Kronik Tek Taraflı Üreter Tıkanıklığının Glomerüler Prosesler Üzerindeki Etkilerini Ölçmek için 2-Foton Mikroskobu Kullanılması

Glomerüler süreçleri, özellikle podosit biyolojisini anlamak, 50 yılı aşkın bir süredir bir hedef olmuştur. Yüzey glomerüllü Münih Wistar sıçanları, fizyolojik ve patolojik süreçlerin birçok yönünü anlamak için mikroponktur çalışmaları da dahil olmak üzere bu çalışmalarda merkezi bir rol oynamıştır ^1,2,3. Glomerüler bileşenleri intravital olarak incelemek için mikroskopinin kullanımı, bu toksik maruziyeti en aza indiren ve penetrasyon derinliğini artıran 2-foton mikroskobunun ortaya çıkmasına kadar fototoksisitenin etkileri nedeniyle sınırlıydı ^1,2. Bilgisayar donanım ve yazılımındaki hızlı gelişmelerin yanı sıra, bu, tek bir ayarda saatlerce üç boyutlu (3B) ve dört boyutlu (zaman) çalışmalara izin vermiştir ^1,4,5.

Glomerüler kılcal kan akımının miktarı, ilaçlara yanıt olarak vazokonstriksiyon ve dilatasyon, geçirgenlik ve yükün geçirgenlik ve inflamasyon üzerindeki etkileri, incelenen glomerüler süreçlerden sadece birkaçıdır. Ek olarak, proksimal tübülün S1 segmenti tanımlanabilir ve S1 ve S2 tübüler epitelinin davranışındaki farklılıklar ^1,4 olarak ölçülebilir. Farelerde yapılan çalışmalar, özellikle fare transgenik tesislerinin evrensel mevcudiyeti ile, glomerüler hastalık süreçlerinin moleküler biyolojisinin anlaşılmasında hızlı ilerlemelere yol açmıştır. Bireysel proteinler, özellikle proteinüri ^6,7,8 ile ilgili olarak^, nakavt çalışmalarında glomerüler disfonksiyondan sorumludur. Bununla birlikte, glomerüler görüntüleme çalışmaları için fare modellerinin kullanımı, glomerüller incelenen çok sayıda suşta yüzeyin 100 μm'den daha az olduğu için sınırlandırılmıştır⁹.

Bu, araştırmacıların incelenebilecek yüzey glomerülleri ile sonuçlanan fare modellerini geliştirmelerine ve kullanmalarına neden olmuştur. En yaygın model, tam UUO^10,11,12'nin kullanılmasıdır. Uzatılmış UUO periyodunun sonunda, farelerin böbreklerinde^13,14 olabilen ve çalışılan çok sayıda yüzey glomerül vardır. Bu fare çalışmalarında, uzamış UUO'nun glomerüler biyoloji üzerindeki etkilerini belirlemek için herhangi bir temel veya kontrol çalışması yapılmamıştır. Bu, hızlı fibroz ve kortikal yıkımla sonuçlanan ciddi ve uzun süreli bir yaralanma modeli olduğu için^10,11,12, glomerüler süreçler ve fonksiyon üzerinde etkiler olacağını varsaydık. Bu soruyu cevaplamak için, kontrol / taban çizgisi parametrelerini incelemek için yüzey glomerüllü Münih Wistar Fromter (MWF) sıçanları kullanıldı ve temel bulgu, beş haftalık UUO'yu takiben MWF sıçanlarında yapılan glomerüler çalışmalarla karşılaştırıldı. Ayrıca UUO'yu takiben yüzey glomerülleri olmayan Sprague Dawley (SD) sıçanlarını da inceledik. Bulgular, MWF ve SD sıçanlarda 5 haftalık UUO'nun yüzey glomerüllerinin sayısını gerçekten artırdığını göstermektedir. Bununla birlikte, bunlar glomerüler kan akışında, inflamasyonda ve makromolekül geçirgenliğinde ve boyutunda belirgin değişiklikler olan anormal glomerüllerdi.

