeksiyon zamanında ayarlamalar yapın.
    17. Morfolino enjeksiyonu için 2.3.18-2.3.19 adımlarını izleyin.
    18. Enjeksiyon odasını aşağıdaki gibi hazırlayın: 0.6 g agaroz ve 30 mL E3 ortamından% 2 agaroz yapın. Agarozu bir Petri kabına dökün ve bir TU-1 enjeksiyon kalıbı kullanarak agarozun üzerine bir enjeksiyon kalıbı yerleştirin. Bir dondurucuda soğutulduktan sonra, embriyoları yerleştirmek ve stabilize etmek için oluklar oluşacaktır (Şekil 1A).
      NOT: 60x E3M stok çözelti tarifi, 5.0 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.16 mM MgSO4·7H2O, 0.4 mM CaCl2·2H2O'danoluşur ve nihai pH 7.6'dır.
    19. Toplanan embriyoları bir transfer pipeti kullanarak oluklara aktarın, embriyoların yüzmesini önlemek için embriyoların etrafındaki tüm fazla E3 ortamını çıkarın (Şekil 1B).

3. MO ve mRNA çözeltisinin yumurta sarısına enjeksiyonu

  1. İğneyi koryondan geçirin, hücre / yumurta sarısı sınırına yakın bir yere embriyo tarafına enjekte edin ve enjeksiyon pedalına basın (Şekil 1C).
    NOT: Enjekte edilen MO çözeltisi / fenol kırmızısı, yumurta sarısı içinde hemen yayılmayacaktır. Yumurta sarısında yavaş yavaş dağılan kırmızı bir nokta gözlenecektir. Enjekte edilen materyal embriyo boyutunun 'undan fazlasını geçmemelidir. MO'lar, 8 hücreli aşamaya kadar yeni bırakılan zebra balığı yumurtalarının yumurta sarısına mikroenjekte edilebilir, çünkü MO'lar, gelişmekte olan hücreler tarafından yumurta sarısı kesesinin sitoplazmik akışında kolayca alınabilir17,18. Plazmit veya kapaklı mRNA enjeksiyonlarında, enjeksiyon tek hücreli aşama embriyosunun tek bir blastomerine yapılmalıdır.
  2. Embriyoları E3 besiyeri olan bir Petri kabına aktarın ve günlük E3 besiyeri ikmali ile 3 dpf'ye kadar 28 ° C'de inkübe edin. Bu aşamada, bir mikroskop kullanarak fenotipik değerlendirmeyi gerçekleştirin.
    NOT: MO çözeltileri, belirli bir fenotipi indüklemek için gereken en düşük konsantrasyonu belirlemek için her araştırma için dikkatlice seyreltilmelidir. Her MO için embriyonik ölümcüllük de belirlenmelidir. Daha yüksek konsantrasyonlarda (MO'ya bağlı olarak 4-10 ng'nin üzerinde), MO'lar beyin veya genel hücre ölümü gibi spesifik olmayan etkiler ortaya çıkarma eğilimindedir.
  3. Zebra balığı el2 geninin MO tarafından kaybının neden olduğu fenotipin kurtarılmasını doğrulamak için MO'yu 250 pg mRNA ile insan eli2 ile birlikte enjekte edin.

4. Morpholino knockdown'ın başarısını doğrulamak için western blot

  1. Embriyoları belirli zaman noktalarında (48 hpf, 72 hpf) toplayın ve gerekirse Pronase enzimini kullanarak dekoryonat yapın.
  2. Daha önce bilinen bir metodoloji kullanarak Vitellogenin'i çıkarmak için embriyoların sarısını çözün19.
    NOT: Vitellogenin, büyüyen embriyo için bir besin kaynağı görevi gören bir fosfolipo-glikoproteindir. Yüksek çözünürlüklü 2D jel elektroforezi ve büyük ölçüde geliştirilmiş western blotlama, embriyoların sarısının giderilmesi ve Vitellogenin'in uzaklaştırılmasıyla mümkün olur.
