Yöntem makalesi

Müller Glial Hücrelerinde 2′,7′-Diklorofloresein Diasetat Probu ve Akış-Sitometri Kullanılarak Reaktif Oksijen Türlerinin Miktarının Belirlenmesi

DOI:

10.3791/63337

⸱

13 Mayıs 2022

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra (INIMEC), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, Müller glial hücrelerinde (MGC'ler) 2′,7′-diklorofloresein diasetat probu (DCFH-DA) kullanarak hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için sistematize, erişilebilir ve tekrarlanabilir bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, bir akış sitometresi ile toplam hücresel ROS seviyelerini ölçer. Bu protokolün kullanımı çok kolaydır, uygundur ve yeniden üretilebilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Redoks dengesi hücresel homeostazın korunmasında önemli bir role sahiptir. Reaktif oksijen türlerinin (ROS) artan üretimi, proteinlerin, lipitlerin ve DNA'nın modifikasyonunu teşvik eder ve bu da sonunda hücresel fonksiyonda ve hücre ölümünde değişikliğe yol açabilir. Bu nedenle, hücrelerin zararlı hakaretlere yanıt olarak, Keap1 / Nrf2 gibi bir antioksidan yolu aktive ederek veya redoks temizleyicilerini (A, C ve E vitaminleri, β-karoten ve polifenoller, diğerleri arasında) geliştirerek antioksidan savunmalarını arttırmaları faydalıdır. Enflamasyon ve oksidatif stres, diyabetik retinopati (DR) ve prematüre retinopatisi (ROP) gibi retinopatilerin patogenezinde ve ilerlemesinde rol oynar. Müller glial hücreler (MGC'ler) nöral retina dokusunun homeostazında önemli bir rol oynadığından, bu hücresel koruyucu mekanizmaları incelemek için ideal bir model olarak kabul edilirler. Bu anlamda, ROS seviyelerinin tekrarlanabilir ve basit bir yöntemle ölçülmesi, antioksidan hücre savunma mekanizmasına katılan yolların veya moleküllerin katkısını değerlendirmek için gereklidir. Bu makalede, MGC'lerde DCFH-DA probu ve akış sitometrisi ile ROS ölçümü için gerekli prosedürlerin tam bir açıklamasını sunuyoruz. yazılım ile akış sitometrisi veri işleme için temel adımlar burada verilmiştir, böylece okuyucular ROS seviyelerini (FITC'nin geometrik araçları) ölçebilecek ve floresan histogramlarını analiz edebileceklerdir. Bu araçlar, sadece hücresel bir hakaretten sonra ROS'taki artışı değerlendirmek için değil, aynı zamanda hücreler üzerinde koruyucu bir etki sağlayabilecek bazı moleküllerin antioksidan etkisini incelemek için de oldukça yararlıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöral retina, iyi tanımlanmış nöronal tabakalar sunan çok organize bir dokudur. Bunlarda, nöronlar (ganglion, amakrin, bipolar, yatay ve fotoreseptör hücreler) birbirlerine ve ayrıca Müller glial hücrelere (MGC'ler) ve astrositlere bağlanır ve bu da yeterli fototransdüksiyona ve görsel bilginin işlenmesine yol açar 1,2. MGC'lerin retinal homeostazın korunmasında önemli bir role sahip oldukları bilinmektedir, çünkü tüm retinal kesiti geçerler ve böylece çoklu koruyucu süreçleri modüle eden tüm hücre tipleriyle etkileşime girebilirler. MGC'lerin, retinal nöronların bakımı ve hayatta kalması için, nöronlara enerji sağlamak için glikoliz, nöronal atıkların uzaklaştırılması, nörotransmiterlerin geri dönüşümü ve nörotrofik faktörlerin salınması da dahil olmak üzere birçok önemli fonksiyona sahip olduğu bildirilmiştir 3,4,5.