Tüm deneyler Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nu takip etti ve Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

1. Münih Wistar Frömter veya SD sıçanının UUO ameliyatı için hazırlanması

1. Sıçanı izofloran kullanarak (% 5 indüksiyon,% 1.5-2.5 bakım) anestezi altına alın, daha sonra cerrahi bölgeyi hem iyot bazlı hem de klorheksidin bazlı bir ovma ve alkolle dairesel bir hareketle birkaç kez tıraş edin, yıkayın ve dezenfekte edin. Kurumsal IACUC kılavuzlarına göre ağrı yönetimi için uzun etkili / yavaş salınımlı analjezik uygulayın.
2. Bir neşter kullanarak orta hat boyunca bir kesi yapın; sol böbreği bulun ve çevredeki periton organlarından kurtarın.
3. Renal arter, böbrek damarı ve üreterden oluşan renal pedikülü dikkatlice bulun. Üreteri diğer yapılardan ayırın, hassas yapıya zarar vermemek için önlemler alın.
4. İnce forseps kullanarak, üreterin etrafına 3-0'lık bir dikişi dikkatlice ilmek ve yırtmamaya dikkat ederek bağlayın. İkinci bir düğümü bağlamak ve tam tıkanıklığı sağlamak için bu prosedürü ilk düğümün her iki tarafında birkaç milimetre tekrarlayın.
5. İşlem tamamlandıktan sonra, ardışık kas katmanlarını dikkatlice kapatın. Son tabakayı kapatmadan önce, tamamen kapatmadan önce karın içine 2 mL ılık, steril% 0.9 salin ekleyin. Dış cildi cerrahi zımbalarla kapatın.
6. Ağrı yönetimi için uzun etkili / yavaş salınımlı analjezik uygulayın ve kurumsal IACUC kılavuzlarına göre iyileşmeyi yakından gözlemleyin. Bundan sonra periyodik olarak izleyin ve beşinci haftanın sonunda görüntülemeye hazırlanın.

2. Texas Red sıçan serum albümini sentezi (TR-RSA)

1. 100 mg Sıçan Serumu Albümini tartın ve 50 mL'lik bir konik tüpte pH 8.4'te 6.67 mL 0.1 M sodyum bikarbonat tamponunda çözün.
2. 5 mg Texas Red-X-süksinimidil ester şişesine, tüm boya çözülene kadar 100 μL Dimetil Formamid (DMF, yüksek kaliteli) ve vorteks ekleyin.
3. Sıçan serum albümin çözeltisini düşük / orta bir ayarda bir girdap üzerine yerleştirin, böylece çözelti hacmi açık tüpün üst kısmının çok altında döner.
4. Tüp girdap yapılırken çözünmüş boyayı ekleyin.
5. 50 mL konik tüpü alın, folyoya sarın, tüpü herhangi bir rocker veya silindir üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca yavaşça çalkalayın.
6. Hafifçe karıştırma altında bir karıştırma çubuğuna sahip% 0,9 NaCl'lik 5 L'lik bir kovada, uygun bir 50 kDa moleküler ağırlıklı kesme diyalizörünün membranlarını ıslatın (klipsli bir membran, kapalı membran tüpleri veya diyaliz kasetlerinin tümü uygundur).
7. TR-RSA çözeltisini membran sistemine yükleyin ve tipik olarak sisteme dahil edilen yüzdürme ataşmanlarına takın. 5 L'lik kabı% 0.9 salin çözeltisi / TR-RSA ile gece boyunca 4 ° C'de (soğuk bir odada) bir karıştırma plakasına nazik bir ajitasyonla yerleştirin. Diyaliz solüsyonunu sonraki 36 saat içinde en az üç kez değiştirin.
8. Membranın şişmesi, şimdi berrak olan TR-RSA çözeltisinin hacmini artıracaktır. Yaklaşık bir konsantrasyon elde etmek için orijinal 100 mg'ı hacme bölün: boya: protein oranı 1: 1 olacaktır. Aliquot uygun hacimlere ve uzun süreli depolama için liyofilize edin.