  3. Daha önce anlatıldığı gibi batı blotlama yapın20.

5. Kardiyak yapı ve fonksiyon değerlendirmesi:

  1. Zebra balığının canlı görüntülenmesi: Ventrikülün görüntülenmesi
    NOT: Zebra balığı embriyosu21,22'nin atan kalbi görselleştirilerek çeşitli kalp fonksiyonu/hemodinamik parametreleri hesaplanabilir. Bu parametreler arasında kardiyak debi (CO), ejeksiyon fraksiyonu (EF), strok hacmi (SV), fraksiyonel kısalma (FS) ve fraksiyonel alan değişimi (FAC) bulunur (lütfen zebra balığı embriyoları için kardiyak fonksiyon değerlendirmesi için ayrıntılı protokolleri içeren önceki makalelere bakın22,23). Aşağıdaki adımlar, zebra balığı embriyoları için bu parametrelerin, bu organizmaların derisinin şeffaf olduğu ve parlak alan mikroskobu ile görselleştirmeyi mümkün kılan bir aşama olan ~ 3 dpf'de nasıl hesaplanacağını kısaca açıklamaktadır.
    1. İçbükey kuyu görüntüleme slaydına bir damla %3 metilselüloz çözeltisi (RT) koyun.
    2. Zebra balığı embriyosunu uygun bir plastik damlalık kullanarak kuyuya yerleştirin (Şekil 2A, B)
      NOT: Kuyunun aşırı doldurulması, balıkların kuyudan dışarı çıkmasına neden olabilir.
    3. Yumurtadan çıkan embriyoyu stabilize etmek için% 3'lük metilselüloz damlasını E3 ortamı ile nazikçe karıştırın.
      NOT: %3 metilselüloz çözeltisi hazırlamak için, 3 g metilselüloz tozunu 100 mL PBS'de veya başka bir montaj ortamında bir şişede çözün. Karışımın şişesine bir karıştırma mıknatısı yerleştirin ve şişeyi manyetik bir karıştırma plakasına yerleştirin. Hızı "düşük" olarak ayarlayın ve tüm topakları çözmek için ~ 1 gün boyunca 4 ° C'de tutun. Metilselüloz tamamen çözüldükten sonra, küçük tüplere alın ve -20 ° C'de saklayın.
    4. Ventrikülün net görüntülemesini kolaylaştırmak için balığı sağ tarafı yukarı bakacak ve ön ucu sola bakacak şekilde sola yerleştirin (Şekil 2C).
    5. Mikroskop altında, embriyo kalbini 100x büyütme ile yakınlaştırın ve ~5 saniye boyunca kayda başlayın. Ventrikül sınırlarının görüntüleme penceresinin içinde olduğundan emin olun (Şekil 2D).
    6. Kardiyak fonksiyon analizi için tüm embriyonun (Şekil 2C), atan ventrikülün (Şekil 2D) ve dorsal aort veya Posterior Kardinal Ven (Şekil 2E) gibi ana damarlardaki hareketli kırmızı kan hücrelerinin (RBC) saniyede yaklaşık 100 kare (fps) hızında yüksek hızlı bir kamera ve stereomikroskop kullanarak hızlandırılmış filmler kaydedin.
    7. Filmi AVI film formatında veya TIFF (veya JPEG) görüntü dizileri formatında kaydedin.
  2. Kalp atış hızını hesaplayın
    1. Art arda iki kare kaydetmek için gereken süreyi hesaplayın. 100 fps için zaman aralığı 0,01 s'ye eşittir.
    2. Kaydedilmiş herhangi bir kardiyak döngüden bilinen bir nokta seçin (yani, diyastol sonu veya sistol sonu). Döngüyü tekrarlamak için gereken kare sayısını hesaplayın.
    3. Adım 5.2.1'deki zaman aralığını adım 5.2.2'deki kare sayısıyla çarpın. Sonuç, bir kalp atışı için gereken süredir (saniye cinsinden).