Öte yandan, inflamasyon, oksidatif ve nitrosatif stres, retinopatiler 6,7,8,9,10,11 dahil olmak üzere birçok insan hastalığının patogenezinde ve ilerlemesinde rol oynamaktadır. Hücrelerdeki redoks dengesi, ROS seviyelerinin sıkı bir şekilde düzenlenmesine bağlıdır. ROS, esas olarak aerobik solunumun bir sonucu olarak fizyolojik koşullar altında sürekli olarak üretilir. ROS ailesinin başlıca üyeleri arasında süperoksit anyonu (O 2͘͘͘͘•−), hidroksil radikalleri (•OH), çeşitli peroksitler (ROOR′), hidroperoksitler (ROOH) ve radikal olmayan hidrojen peroksit (H2 O2)12,13 gibi reaktif serbest radikaller bulunur. Son yıllarda, ROS'un temel süreçleri kontrol ederek hücrelerde önemli bir sinyal rolü oynadığı ortaya çıkmıştır. MGC'ler, transkripsiyonel nükleer faktör eritroid-2 ile ilişkili faktör 2'nin (Nrf2) aktivasyonu ve ardından patolojik koşullar altında aşırı ROS üretimini ortadan kaldırmak için antioksidan proteinlerin ekspresyonu ile güçlü bir antioksidan savunmaya sahiptir14,15,16. Hücreler, abartılı bir ROS üretimi veya ROS'u çıkarmak için kusurlu bir yetenek nedeniyle redoks dengesini kaybettiğinde, oksidatif stresin birikmesi, proteinlerde, lipitlerde ve DNA'da zararlı modifikasyonları teşvik ederek hücresel strese veya ölüme yol açar. Retinal antioksidan savunma sisteminin artması, ROP ve RD 17,18,19,20,21,22,23,24 gibi retinopatilerin çözülmesini ve önlenmesini iyileştirir. Bu nedenle, ROS üretiminin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi güçlü ve kullanışlı bir araçtır.

Hücrelerde ROS üretimini veya oksidatif stresi ölçmek için çeşitli yöntemler vardır. Bunlar arasında, 2′,7′-diklorofloresein diasetat (DCFH-DA) probu,25,26,27,28 numaralı hücrenin redoks durumunu doğrudan ölçmek için en yaygın kullanılan tekniklerden biridir. Bu prob lipofilik ve floresan değildir. Bu probun hücre zarı boyunca difüzyonu, iki ester bağındaki hücre içi esterazlar tarafından bölünmesine izin verir ve nispeten polar ve hücre zarı geçirimsiz bir ürün, 2′,7′-diklorofloresein (H2DCF) üretir. Bu floresan olmayan molekül hücre içinde birikir ve daha sonra ROS tarafından oksidasyon, yüksek floresan ürün DCF'yi verir. Probun oksidasyonu, akış sitometrisi veya konfokal mikroskopi (530 nm'de emisyon ve 485 nm'de uyarım) ile tespit edilebilen çoklu ROS tiplerinin (peroksinitrit, hidroksil radikalleri, nitrik oksit veya peroksitler) etkisinin ürünüdür. Bu tekniğin sınırlaması, süperoksit ve hidrojen peroksitinH2DCF25,29 ile güçlü bir şekilde reaksiyona girmemesidir. Bu yazıda, akış sitometrisi ile ROS'u ölçmek ve ölçmek için DCFH-DA probu kullanıyoruz. Bu nedenle, hücreleri floresan probu ile yüklemeden önce MGC'leri ROS indükleyici, A veya B ile uyararak ROS üretimini indüklüyoruz. Ek olarak, bir antioksidan bileşik kullanıyoruz. Son olarak, bu protokol kullanılarak elde edilen temsili ve güvenilir verileri gösteriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Arabellek bileşimleri için Tablo 1'e bakınız.

1. Hücre kültürü hazırlama

NOT: Burada tarif edilen, kendiliğinden ölümsüzleşmiş bir insan Müller glial hücre hattı olan MIO-M1 hücrelerinin kültür hazırlığıdır (Moorfield's / Institute of Ophthalmology - Müller 1). Her zaman uygun aseptik tekniği kullanın ve laminer bir akış başlığında çalışın.