3. Ters mikroskopta 2-foton intravital görüntüleme için hazırlık

1. 50 mm'lik bir kapak kaydırma alt kabının kapağını çıkarın (40 mm kapak kayması çapı ile) ve iç tabana kenarın yanına 8 adet otoklav bant yerleştirin. Piramit şeklinde, boş bir pencere yapın, dış böbreğin bu alana sıkıca oturmasını sağlamak için yan tarafta 4 parça kullanarak, otoklav bant ile periferik olarak teması korur, böylece hareketi en aza indirmeye yardımcı olur. Böbrek ile en iyi teması sağlamak için aralığı sıçanın boyutuna göre ayarlayın.
2. 50 mm'lik kapak kaydırmalı alt kabın her iki tarafına 1 termal ped yerleştirin. Isıtma pedinin sahneyi kapladığından emin olun.
3. Sırasıyla 30x ve 60x görüntüler oluşturmak için 0,75x yakınlaştırma ve 1,5x yakınlaştırmada 40x suya daldırma hedefi kullanın, böylece daha düşük ve daha yüksek büyütmeli görüntüler elde edin. Gerekirse, su damlacığının tüpten aşağı inmesini önlemek için hedefin tepesine aşağı doğru bir açıyla ulaşabilen uzun bir PE-200 boru parçasına sahip 1 mL'lik bir şırınga kullanarak hedefe su ekleyin.
4. Çalışmalar arasındaki görüntülerde tutarlılık sağlamak için mavi, yeşil ve kırmızı dedektörler önceden belirlenmiş seviyelere ayarlanmış %2 lazer geçirgenliği kullanın. Uyarma dalga boyunu referans alınan lazerde 800 nm'ye ayarlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız), bu da bu çalışmada kullanılan tüm floroforları verimli bir şekilde uyaracaktır.
   1. Bir fotoçarpan tüpü (PMT) (420-490 nm, kazanç 950) kullanarak mavi emisyonları toplamak için harici (taranmamış) dedektörler kullanın.
   2. Yeşil emisyonları yakalamak için bir Hyd dedektörü kullanın (500-550 nm, kazanç 100).
   3. Kırmızı emisyonları yakalamak için bir Hyd dedektörü kullanın (590-660 nm, kazanç 200).
   4. PMT'deki ofseti (mavi emisyonlar) dokunun boş alanlarında yalnızca birkaç piksel sıfır değerine sahip olacak şekilde ayarlayın.
      NOT: Yeşil ve kırmızı emisyonlar için HyD dedektörleri otomatik ofset ayarına sahiptir; sadece kazanç ayarlanabilir.
   5. Görüntülere siyah ve beyaz arasında 4.096 yoğunlukta bir ölçek vermek için bit derinliğini 12 bit olarak ayarlayın.
      NOT: Bowman'ın alanı içindeki düşük yoğunluklu emisyonların toplanmasını sağlamak için bu değerleri hariç tutmamak için dedektörlerin alt sınırlarını (PMT'de ofset) ayarlamak gerekir. Hassasiyet ayarı çok düşükse, görsel uyarı işaretçileri bunu gösterecektir; bu değerlere sıfır yoğunluk değeri verilir.
5. Yaklaşık 6 mg Texas-Red-X-Rat Serum Albüminini toplam 1 mL hacme kadar seyreltin, çözeltiyi 1 mL'lik bir şırıngaya yükleyin ve adım 9.1'de Hoechst 33342'nin infüzyonundan sonra adım 4.1'de yerleşik i.v kateterine yerleştirin.