    4. Dakikadaki vuruş sayısını hesaplamak için 60'ı önceki adımda elde edilen sayıya bölün. Normal 3 dpf embriyolar için bu 150 bpm (2.5 Hz) civarında olmalıdır.
      NOT: ViewPoint24 ve DanioVision25 gibi birçok yazılım uygulaması, kalp atışı kayıtlarından kalp atış hızını otomatik olarak hesaplayabilir.
    5. Kardiyak ödem veya başka herhangi bir yapısal kusurun varlığını tespit etmek için tüm kalbi kontrol etmek için yaklaşık 100 fps'de hızlandırılmış bir kayıt filmi kullanarak kardiyak yapıyı analiz edin.
      NOT: Şekil 3A , normal bir 3 dpf embriyo kalbini gösterir ve Şekil 3B , kardiyak ödem ve kalp döngü defekti (uzamış ventrikül) olan 3 dpf'lik bir kalbi gösterir.
  3. Kesirli alan değişimini (FAC) hesaplayın:
    NOT: Fraksiyonel alan değişikliği (FAC), ventrikülün kontraktilitesini değerlendirmek için ventriküler diyastol sonu ve sistol sonu alanlarını karşılaştırmak için kullanılan bir parametredir.
    1. Bir kardiyak döngüyü temsil eden kareleri belirlemek için yaklaşık 100 fps'de hızlandırılmış bir video kaydedin. Hem sistol sonunun hem de diyastol sonunu gösteren çerçeveleri çıkarın.
    2. ImageJ veya benzer bir görüntü analiz yazılımı kullanarak hem diyastol sonu alanını (EDA) hem de sistol sonu alanını (ESA) hesaplayın.
    3. FAC 22,26,27'yi hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
      FAC figure-protocol-1
  4. Kesirli kısalmayı (FS) hesaplayın:
    NOT: Fraksiyonel kısalma (FS), ventrikülün kasılmasını değerlendirmek için kullanılan başka bir parametredir; FS'yi belirlemek için ventriküllerin diyastol sonu ve sistolik sonu çapları ölçülmelidir21.
    1. Adım 5.3.1'i tekrarlayın
    2. Diastol sonu Dd ve sistol sonu Ds noktalarındaki ventriküler duvarların çaplarını ölçmek için ImageJ veya başka bir eşdeğer görüntü analiz programı kullanın. Çoğu durumda, fraksiyonel düzgünlüğü (FS) belirlemek için kısa eksen çapları kullanılır (Şekil 4).
    3. FS 22,27'yi hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
      FS figure-protocol-2
  5. Strok hacminin (SV) hesaplanması:
    NOT: Her kalp atışı için SV, ventriküllerin diyastol sonu ve sistol sonu hacimlerinden kolayca hesaplanan ventrikülden pompalanan kan miktarıdır28.
    1. 5.3.1 ve 5.3.2 adımlarını tekrarlayın
    2. Şekil 4'te gösterildiği gibi Son diyastol (DL) ve Sistol Sonu (DS) çaplarını ölçün.
      NOT: Zebra balığı kalplerinin ventriküllerinin prolate sferoidal21,22 şeklinde olduğu varsayarsak, ventrikül hacmi aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır.
      Hacim figure-protocol-3
      SV, aşağıdakiformül 27 izlenerek hesaplanabilir. Normal SV aralığı 2-6 dpf embriyo için 0.15-0.3 nL'dir29. Burada, EDV diyastol sonu hacmidir ve ESV sistol sonu hacmidir.
      SV = (EDV - ESV)
  6. Ejeksiyon fraksiyonunu (EF) hesaplayın:
    NOT: EF, her kalp atışında ventrikülden atılan kanınfraksiyonu 28 olarak tanımlanır.
    1. Yukarıdaki formüllerden, balıklar için EDV ve ESV'yi çıkarın.
    2. EF'yi aşağıdaki gibi hesaplayın22,27:
      EF (%) figure-protocol-4
  7. Kardiyak çıktıyı (CO) hesaplayın:
    NOT: CO, kalp tarafından pompalanan kan hacmidir28. CO, 2-6 dpf embriyo için 10-55 nL/dk değerine sahiptir29.