  1. Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM) tam ortamını hazırlayın. 4.5 g / L D-glikoz ve 110 mg / L sodyum piruvat içeren DMEM'e,% 10 ısıl inaktive FBS, 10 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 2 mM L-glutamin ve 50 U / mL penisilin / streptomisin ekleyin. MIO-M1 hücrelerinin çözüleceği gün taze ortamı hazırlayın.
  2. Dondurulmuş MIO-M1 hücrelerini 1. günde çözün.
    1. Bunu yapmak için, FBS'de 5 x 105 MIO-M1 hücreleri içeren kriyovyu% 10 DMSO ile sıvı azot deposundan çıkarın ve hemen 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
      NOT: Her zaman bir yüz maskesi veya güvenlik gözlüğü takın, çünkü sıvı azotta depolanan kriyovyaller çözüldüğünde patlama riski taşır.
    2. MIO-M1 hücrelerini, şişede sadece küçük bir buz kalana kadar 37 ° C su banyosunda şişeyi ısıtarak hızlı bir şekilde (1 dakikadan daha kısa sürede) çözün.
    3. Şişenin dışını %70 etanol ile silin ve laminer bir davlumbaza aktarın.
    4. Çözülmüş hücreleri şişeden steril bir 15 mL tüpe aktarın ve ardından 6 mL önceden ısıtılmış tam DMEM orta damla damla ekleyin.
    5. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca yaklaşık 600 x g'da santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, berrak bir süpernatant ve tam bir pelet görselleştirilecektir. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı bir pipetle atın.
    6. Peleti nazikçe ayırın ve hücreleri 10 mL'lik tam DMEM ortamında yeniden askıya alın. Bu hücre süspansiyonunu 100 mm çapında bir doku kültürü plakasına aktarın ve plakayı yaklaşık 2 gün boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2'de inkübe edin.
  3. MIO-M1 hücreleri 4. günde %80-%90 oranında aktığında, aşağıdaki adımları uygulayın.
    1. Plakayı inkübatörden laminer bir akış başlığına aktarın. Süpernatantı dikkatlice çıkarın ve 5 mL steril ve önceden ısıtılmış PBS ile 2 kat yıkayın. PBS'yi aspire edin.
    2. 1 mL% 0.5 Tripsin-EDTA çözeltisi dağıtın ve hücreleri ayırmak için CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin.
    3. Tripsin etkisini inhibe etmek için DMEM ortamının 7 mL'sini ekleyin. Kümelenmiş tripsinize MGC'leri yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek ayrıştırın (P1000). Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
    4. 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj. Süper natantı atın. Hücre peletini 2 mL tam DMEM ortamında nazikçe yeniden askıya alın. Bu hücre süspansiyonunun 1 mL'sini, 9 mL önceden ısıtılmış tam DMEM ortamı içeren 100 mm'lik bir plakaya aktarın.
    5. İşlemi başka bir 100 mm plaka ile tekrarlayın. Plakayı% 5'lik bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de yaklaşık 1 gün boyunca inkübe edin.
  4. Her iki plaka% 80 -% 90 oranında akıcılaştığında (6. günde), plakayı laminer bir akış başlığına aktarın. 1.3 adımını izleyin. bir hücre peleti elde etmek için.
  5. Peletin nazikçe ayrışması ve hücreleri 5 mL'lik tam DMEM ortamında yeniden askıya alın. Aşağıdaki adımları izleyerek bir hemositometre (Neubauer odası) ve tripan mavisi çözeltisi kullanarak MIO-M1 hücrelerini sayın.
    1. Cam kapağı Neubauer odasının orta alanına yerleştirin. Odayı düz bir yüzeye yerleştirin (örneğin, bir masa veya tezgah).
    2. Hücrelerle eşit miktarda tripan mavisi lekesi karıştırın. Örneğin, 1: 2 seyreltme için 60 μL tripan mavisini 60 μL hücre ile karıştırın.
    3. Bu karışımdan, bir Neubauer odasına bir mikropipetle 10 μL yükleyin.
    4. Yüklü Neubauer odasını mikroskop aşamasına yerleştirin. Ardından, ışığı açın ve parlaklığı ayarlayın.
    5. Mikroskop aşamasını en uygun konuma getirin ve hücrelerin keskin bir görüntüsü elde edilene kadar odağı ayarlayın.
    6. Hemositometrenin köşesinde bulunan dört karenin (16'ya bölünmüş) içindeki hücreleri sayın (hacim: her biri 0.1mm3 ).
    7. Aşağıdaki denklemleri kullanarak hücre konsantrasyonunu hesaplayın.
      Konsantrasyon = (Hücre sayısı x 10.000)/Kare sayısı
      Konsantrasyon = (Hücre sayısı x 10.000)/4
      Konsantrasyon = Hücre sayısı x 2500
      NOT: Hücre seyreltmesi yapılırsa, elde edilen konsantrasyon seyreltmeden önce orijinal konsantrasyona dönüştürülmelidir.
      Konsantrasyon = (Hücre sayısı x 2500 x 2) = (Hücre sayısı x 5000 hücre/mL)
    8. Hücre süspansiyonunu tam DMEM ortamında 1 x 10 5 hücre/mL'ye ayarlayın ve bu hücre süspansiyonunun 2 mL'sini 6 delikli bir plakaya (2 x 105 hücre/kuyu) yerleştirin. Hücreleri homojen bir şekilde dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın. 6 delikli plakayı gece boyunca 37 °C'de %5 CO2 inkübatörde inkübe edin.