4. İntravital 2-foton görüntüleme için cerrahi hazırlık

1. Önceden anestezi uygulanmış sıçanı, tıraş edilmiş sol kanadı düz ve düz bir şekilde masanın üzerine bakacak şekilde yan tarafında yerleşik bir venöz erişim hattı (femoral veya juguler) ile yerleştirin. Arka pençelerin olduğu gibi ön pençelerin birbirine temas ettiğinden emin olun.
2. Böbreğin karındaki doğal pozisyonu belirlemesini hissetmek için kaburgaların hemen altındaki sol kanadı yavaşça palpe edin. Gerekirse, tıraş edilen bölge boyunca kalıcı bir işaretleyici kullanarak bir çizgi çizin ve böbrek merkezini burundan kuyruğa yönde ikiye bölün.
3. Bir çift dişli forseps kullanarak, cildi kavrayın ve altta yatan vaskülatürü ezmek ve bir çift cerrahi makasla insizyonu yaparken kanamayı önlemek için kalıcı belirteç çizgisinin bir çift hemostatla sıkışmasını kolaylaştırmak için yukarı doğru kaldırın. Kanamayı en aza indirmek için ince dış kas tabakası için bunu tekrarlayın.
4. İnce iç karın kası tabakasının son kesisini yapmak için, büyüklüğü ve pozisyonu tahmin etmek için böbreği yeniden püskürtün. İç kas tabakasını bir çift forseps ile dikkatlice kaldırın ve böbreğin üzerindeki cildi ikiye bölen bir çizgiyi, böbreğin tahmini büyüklüğünün yaklaşık 1 /^3'ü olan hemostatlarla ezin.
5. Forseps ile kas tabakasındaki tutuşu korumak, son kesiyi yapın.
   NOT: Daha küçük bir kesi yapmak ve gerektiğinde genişletmek, çok büyük yapmaktan daha iyidir, bu da bir dikişle kısmi kapanmayı gerektirecektir.
6. Böbreği çevreleyen yağ tarafından nazikçe tutun. Her iki elinizi de forseps ile kullanarak, böbrek yağını kavramak ve tutmak için elden ele bir teknik kullanarak böbreğin alt kutbundaki yağı kavramak için çalışın, aşağıya doğru çalışın.
7. Böbreğin alt kutbundaki yağa bir elinizle sıkıca tutun, yağı yavaşça çekin ve gerekirse böbreği kesiden çok nazikçe sıkın. Böbrek kolayca geçmezse, insizyonu genişletin.

5. Sıçanı görüntüleme için konumlandırma

1. Açıkta kalan böbreği çanağın kenarına dikkatlice yerleştirin, hafif bir rotasyonla, böbreğin karın tarafı kapak kaymasına temas eder ve sırt tarafı kenardan uzağa bakar.
2. Hareketi daha da azaltmak için, iki steril 2 x 2 gazlı bez pedi alın, tuzlu suyla nemlendirin ve böbreğin karın tarafının kenara temasını güçlendirerek böbreğin sırt tarafına doğru paketleyin.
3. Çift geçişli bir Rhodamine/FITC küpü kullanarak epifloresan aydınlatma altında mikroskop göz merceğinden bakın. Hareket algılanırsa, pozisyonda küçük ayarlamalar yapın ve gazlı bezi dikkatlice ayarlayarak böbreğin altına itmediğinden emin olun. Hareketi daha da azaltmak için, sıçanı hafifçe yuvarlayın, böylece göğüs kafesi çanaktan daha uzakta olur.