    1. SV ve HR'yi önceki alt bölüm 5.5 ve 5.2'de belirtildiği gibi hesaplayın.
    2. CO 22,27'yi hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın:
      CO (nL/dk) = SV (nL/atım) x HR (atım/dk).
  8. RBC'lerin hızlarını ölçün:
    NOT: Hücre hızının belirlenmesi, akış hızını, damar çapını değerlendirmek ve damarın endotel hücrelerine uygulanan kayma stresini hesaplamak için hayati önem taşır (yani, Kesme stresi ise, hareket eden kanın endotel hücrelerine uyguladığı sürtünme kuvvetidir). 2-5 dpf embriyo için ortalama kırmızı kan hücrelerinin (RBC) hızı yaklaşık 300-750 μm/s'dir29. RBC'lerin hızlarını ölçmek için:
    1. Mikroskop altında, hayvan kuyruğunu 100x büyütme ile yakınlaştırın. RBC'lerin hareketi bu büyütmede görünür olmalıdır (Şekil 5A, B).
    2. Yaklaşık 8 saniye boyunca kayda başlayın. En önemli iki aksiyel arter olan dorsal aort (DA) ve posterior kardinal venin (PCV) görüntüleme penceresi içinde 100-120 fps olduğundan emin olun. Sıralı çerçevelerden tek tek hücreleri izleyin (Şekil 5A, B).
    3. ImageJ veya diğer benzer görüntü analiz yazılımlarını kullanarak birkaç kare ayıklayın.
    4. Tek bir RBC'nin hareket ettiği mesafe farkını hesaplayın (Δx).
    5. Ardışık kareler arasındaki zaman farkını belirleyin (Δt).
    6. RBC hızı22,27 için aşağıdaki formülü kullanın:
      RBC hızı (μm/s) figure-protocol-5
      NOT: Maksimum ve ortalama hız, tek tek hücreler21 için ardışık karelerin tekrarından çıkarılabilir. RBC'lerin hızı aynı zamanda kan akış hızını da temsil eder. Alternatif olarak, RBC'lerin hızını otomatik olarak ölçmek için ticari olarak mevcut çeşitli yazılım uygulamaları kullanılabilir. ViewPoint24 ve DanioVision25'in bu tür uygulamaları vardır (Şekil 5C). Ayrıca,100 fps'nin üzerinde kaydedilen filmlerle uyumlu TrackMate 30 ve MTrackJ31 gibi ImageJ ile kullanılabilen birkaç eklenti vardır.
  9. Ölçülen hücre hızlarından kayma geriliminin hesaplanması
    Kan damarlarında ölçülen RBC hızları aynı zamanda kan akış hızlarını da temsil eder (Şekil 5C). Bu ölçümlerden, Poiseuille Akış varsayımı22,27 ile ilgili bir kaptaki kesme gerilmesini τ hesaplayın:
    figure-protocol-6
    Burada V ortalama kan hızı (μm/s), μ kan viskozitesi (din/cm2) ve D damar çapıdır (μm). 3 dpf embriyo için DA 22,26,27'deki kesme gerilmesi yaklaşık 4 din/cm2'dir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 6'daki grafik, hem HAND2'ye özgü MO hem de kontrol karıştırılmış MO enjekte edilen embriyolar için 24, 48 ve 72 hpf'de hayatta kalan embriyoların ortalama yüzdesini göstermektedir. 1 mM (8 ng/μL) ve 0.8 mM (6.4 ng/μL) MO enjekte edilen embriyolar, kontrol şifreli MO enjekte edilen embriyolara kıyasla hayatta kalma yüzdesinde önemli bir azalma gösterdi. Bu, ölümcüllük veya malformasyonun gözlendiği ölçülen her zaman noktasında gözlendi. Sonuçlar, yüksek bir HAND2MO konsantrasyonunun, he...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Morpholino (MO) teknolojisi, zebra balığı, ksenopus, deniz kestaneleri ve daha yakın zamanda hücre kültürü model sistemlerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Çoğu yöntemde, faydaların yanı sıra, deneycinin bilmesi gereken tuzaklar da vardır. MO teknolojisiyle ilgili en büyük tuzaklardan biri, MO aracılı gen yıkım yaklaşımıyla gözlemlenen fenotipik etkilerin, birincil gen ürünüyle ilişkili işlev kaybından kaynaklanmadığı, ancak birincil genle birlikte veya hedeflenen birincil genden bağı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir finansal çıkar veya başka çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalenin yayınlanması BARZAN HOLDİNG'in cömert bir desteği ile ele alınmıştır. RR kısmen R61HL154254 ve Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları ve Çocuk Hastanesi'nden sağlanan fonlarla desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Akrilamid% 40SigmaSigma, kedi. C977M88
AgaroseSigma-AldrichSigma-Aldrich kedisi. hayır A9539-250G
Tüm Hazırlık DNA/RNA Mini KitiQiagenQiagen kat. hayır. 80204.