2. Tahlil koşulları ve kontrolleri

  1. Her deneme için aşağıdaki deneysel kontrolleri ekleyin:
    1. Otofloresan kontrolü (DCFH-DA probu olmayan hücreler, akış sitometresi parametrelerinin ayarlanması için kontrol).
    2. Bazal kontrol (uyarılmamış hücreler).
    3. Pozitif kontrol (bir ROS indükleyici, A veya B ile tedavi edilen hücreler).
    4. Negatif kontrol (antioksidan bileşik ile muamele edilmiş hücreler)
    5. Örnek (antioksidan bileşik ve ROS indükleyici, A veya B ile muamele edilmiş hücreler).

3. Tahlilin yapılması

NOT: Tahlil 7. günde yapılır. Her zaman uygun aseptik tekniği kullanın ve aksi belirtilmedikçe laminer bir akış başlığında çalışın.

  1. Düşük serum DMEM hazırlayın. % 0.5 ısıyla inaktive edilmiş FBS, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutamin ve 50 U / mL penisilin / streptomisin içeren 4.5 g / L D-glikoz ve 110 mg / L sodyum piruvat içeren DMEM takviyesi. MIO-M1'in tedavi edileceği gün taze ortamı hazırlayın.
  2. 6 delikli plakayı (%60-%70 birleşim) inkübatörden laminer bir akış davlumbazına aktarın. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri PBS ile 1x yıkayın. Kuyu başına 2 mL düşük serum DMEM ekleyin ve 6 delikli plakayı 37 ° C'de,% 5 CO 2'de2 saat boyunca inkübe edin. Bu, hücreleri aç bırakmak için yapılır.
  3. Serum açlıktan öldükten sonra, hücreleri 6 saat boyunca antioksidan bileşikle tedavi edin.
    1. Süpernatantı aspire edin ve seyreltilmiş stokun 2 mL'sini aşağıdaki koşullara ekleyin: negatif kontrol (antioksidan bileşik ile muamele edilmiş hücreler) ve numune (antioksidan bileşik ve ROS indükleyici, A veya B ile muamele edilmiş hücreler).
    2. 6 delikli plakayı 37 °C'de 6 saat boyunca inkübe edin,% 5 CO2.
      NOT: Başka bir antioksidan bileşik veya ROS inhibitörü kullanıyorsanız, uyaranlar için optimum zamanı ve konsantrasyonu standartlaştırın.
  4. 6 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri 30 dakika boyunca ROS indükleyici, A veya B ile tedavi edin.
    1. Uyaranları aşağıdaki koşullara ekleyin: pozitif kontrol (bir ROS indükleyici, A veya B ile muamele edilmiş hücreler) ve numune kuyucukları (antioksidan bileşik ve ROS indükleyici, A veya B ile muamele edilmiş hücreler).
      NOT: Stok çözeltilerini buz üzerinde tutun.
    2. 6 delikli plakayı 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin,% 5 CO2.
      NOT: Başka bir ROS indükleyicisi kullanıyorsanız, uyaranlar için optimum zamanı ve konsantrasyonu uygun şekilde standartlaştırın.
  5. Hücreleri DCFH-DA probu ile yükleyin.
    1. Süpernatantı aspire edin ve tüm uyaranları gidermek için 6 delikli plaka 3x'teki hücreleri PBS ile yıkayın.
    2. Laminer davlumbazın ışığını kapatın ve karanlıkta çalışın. 15 mL'lik bir tüpte fenol kırmızısı olmadan DMEM'de 5 μM DCFH-DA nihai konsantrasyonunu elde etmek için 5 mM DCFH-DA prob stok çözeltisinin 1:1000'lik bir seyreltmesini hazırlayın.
    3. Bir vorteks kullanarak hafifçe karıştırın ve bu çözeltinin 1 mL'sini aşağıdaki kuyucuklara ekleyin: bazal kontrol (uyarılmamış hücreler), pozitif kontrol (bir ROS indükleyici ile muamele edilmiş hücreler), negatif kontrol (antioksidan bileşik ile muamele edilmiş hücreler) ve numune kuyucukları (antioksidan bileşik ile muamele edilmiş hücreler ve ROS indükleyici, A veya B).
    4. Otofloresan kontrol hücrelerine fenol kırmızısı olmadan 1 mL DMEM ekleyin.
    5. 6 delikli plakayı 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin,% 5 CO2.
      NOT: Prob ışığa duyarlıdır. Kullanılmayan tüm prob solüsyonunu atın.