6. Kantitatif analiz için görüntü toplama

1. Epifloresan aydınlatmayı kullanarak böbrek yüzeyini tarayın (adım 5.3) ve motorlu aşama kontrolörü ile ilişkili yazılımı kullanarak glomerül pozisyonlarını işaretleyin (modern sistemlerin bir özelliği).
2. 2-foton aydınlatma altındaki her renk kanalı için, her işaretli glomerulusun üst kısmının sığ bir 3D hacmini alın ve bu da arka plan görüntüleri olarak işlev görür. Glomerüler kılcal halkaların arka plan floresansının soluk yoğunluklarını daha iyi görselleştirmek için görüntüleme yazılımının görüntüleme seçeneğinde bir sahte renk paleti kullanın.
3. Odak noktası olarak yüzeysel bir kan damarı kullanarak, floresan albümini yavaşça infüze edin, sistemik dağılım nedeniyle floresanın yükselişini ve düşüşünü gözlemlemek için zaman tanıyın. Peritübüler vaskülatür ve kılcal halkalarda doygunluğun hemen altında bir yoğunluk elde etmek için yeterli TR-RSA infüze edin.
   NOT: Renal perfüzyon normal olduğunda materyalin infüzyonu ile kan dolaşımındaki görünümü arasında tipik olarak 5 sn'lik bir gecikme vardır.
4. Adım 6.2'den itibaren işaretlenmiş ve görüntülenen tüm glomerüller için 3B hacimler (1 μm aralıklarla) almadan önce yaklaşık 10 dakika bekleyin.
   NOT: Simonsen'in Münih Wistar sıçanları daha az yüzey glomerülüne sahiptir. Bununla birlikte, MW sıçanlarının Frömter suşu daha fazla sayıda yüzey glomerülüne sahip olduğundan, 10 glomerüle kadar sıklıkla görüntülenebilir.
5. Çalışmanın sonunda aşırı dozda izofluran yoluyla sıçanı ötenazileştirin. Ötanazi sağlamak için çift pnömotororakotami uygulayın.

7. Glomerüler geçirgenliğin hesaplanması

1. Mikroskop sistemiyle ilişkili görüntü görüntüleme yazılımını kullanarak, görüntüleri işleme ve analiz için 12 bit ham görüntülere aktarın.
2. Arka plan 3B birimlerini ve dolaşımdaki floresan albümini içeren ham 3B birimi yükleyin. Odak düzlemini, çevreleyen Bowman'ın kapsülünün kenarına kadar yeterli alana sahip glomerüllerdeki en parlak yüzeysel kılcal döngü ile 3D ses seviyesinde bulun.
3. Görsel yer işaretlerini kullanarak, arka plan ses seviyesinde bulunan aynı odak düzlemini bulun. Kılcal döngüde bir bölge ve her birinin ortalama yoğunluk değerlerini not ederek Bowman'ın alanı içinde bir bölge seçin. Bu yoğunluk değerlerini arka plan değerleri olarak kullanın.
4. Albümin içeren görüntüde Bowman'ın alanı içindeki bir bölgeyi (alanda en az 20 x 20 piksel) ana hatlarıyla belirtin ve yoğunluk okumasını not edin (Bowman'ın alan yoğunluklarının en temiz ölçümünü sağlamak için kılcal bir döngüye veya Bowman'ın kapsülüne bitişik olmayan bir alan seçin). Bowman's Space içindeki ortalama yoğunluk için ortalama bir değer elde etmek için çizilen bölgeyi diğer iki bölgenin üzerine taşıyın.
5. Kılcal döngü bölümündeki en parlak plazma floresan yoğunluğunu seçin ve bu bölgeyi daire içine alın. Eşik işlevini kullanarak, parlak değerleri vurgulayın (genellikle kılcal döngü duvarlarının kenarlarında bulunur), RBC gölgelerinin dolaşmasını önleyin ve değeri kaydedin.
   NOT: Kandaki faktörler plazma floresan seviyelerinin hafife alınmasına neden olacağından, en parlak alanların seçilmesi önemlidir.
6. GSC'yi Eq (1) kullanarak hesaplamak için değerleri bir e-tabloya girin:
   GSC = (1)

8. Yüzey glomerüler kılcal halkalarında ve renal vaskülatürde kırmızı kan hücresi akışının bir linecan fonksiyonu kullanılarak hesaplanması