alfa TübülinAbcamAbcam- ab4074Tavşan poliklonal ila alfa Tubulin lot GR3 180877-1 (50 kDa)
Amonyum persülfat moleküler sınıfSigma, cat. C991U65
BV10 kılcal eğim SutterInstruments Ürün Sutter Instruments ÜrünKataloğu # BV10
Kemilüminesans Görüntüleme Geni GnomeSYNGENESYNGENE
Cleaver Bilimsel KurutmaCVS10D_OmniPAGEMiniCVS10D_OmniPAGEMini
CoomassieThermo FisherThermo Fisher kedi. C861C44
Elektrokemilüminesans (ECL) kitiAbcam Biyokimyasallar AbcamBiyokimyasallar kedi. ab65623
GlisinSigmaSigma yok, kedi. C988U91
yok Keçi anti TavşanAbcamAbcam-  ab6721Keçi Anti-Tavşan IgG H & L (HRP) 2nd antikorları lot GR3179871-1
HAND2Gen araçlarıHAND2 (NM_021973)5'-CCTCCAACTAAACTCATGGCGAC
AG-3'Hand2
AbcamAbcam- ab10131Tavşan poliklonal Anti-HAND2 antikoru lot GR143200-9 (24-26 kDa)
HAND2 (NM_021973) İnsan Etiketli ORF KlonuOriGene Technologies, IncRC224436L3Vektör: pLenti-C-Myc-DDK-P2A-Puro (PS100092)
IBI DNA/RNA/Protein Ekstraksiyon KitiIBI BilimselIBI Bilimsel kedi. no -r IB47702
Görüntüleme SistemiiBright iBrightCL1000 Görüntüleme Sistemi
İzopropanolSigma-AldrichSigma-Aldrich kedisi. no 278475-2L
Laemmli numune yükleme tamponu (4x)Sigma-AldrichSigma-Aldrich kedisi. no 70607
MerkaptoetanolSigmaSigma, cat. Gen5 Veri Analizi yazılım arayüzü ile M6250-1L
Mikroplaka SpektrofotometresiEpochEpoch
MikroskobuZiess SteREO Lumar V12 Floresan MikroskobuZiess SteREO Lumar V12 Floresan Mikroskobu
Mineral yağFisher ScientificFisher Scientific cat. no 0121-1
mMESSAGE mMACHINE T7/T3/SP6 Transkripsiyon KitiThermo FisherThermo Fisher cat. no. mRNA üretimi için
Nükleaz içermeyen suNew England BiolabsNew England Biolabs kedi. hayır B1500L
PC-100 Mikropipet ÇektirmeNARISHIGE GROUP ÜrünNARISHIGE GROUP Ürün Kataloğu # PC-100
Fenol kırmızısıSigmaSigma, cat. hayır. P-0290
Pikolitre EnjektörHarvard AparatıHarvard Aparatı katalog # PLI-90A
Pierce Biskinkoninik asit tahlili (BCA) Protein Testi kitiThermo FisherThermo Fisher kedi. 23227
PMSF, proteaz inhibitörleri olarak proteaz inhibitörüThermo FisherThermo Fisher kedisi. no 36978
Ponceau SSigma-AldrichSigma-Aldrich kedisi. hayır 10165921001
Proteaz İnhibitörü KokteylThermo FisherThermo Fisher kedi. 88668 numara
Protein merdiveniSMOBiOSMOBiO kedi. PM2500
Radyoimmünopresipitasyon Testi (RIPA)Thermo FisherThermo Fisher kedi. no 89900
Zil Sesi s çözümüThermofisherKatalog No.S25513
SDSSigmaSigma, cat. 436143
Standart KontrolGen araçlarıSKU: PCO-StandardControl-1005'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTAT
A-3'- bir insan beta-globin intron mutasyonunu hedefleyen