4. Akış sitometrisi için hücre hazırlığı

  1. 6 saat sonra, plakayı buz üzerinde tutun. Bu adımdan itibaren, uygun aseptik tekniğin kullanılması ve laminer bir akış davlumbazında çalışmak gerekli değildir.
  2. Hücreleri kuyucuk başına 2 mL soğuk PBS ile 3 kat yıkayın. Her bir kuyucuğa 0,5 mL soğuk ayırma tamponu ekleyin. P1000 pipet kullanarak yavaşça yukarı ve aşağı pipetle çekerek hücreleri toplayın.
  3. Bunları etiketli 1,5 mL tüplerde toplayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj yapın.
    NOT: Hücreleri toplarken, P1000 pipetini 0,4 mL'ye ayarlayarak kabarcık oluşumunu önleyin. Bu adımdan itibaren hızlı çalışın.
  4. Santrifüjleme sona erdiğinde, buz üzerine hücrelerle etiketli 1,5 mL tüpler koyun. Süpernatantı dikkatlice atın ve hücre peletini hafifçe dokunarak ayırın.
  5. Hücreleri yıkamak için etiketli her 1,5 mL tüpe 1 mL FACS tamponu ekleyin. Gerekirse, hücre peletinin tamamen ayrışması için en düşük yoğunlukta bir vorteks kullanın. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj yapın. Bu adımları 2 kat daha tekrarlayın. (Toplamda üç yıkama yapın).
  6. Son yıkama sona erdiğinde, tüm deneysel koşullar için 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüpleri (akış sitometri tüpleri) etiketleyin (bkz. adım 2.).
  7. Santrifüjleme sona erdiğinde, hücre peletlerini 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın. Bir vorteks kullanarak her 1,5 mL tüpteki peleti nazikçe ayırın. Etiketli 5 mL yuvarlak tabanlı tüplere aktarın. Tüpleri akış sitometresinde analiz edilene kadar buz üzerinde tutun.