1. Uygun bir damar bulun (kılcal bir döngü veya peritübüler bir damar). Referans alınan görüntü yakalama yazılımında çizgiler işleyebileceğinden ( Malzeme Tablosuna bakınız) kabın dik olmasını gerektirdiğinden, döndürme işlevini kullanarak görüntüyü döndürün .
2. Gemi döndürüldükten ve düz bir şekilde yattıktan sonra, edinme menüsünde XT işlevini seçin. 4.000 satırı tarayacak şekilde ayarlayın. Çizgiyi incelenecek geminin karşısına yerleştirin; odak düzleminin görüntülenecek segmentin maksimum çapında olduğundan emin olun.
3. Renkli bileşik görüntüye sol tıklayın ve çizgilerin çekildiği alanın referans görüntüsünü oluşturmak için Anlık Görüntü Al'ı seçin. Geminin hatlarını yakalamak için hemen Başlat düğmesine tıklayın.
4. RBC akış hızını belirlemek için, linecan'ları görüntü işleme yazılımına aktarın (bkz. Ölçü açılır menüsünün altındaki Bölge İstatistiklerini Göster iletişim kutusunu açın. Tek çizgili çizim aracını seçin ve RBC gölgelerinin eğimiyle eşleşen bir çizgi çizin. Genişlik ve yükseklik değerlerini not alın.
   NOT: Genişlik için elde edilen piksel değerleri mesafeye karşılık gelir; yükseklik için pikseller zamana karşılık gelir.
5. Hızı hesaplamak için aşağıdaki formülü (Eq (2)) kullanın.
   μm/s cinsinden RBC akış hızı = (2)
   NOT: Bu, 60x büyütmede elde etme parametrelerine ve referans alınan mikroskopla 400 Hz tarama hızına karşılık gelir (bkz.
   1. En az beş hesaplama yapın ve her satırın hızını bildirmek için bunların ortalamasını alın.
      NOT: Bu parametreler mikroskop sisteminin piksel boyutuna ve elde etme hızına bağlı olacaktır.

9. Glomerüler kılcal döngülerde WBC tıkanıklığının hesaplanması

1. Hoechst 33342 nükleer boyasını (~ 8 μg / kg sıçan ağırlığında) kılcal halkalara yerleştirilmiş WBC'leri tanımlamak için yerleşik bir venöz erişim hattı üzerinden uygulayın.
   NOT: Foton saçılması ve hemoglobin tarafından emilimi nedeniyle, özellikle daha kısa dalga boylu mavi emisyonlar için kullanılabilir derinlik sınırlı olacaktır.
2. Görüntüleme alanında bir glomerulusu ortalayın ve glomerüler yüzeyden başlayarak bir 3D veri seti alın ve verileri en az 30 ila 35 μm arasında sonlandırın. Z yönünde 1 μm adım boyutu kullanın.
3. Mavi Hoechst kanalını Texas Red albümin kanalıyla karşılaştırarak WBC'leri tanımlayın; WBC'leri pozitif olarak tanımlamak için kılcal döngüde kırmızı boyanın ve buna karşılık gelen bir nükleer lekenin dışlanmasını arayın. 3 optik bölüm üzerinde statik görünüyorlarsa, beyaz kan hücrelerini "yapışmış" olarak tanımlayın. Değerleri, glomerulusun tepesinden 1 μm aralıklarla alınan oluşum/10 optik kesit olarak raporlayın.

10. Yüzey glomerüllerinde Rouleaux oluşumlarının varlığının puanlanması

1. Adım 9.3 için aynı yönergeleri izleyin ve bir 3B veri kümesi edinin. Kılcal döngüler boyunca hareket ederken ayrışmaya direnen paketler halinde yığılmış RBC'ler olarak görünen Rouleaux oluşumlarını arayın. Daha uzun dalga boylu kırmızı emisyonlar için daha az foton saçılması nedeniyle daha büyük derinliklerde yapının daha iyi görselleştirilmesi için kırmızı bir florofor kullanın. Değerleri, glomerulusun tepesinden 1 μm aralıklarla alınan oluşum/25 optik kesit olarak raporlayın.

11. Glomerüllerin izolasyonu

1. 
   
3. 
   &

Yazarların çıkar çatışması yoktur.