Sıyırma tamponuSigma-AldrichSigma-Aldrich kedisi. 21059
TemedIBI bilimselIBI bilimsel kedi. C000A52
Tris BaseThermo FisherThermo Fisher kedi. BP-152-500
Tweensigma yaşam bilimlerisigma yaşam bilimleri kedisi yok. EthoVision
Zebra Box Revolution-Danio Track sistem odasıyok Noldus Bilgi Teknolojisi, NLNoldus Bilgi Teknolojisi, NL
Zeiss Axiocam ERc 5sZeissStemi 508 Zeiss
Zeiss Stemi 2000-CZeissStemi 2000-C
yokyok yok AM1340yokyok XT 11.5 yazılımına sahip P2287

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
  2. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  3. Stainier, D. Y., et al. Guidelines for morpholino use in zebrafish. PLoS Genetics. 13 (10), 1007000(2017).
  4. Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
  5. Eve, A. M., Place, E. S., Smith, J. C. Comparison of Zebrafish tmem88a mutant and morpholino knockdown phenotypes. PLoS One. 12 (2), 0172227(2017).
  6. Huang, W., Zhang, R., Xu, X. Myofibrillogenesis in the developing zebrafish heart: A functional study of tnnt2. Developmental Biology. 331 (2), 237-249 (2009).
  7. Chen, Z., et al. Depletion of zebrafish essential and regulatory myosin light chains reduces cardiac function through distinct mechanisms. Cardiovascular Research. 79 (1), 97-108 (2008).
  8. Bedell, V. M., Westcot, S. E., Ekker, S. C. Lessons from morpholino-based screening in zebrafish. Briefings in Functional Genomics. 10 (4), 181-188 (2011).
  9. Reichenbach, B., et al. Endoderm-derived Sonic hedgehog and mesoderm Hand2 expression are required for enteric nervous system development in zebrafish. Developmental Biology. 318 (1), 52-64 (2008).
  10. Maves, L., Tyler, A., Moens, C. B., Tapscott, S. J. J. Pbx acts with Hand2 in early myocardial differentiation. Developmental Biology. 333 (2), 409-418 (2009).
  11. Hinits, Y., et al. Zebrafish Mef2ca and Mef2cb are essential for both first and second heart field cardiomyocyte differentiation. Developmental Biology. 369 (2), 199-210 (2012).
  12. Gene Tools, custom-sequence Morpholinos. , Available from: https://oligodesign.gene-tools.com/ (2011).
  13. hand2 heart and neural crest derivatives expressed 2 [ Danio rerio (zebrafish). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/58150 (2021).
  14. Danio rerio heart and neural crest derivatives expressed 2 (hand2), mRNA. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_131626.3 (2021).
  15. NCBI reference sequence -Danio rerio heart and neural crest derivatives expressed 2 (hand2), mRNA FASTA. , hand2), mRNA FASTA at (2021). Prepared control oligos at (2021).