5. Bir akış sitometresinde veri toplama

  1. Akış sitometrisi yazılımını kullanarak yeni bir deney oluşturun. Bunu yapmak için, Menü çubuğunda Deneme'ye gidin ve Yeni Deneme'yi ( Ctrl +E) tıklayın.
  2. Ayrıca, Menü çubuğunda Görünüm'e gidin ve aşağıdaki seçenekleri tıklatın: Araç Çubuğu, Durum çubuğu, Tarayıcı, Sitometre, Denetçi, Çalışma Sayfası, Edinme Panosu ve Biexponential Editor bu pencereleri çalışma alanında görmek için.
  3. Yazılımın sol tarafında, Specimen_001 tıklayın. Bu, tüplerin bir listesini açacaktır (Tube_001, Tube_002, vb.). Tüpleri kontroller ve farklı deney koşulları için etiketlemek üzere Tube_001, Tube_002 vb. çift tıklatın ve bunları yeniden adlandırın (bkz. adım 2.).
  4. Deneyin Sitometre ayarlarından ilk tüpte analiz edilecek kanalları / parametreleri (FSC, SSC, FITC ve APC veya kadranı görmek için başka bir florokrom) seçin.
  5. Tüpü seçmek için Geçerli Tüp İşaretçisi simgesine tıkladığınızda simge yeşile döner. "Otofloresan kontrol" tüpünü aspiratör koluna yerleştirin ve tabanı dikkatlice sadece sola doğru hareket ettirin.
    1. "Otomatik floresan denetimi" örneğini çalıştırmak için Edinme Panosu penceresine gidin ve Veri Al'ı tıklatın. FSC (x ekseninde) ve SSC (y ekseninde) için bir nokta grafiği açın.
    2. Olayların grafikte görünmesini sağlamak için ileri ve yan saçılma voltajını hızlı bir şekilde ayarlayın. Edinme Panosu penceresinde Almayı Durdur'u tıklatın. Bu deneyde, aşağıdaki voltaj ayarları kullanılmıştır: FSC - 200 V, SSC - 423 V.
  6. FITC voltajını ayarlamak için "pozitif kontrolü (bir ROS indükleyici, A veya B ile muamele edilmiş hücreler)" çalıştırın. Voltajı, tüm olaylar FITC'nin histogramında görünecek şekilde ayarlayın. Bu durumda, 280 V'luk bir voltaj kullanın. Edinme Panosu penceresinde, Almayı Durdur'u tıklatın.
  7. "Otofloresan kontrol" tüpünü tekrar aspiratör koluna yerleştirin. Edinme Panosu penceresinde, Veri Al'a ve ardından Verileri Kaydet'e tıklayın ve istediğiniz durdurma koşullarını (örneğin, 50.000 olay) seçin. Ölü hücreler ve enkaz hariç, ilgilenilen hücrelerin etrafına bir kapı çizin.
    NOT: Bunlar, ana hücre popülasyonundan çok daha küçük olaylar olarak gözlemlenir ve grafiğin sol alt köşesinde görünür.
  8. Edinme sona erdiğinde, tüpü aspiratör kolundan çıkarın. Ekipman kendini yıkayacaktır. Edinme Panosu penceresinde, Sonraki Tüp'ü tıklatın ve Bazal denetimini (uyarılmamış hücreler) çalıştırın. Veri Al'ı ve ardından Verileri Kaydet'i tıklatın.
    1. İlk kapıdan (ölü hücreleri ve kalıntıları hariç tutan kapı), APC'ye (y ekseninde) karşı FITC'nin (x ekseninde) başka bir nokta grafiğini oluşturun. Bir kadran kapısı çizin ve APC grafiğine karşı FITC'nin sol alt çeyreğindeki olayları görselleştirmek için koordinatları ayarlayın.
  9. Sonraki örnekleri kaydetmek için tüpü çıkarın ve Veri Al > Kayıt Verileri > Sonraki tüpü tıklatın.
    NOT: Burada kullanılan akış sitometresi ( bkz. Malzeme Tablosu) tüp başına maksimum 1 x 106 olay kaydeder.
  10. Tüm tüplerin kaydı sona erdiğinde, verileri D diskine aktarın. Bunu yapmak için Dosya > FCS dosyalarını dışa > 3.0 veya 3.1 sürümünü seç'i >.
    NOT: Bir yazılım kullanılarak veri toplama (bkz. Malzeme Tablosu) bu protokolde ayrıntılı olarak açıklanmasına rağmen, başka herhangi bir akış sitometri yazılımı kullanılabilir. Edinme parametreleri (FSC, SSC ve FITC), sonuçları elde etmek için aynı şekilde ayarlanabilir.