  16. Prepared control oligos. , Available from: https://store.gene-tools.com/prepared-control-oligos (2021).
  17. Schubert, S., Keddig, N., Hanel, R., Kammann, U. Microinjection into zebrafish embryos (Danio rerio)-a useful tool in aquatic toxicity testing. Environmental Sciences Europe. 26 (1), 32(2014).
  18. Moulton, J. D. Guide for morpholino users: toward therapeutics. Journal of Drug Discovery, Development, and Delivery. 3 (2), 1023(2016).
  19. Link, V., Shevchenko, A., Heisenberg, C. -P. Proteomics of early zebrafish embryos. BMC Developmental Biology. 6 (1), 1(2006).
  20. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
  21. Shin, J. T., Pomerantsev, E. V., Mably, J. D., MacRae, C. A. High-resolution cardiovascular function confirms functional orthology of myocardial contractility pathways in zebrafish. Physiological Genomics. 42 (2), 300-309 (2010).
  22. Yalcin, H. C., Amindari, A., Butcher, J. T., Althani, A., Yacoub, M. Heart function and hemodynamic analysis for zebrafish embryos. Developmental Dynamics: An Officical Publication of the American Association of Anatomists. 246 (11), 868-880 (2017).
  23. Zakaria, Z. Z., et al. Using zebrafish for investigating the molecular mechanisms of drug-induced cardiotoxicity. Biomed Research International. 2018, 1642684(2018).
  24. Parker, T., et al. A multi-endpoint in vivo larval zebrafish (Danio rerio) model for the assessment of integrated cardiovascular function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (1), 30-38 (2014).
  25. Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), 0151148(2016).
  26. Salman, H. E., Yalcin, H. C. Advanced blood flow assessment in Zebrafish via experimental digital particle image velocimetry and computational fluid dynamics modeling. Micron. 130, 102801(2020).
  27. Benslimane, F. M., et al. Cardiac function and blood flow hemodynamics assessment of zebrafish (Danio rerio) using high-speed video microscopy. Micron. 136, 102876(2020).
  28. DeGroff, C. G. Doppler echocardiography. Pediatric Cardiology. 23 (3), 307-333 (2002).
  29. Bagatto, B., Burggren, W. A three-dimensional functional assessment of heart and vessel development in the larva of the zebrafish (Danio rerio). Physiological and Biochemical Zoology. 79 (1), 194-201 (2005).
  30. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods (San Diego, Calif.). 115, 80-90 (2017).
  31. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  32. Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
  33. Sumanas, S. Inducible inhibition of gene function with photomorpholinos. Methods in Molecular Biology. 1565, Clifton, N.J. 51-57 (2017).
  34. Kyritsi, K., et al. Knockdown of hepatic gonadotropin-releasing hormone by vivo-morpholino decreases liver fibrosis in multidrug resistance gene 2 knockout mice by down-regulation of miR-200b. The American Journal of Pathology. 187 (7), 1551-1565 (2017).
  35. Flynt, A. S., Rao, M., Patton, J. G. Blocking zebrafish microRNAs with morpholinos. Methods in Molecular Biology. 1565, Clifton, N.J. 59-78 (2017).
  36. Schoenebeck, J. J., Keegan, B. R., Yelon, D. Vessel and blood specification override cardiac potential in anterior mesoderm. Developmental Cell. 13 (2), 254-267 (2007).
  37. Lu, F., Langenbacher, A., Chen, J. -N. Transcriptional regulation of heart development in zebrafish. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 14(2016).
  38. Laurent, F., et al. HAND2 target gene regulatory networks control atrioventricular canal and cardiac valve development. Cell Reports. 19 (8), 1602-1613 (2017).
  39. Miura, G. I., Yelon, D. A guide to analysis of cardiac phenotypes in the zebrafish embryo. Methods in Cell Biology. 101, 161-180 (2011).
  40. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Scientific Reports. 4, 4898(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Morfolino Oligon kleotidlerGen SusturmaMikroenjeksiyon Tekni imRNA EnjeksiyonuTranslasyon BloklamaFenotipik AnalizKardiyak Fonksiyonel AnalizWestern Blot
Video yakında

İlgili makaleler