6. Elde edilen verilerin analizi

  1. Yazılımı açın ve Örnek Ekle eylem düğmesini kullanarak örnekleri ekleyin; görev çubuğunda veya Gezinti bandında bulunur.
    1. Add Samples (Örnek Ekle) seçeneğini tıklayın.
    2. Dosya tarayıcısını kullanarak Deneysel klasörüne gidin.
    3. Deneysel klasörünü seçin ve Seç'i tıklayın.
      NOT: Örnek dosyalar, çalışma alanına "Tüm Örnekler" grubunun bir parçası olarak yüklenir.
  2. Çalışma alanındaki ilk örneğe çift tıklayın: Otomatik Floresan Denetimi.
    NOT: Bu eylem, olayları ileri dağılım (x ekseninde FSC-A) ve yan dağılım (y ekseninde SSC-A) parametreleri boyunca çizen bir Grafik penceresi açar.
  3. Ölü hücreler ve döküntüler hariç, ilgilenilen hücreleri izole etmek için bir çokgen kapısı çizin.
    1. Poligon Kapısı aracını tıklatın.
    2. Poligon kapısını oluşturmak için grafiğin içine tıklayın. Gerektiği kadar taraf yapın.
    3. Poligonu kapatmak ve istenen kapıyı oluşturmak için son noktaya çift tıklayın.
    4. Kapı için "MIO-M1 hücreleri" gibi bir ad girin ve Tamam tuşuna basın.
      NOT: Ölü hücreler ve enkaz olmadan yalnızca MIO-M1 olaylarını görüntüleyen yeni bir grafik grafiği penceresi görünür.
    5. Analiz etmek için tüm numunelerle tekrarlayın.
  4. Grafiği histogram olarak değiştirin. Bunu yapmak için, X ekseni parametre etiketini tıklatın ve FITC-A'yı seçin. Y ekseni parametre etiketini tıklatın ve Histogram'ı seçin. Bu, grafiği tek boyutlu histograma dönüştürür.
  5. İstatistik Ekle Penceresini kullanarak İstatistik Ekleyin.
    1. Histogram grafiğin altında, İstatistik Ekle'yi tıklayın. Program yeni bir istatistik penceresi açacaktır.
    2. Yeni pencerenin solunda Geometrik Ortalama istatistiklerini seçin.
    3. Popülasyon MIO-M 1 hücrelerini seçin.
    4. Kullanılabilir parametreler listesinden FIT-C'yi seçin.
    5. Bunları analize uygulamak için Ekle düğmesini tıklatın.
      NOT: Bu, örnek geçit ağacında yeni "geometrik ortalama: FITC" istatistiklerini oluşturur ve değerleri çalışma alanınızda görüntülenir.
  6. Bu geometrik ortalama değerleri bir istatistik programına koyun ve analiz edin.
  7. Düzen Düzenleyicisi'ni açmak için L simgesine tıklayın; Bu simge, çalışma alanındaki Menü sekmesindedir. Çalışma Alanı penceresini ve Düzen Düzenleyicisi'ni yan yana konumlandırın.
    NOT: Düzen Düzenleyicisi, basit bir grafik raporunda birden çok grafik grafiğini ve istatistiği görüntülemek için araçlar içeren ayrı bir çalışma alanı penceresidir. Bu, diğerlerinin yanı sıra PDF veya JPG gibi tercih ettiğiniz uzantı dosyasıyla dışa aktarılabilir.
    1. Çalışma Alanı penceresindeki bir örneğin geçit ağacından, MIO-M 1 hücre popülasyonunu Düzen Düzenleyicisi'ne sürükleyin.
    2. Kapıdaki olayları içeren bir histogram grafiğin Mizanpaj Düzenleyicisi'nde görüntülendiğinden emin olun. Ek temel bilgiler aşağıdaki metin kutusunda ayrıntılı olarak açıklanacaktır.
    3. Aynı grafikte karşılaştırmak için tüm örnekleri sürükleyin. Program bunlarla örtüşecektir.
    4. Histogram grafiğini sağ tıklatın ve Özellikler'i seçin. Program yeni bir Grafik Tanımı penceresi açacaktır. Bu pencerede dört sekme vardır (Açıklama Ekle, Yazı Tipleri, Gösterge ve Belirt). Belirt sekmesini tıklatın ve y eksenini Otomatik yerine Mod olarak değiştirin. Apply'ı (Uygula) tıklayın.
    5. Örneği sağ tıklatın ve grafiği kişiselleştirmek için Renklendirme, Çizgi Stili, Çizgi Ağırlığı vb. Seçeneklerini değiştirin.
    6. Görüntüyü dışa aktarmak için Dosya sekmesini tıklatın ve hemen ardından Belge bandında Görüntüyü Kaydet'i seçin. Tercih edilen görüntü dosyası türünü seçin (ör. PDF).
      NOT: Bir kaydetme konumu seçmenizi isteyen bir kaydet iletişim kutusu açılır. Kaydet'i tıklayın.
  8. Analizi çalışma alanı (.wsp) Dosyası olarak kaydedin.
    1. Sol üst köşede, Sitometri Analizi simgesine tıklayın ve Farklı Kaydet'i seçin.
    2. Belgeyi veri ve çözümlemeyle kaydetmek için Çalışma Alanı Olarak Kaydet (WSP) seçeneğini belirleyin.
    3. Çalışma alanı dosyası için bir ad girin.
    4. Kaydet'i tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol bölümünde açıklandığı gibi, ROS indükleyici, A veya B ile uyarılan MIO-M1 hücrelerinden floresan probu DCFH-DA ile ROS üretiminin akış sitometrisi tespitini gösteren temsili ve kantitatif verileri gösterdik. Beklendiği gibi, uyarılmamış hücrelerde otofloresan seviyelerinin üzerindeki FITC floresansında değişiklikler gözlemledik (Şekil 1A, "bazal kontrol" ile "otofloresan kontrolü" karşılaştırması, nokta grafikleri grafiği). Bu, MIO-M1 hücrelerinde bazal bir ROS üretimi nedeniyle mey...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanser, inflamatuar hastalıklar, iskemi / reperfüzyon, iskemik kalp hastalığı, diyabet ve retinopatiler gibi çeşitli patolojik durumlar ve ayrıca yaşlanma gibi fizyolojik durumlar ROS aşırı üretimine yol açar 6,7,8,9,10,11. Bu nedenle, ROS'un modülasyonunda yer alan yolun tespiti, ölçülmesi ve anlaşılması birçok hastalık için...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, CIBICI'den María Pilar Crespo ve Paula Alejandra Abadie'ye (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Arjantin) akış sitometrisinde yardım için ve Gabriela Furlan ve Noelia Maldonado'ya hücre kültürü yardımı için teşekkür eder. Ayrıca video prodüksiyonu ve düzenlemesi için Victor Diaz'a (FCQ Kurumsal İletişim Yanlısı Sekreteri) teşekkür ederiz.

Bu makale Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) ve Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (hepsi M.C.S.) tarafından sağlanan hibelerle finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2′,7′-DCFH-DASigma35845-1G
4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES)Gibco by life technologies15630-080
BD FACSCanto II akış sitometresiBD BiosciencesFACSCanto
BD FACSDiva yazılımıBD Biosciences
Hücre Kültürü Kapları 100x20 mmCell Star- Greiner Bio-One664 160
SantrifüjTermoSorvall legend micro 17 R
Santrifüj Tüpleri (15 ml)BIOFILCFT011150
Santrifüj Tüpleri (50 ml)BIOFILCFT011500
CryovialCRYO. S - Greiner Bio-One126263
Dimetil SülfoksitSigma-AldrichW387520-1KG
Disodyum-hidrojen-fosfat heptahidratMerck106575
DMEM fenol kırmızısıolmadan Gibco by life technologies31053-028
Dulbecco' s değiştirilmiş Kartal' s orta (DMEM)Gibco by life technologies11995065
Etilendiamin Tetraasetik Asit (EDTA), Disodyum Tuzu, DihidratMerck324503
Fetal Sığır SerumuInternegocios
FlowJo v10 YazılımıBD Biosciences
GlikozMerck108337
hemositometre, Neubauer odasıBOECO, Almanya
Laminer akış başlığıESCOAC2-6E8
L-glutamin (GlutaMAX)Gibco by life technologiesA12860-01
MitoSOX RedInvitrogen  M36008
Penisilin / StreptomisinGibco, yaşam teknolojileri tarafından15140-122
Potasyum KlorürMerck104936
Potasyum-dihidrojen fosfatMerck4878
Yuvarlak polistiren tüpler 5 ml (akış sitometri tüpleri)Falcon - CorningBD-352008
Sodyum AzidMerck822335
Sodyum KlorürMerck106404
Sodyum HidroksitMerck106462
SPINWIN Mikro Santrifüj Tüpü 1.5 mlTarson500010-N
Doku Kültürü Plakası 6 kuyuluBIOFILTCP011006
Tripan MaviMerck111732
Tripsin-EDTA %0,5 10XGibco by life technologies15400-054
Vorteks KarıştırıcıLabnet Uluslararası, Inc.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
  2. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  3. Subirada, P. V., et al. A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death. European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).
  4. Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. Müller cells and diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 93-100 (2017).
  5. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).
  6. Kamalden, T. A., et al. Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress. Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).
  7. Feng, Y., et al. Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia. Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).
  8. Rojas, M., et al. NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence. Antioxidants. 6 (2), 43(2017).
  9. Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy. Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).
  10. Wilkinson-Berka, J. L., et al. NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy. Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).
  11. Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity. JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).
  12. Sies, H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine. Redox Biology. 4, 180-183 (2015).
  13. Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release. Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).
  14. Navneet, S., et al. Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells. Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).
  15. Navneet, S., et al. Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2. Redox Biology. 24, 101199(2019).
  16. Wang, J., et al. Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger. Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).
  17. Nakamura, S., et al. Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).
  18. Xu, Z., et al. NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice. Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).
  19. Chen, W. J., et al. Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light. Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).
  20. Wei, Y., et al. Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).
  21. Wei, Y., et al. Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury. Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).
  22. Wei, Y., et al. Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).
  23. Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy. Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).
  24. Xu, Z., et al. Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion. Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).
  25. Armstrong, D. Advanced protocols in oxidative stress III. Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).
  26. Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking. Journal of Visualized Experiments. (145), e59167(2019).
  27. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), e3357(2011).
  28. Halliwell, B., Whiteman, M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean. British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).
  29. Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).
  30. Fernandes, D. C. Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).
  31. Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
  32. Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV. Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Oksidatif StresAntioksidan SavunmaRedoks DengesiFloresans HistogramH cresel HomeostazROS Kantifikasyonu

İlgili makaleler